Anda di halaman 1dari 14

PERCOBAAN III

JALUR ASETAT-MEVALONAT
I.

II.

Tujuan
1. Mahasiswa diharapkan mampu memahami prinsip pemisahan dan identifikasi
senyawa dengan metode Kromatografi Lapis Tipis.
2. Mahasiswa diharapkan mampu memisahkan dan mengidentifikasi golongan
senyawa-senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan dari jalur asetatmevalonat dengan teknik Kromatografi Lapis Tipis.
Alat dan bahan
1. Alat
a. Lempeng KLT
b. Bejana KLT
c. Sinar UV 254nm dan 366nm
d. Kompor listrik
e. Pipa kapiler
f. Alat penyemprot
g. Pinset
2. Bahan
a. Larutan pembanding:
Stigmasterol
Campuran timol-menthol
b. Larutan uji:
Rhizoma pacing (Costus specisous)
Daun mint (Mentha piperita)
Minyak kayu putih (Melaleuca leucadendron)
Oregano
c. Fase gerak:
Steroid: heksana:etil asetat (4:1)
Terpenoid: toluene:etil asetat (93:7)
d. Fase diam: silica gel F254
e. Anisaldehid-asam sulfat
f. Vanillin-asam sulfat

III.

CARA KERJA
Disiapkan larutan uji dan larutan pembanding (oleh laboran)

Dilakukan penjenuhan bejana/chamber berisi fase gerak (oleh laboran)


Prosedur KLT:

Ditotolkan sebanyak 4 kali penotolan larutan uji dan larutan pembanding


dengan pipa kapiler pada lempeng KLT (jarak penotolan 1.0 cm dari tepi
bawah lempeng)
Dibiarkan sampai kering
Ditetapkan jarak rambat 5 cm dari titik penotolan dan ditandai dengan pensil
pada tepi atas
Dimasukkan lempeng KLT pada bejana yang sudah dijenuhi fase gerak
dengan hati-hati
Disandarkan lempeng KLT pada dinding bejana hingga bagian bawah
lempeng tercelup fase gerak
Ditutup bejana dengan rapat dan dipastikan bahwa totolan tidak tercelup fase
gerak dan fase gerak bergerak keatas secara bersama-sama (membentuk garis
horizontal lurus)
Dibiarkan fase gerak bergerak keatas pada permukaan lempeng hingga
mencapai batas jarak rambat yang sudah ditetapkan
Dikeluarkan lempeng dan dikeringkan di udara
Diamati bercak pada sinar tampak, sinar UV gelombang pendek (254nm), dan
sinar UV gelombang panjang (366nm)
Didokumentasikan dan dihitung harga Rf dari bercak-bercak senyawa hasil
pemisahan dan dibandingkan dengan senyawa pembanding
Plat KLT disemprot dengan pereaksi anisaldehid-asam sulfat (untuk sampel
steroid) dan vanillin-asam sulfat (untuk sampel terpenoid)
Dipanaskan sebentar di atas kompor listrik hingg anampak bercak pada plat
KLT
Diamati bercak pada sinar tampak dan sinar UV gelombang panjang (366nm)
Didokumentasikan dan dihitung harga Rf dari bercak-bercak senyawa hasil
pemisahan dan dibandingkan dengan senyawa pembanding.
IV.

HASIL PERCOBAAN
1. Sampel
a. Oregano
b. Daun mint ( Mentha piperita )

c. Minyak kayu putih ( Melaleuca leucadendron )


Fase diam
: Silica gel F 254
Fase gerak
: Toluen Etil asetat ( 93:7 v/v)
Penotolan sampel
: 4 kali
Jarak elusi
: 5 cm
Deteksi
: Vanilin Asam sulfat
a. Sebelum disemprot
1) Sinar tampak
P

2) UV 254

S1

S2

S3

S1

S2

S3

3) UV 366
P

S1

S2

S3

b. Setelah disemprot
1) Sinar tampak
P

2) UV 366

S1

S2

S3

S1

S2

S3

c. Tabel Rf

No

P
a

0,4

Tampak
S1
S2
0,28

b
c

0,8
8
0,4
6
0,3

Sebelum disemprot
UV 254
S3
P
S1 S2 S3
0,0
6

0,4

d
e

0,4
6
0,2
8
0,2
4
0,2
2
0,1
2

0,8
8
0,4
6
0,3

0,3
2
0,2
6
0,0
6

0,3
2
0,1
6

f
g

N
o

0,4

Setelah disemprot
Tampak
UV 366
S1
S2 S3
P
S1 S2
0,42

0,28

0.24

0.12

e
f
g

0,8
8
0,7
6
0,5
4
0,3
0,1
2

0,6
4
0,4
8
0,3
2
0,0
6

0,4

0,6

0,0
8

0,4
2
0,4
2
0,2
8
0,2
4
0,1
2

0,8
8
0,7
6
0,4
6
0,5
4
0,3
0,1
2

S3
0,6
8
0,5
8
0,5
6
0,3
2

UV 366
S1 S2
0,4
6
0,2
8
0,2
4
0,2
2
0,1
2

0,4
6
0,3
0,4
6
0,4
4

S3

Analisis:
Untuk menganalisa senyawa pada suatu sampel, perlu diamati harga Rf dan
warna bercak sampel dan pembanding. Sampel dikatakan mengandung senyawa
pembanding apabila harga Rf dan warna bercaknya sama.
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan didapatkan hasil bahwa ketiga
sampel tidak menunjukkan warna dan Rf yang sama dengan senyawa
pembanding, sehingga dapat dikatakan bahwa ketiga sampel pada plat 1 tidak
mengandung senyawa pembanding thymol-menthol.
2. Sampel
Fase diam
Fase gerak
Penotolan sampel
Jarak elusi
Deteksi
a. Sebelum disemprot
1) Sinar tampak
P

: Rhizoma pacing ( Costus specisous )


: Silica gel F254
: n-heksana Etil asetat ( 4:1 v/v)
: 4 kali penotolan dengan pipa kapiler
: 5 cm
: Anisaldehid Asam sulfat

2) UV 254
S

AA

222

2) UV 366
P

Setelah disemprot

b. Setelah disemprot
1) Sinar tampak
P

2) UV 366
P

c. Tabel Rf

No
a
b
c
d
e
f
g

Sebelum disemprot
Tampak UV 254
UV 366
P
S
P
S
P
S
0,9
0,9 0,7 0,94
4
4
8
0,5
0,5 0,5 0,74
6
6
0,4
0,4 0,4 0,56
2
2
6
0,2
0,2 0,3 0,42
0,2

Setelah disemprot
Tampak
UV 366
P
S
P
S
0,7 0,74 0,7 0,7
4
0,66 0,4 0,6
2
6
0,56 0,3 0,5
6
0,4
0,2 0,4
4
2
0,2
0,2

Analisis:
Untuk menganalisa senyawa pada suatu sampel, perlu diamati harga Rf dan
warna bercak sampel dan pembanding. Sampel dikatakan mengandung senyawa
pembanding apabila harga Rf dan warna bercaknya sama.
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan didapatkan hasil bahwa sampel
mengandung stigmasterol dibuktikan dengan harga Rf yang sama yaitu 0,42 dan
berwarna biru yang terlihat setelah penyemprotan menggunakan anisaldehid-asam
sulfat dan dilihat dibawah sinar UV 366 nm.

Foto hasil pengamatan:


1. Plat 1 (Terpenoid)
a. Sebelum disemprot

UV 254 nm
b. Setelah disemprot

UV 366 nm

Sinar tampak

UV 366 nm

2. Plat 2 (Steroid)
a. Sebelum disemprot

UV 254 nm
b. Setelah disemprot

Sinar tampak

V.

UV 366 nm

UV 366 nm

PEMBAHASAN
Percobaan ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa senyawa yang
dihasilkan dari jalur asetat-mevalonat dari suatu produk alam menggunakan teknik
Kromatografi Lapis Tipis.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah prosedur analisis yang teknik
pengerjaannya cukup sederhana, cepat, dan murah sehingga memberikan ahli kimia
jawaban yang cepat tentang berapa banyak komponen dalam suatu campuran sampel
yang dianalisis. KLT juga dapat digunakan untuk mendukung identitas senyawa
dalam campuran ketika Rf senyawa dibandingkan dengan Rf senyawa yang dikenal.
Sebuah plat KLT biasanya dibuat dari lembaran kaca, logam, atau plastic dengan

ukuran tertentu dan permukaan yang rata yang dilapisi dengan fase diam berupa
lapisan tipis adsorben padat (biasanya silica atau alumina).
Pada Kromatografi Lapis Tipis, sampel yang akan dianalisis dilarutkan pada
pelarut yang sesuai kemudian sampel dan pembanding ditotolkan dalam bentuk titik
atau pita pada permukaan fase diam. Setelah penotolan, sebaiknya plat diamati di
bawah sinar UV untuk mengetahui apakah sampel dan pembanding yang ditotolkan
sudah dapat diampati. Plat KLT kemudian dicelupkan pada fase gerak di dalam
chamber tertutup. Perlu diperhatikan agar totolan sampel tidak ikut tercelup dalam
fase gerak karena hal ini akan menyebabkan sampel dan pembanding dapat terlarut
pada fase gerak dan tidak terjadi pemisahan. Fase gerak atau eluen perlahan-lahan
akan bergerak ke atas plat KLT mengikuti gaya kapiler hingga batas elusi yang telah
ditentukan. Prinsip pemisahan komponen pada teknik KLT didasarkan atas perbedaan
kekuatan interaksi masing-masing komponen dengan fase gerak dan fase diam. Suatu
komponen yang kepolarannya lebih sama dengan fase diam akan berinteraksi lebih
kuat dengan fase diam sehingga memiliki kecepatan migrasi yang lebih lambat.
Akibatnya, jarak migrasi senyawa tersebut lebih pendek. Jika kepolaran komponen
lebih sama dengan fase gerak, komponen tersebut akan lebih kuat interaksinya dengan
fase gerak sehingga lebih mudah terbawa dan menghasilkan kecepatan migrasi yang
lebih cepat serta jarak migrasi yang lebih panjang. Ketika fase gerak telah mencapai
batas yang ditentukan, plat diangkat dari ruang elusidasi kemudian diangin-anginkan
sebentar di udara. Senyawa hasil identifikasi divisualisasikan dengan detector yang
sesuai (UV, sinar tampak, pereaksi kimia). Jika senyawa merupakan senyawa yang
berwarna, visualisasi cukup dilakukan dengan sinar tampak. Namun kebanyakan
senyawa organik yang diidentifikasi merupakan senyawa tidak berwarna, sehingga
perlu dilakukan visualisasi lebih lanjut dengan menggunakan lampu UV baik pada
gelombang pendek maupun gelombang panjang.
Pengamatan di bawah sinar UV gelombang pendek (254 nm) dan gelombang
panjang (366 nm) dimaksudkan agar dapat menampakan senyawa sebagai bercak
yang berwarna gelap (UV 254 nm) dan untuk menampakkan bercak yang
berfluorosensi sehingga pada pengamatan terlihat bercak berpendar (UV 366 nm).
Keuntungan menggunakan sinar UV untuk memvisualisasikan bercak adalah sinar
UV tidak merusak senyawa yang dideteksi. Cara pemvisualisasian dengan
penyemprotan menggunakan asam sulfat dan pemanasan dilakukan untuk
mengoksidasi senyawa-senyawa organik yang tampak sebagai bercak hitam
kecoklatan. Adanya warna hitam kecoklatan menunjukkan adanya senyawa organik
pada sampel.
Dalam teknik KLT, perbandingan jarak rambat bercak senyawa sampel
terhadap jarak rambat fase gerak diukur dari titik penotolan dinyatakan sebagai Rf.
Identifikasi senyawa diamati dengan menghitung dan membandingkan harga Rf
antara senyawa pembanding dan senyawa sampel. Jika harga Rf senyawa sampel
sama dengan harga Rf senyawa pembanding, artinya senyawa sampel dan
pembanding memiliki kepolaran yang mirip, namun bukan berarti bahwa sampel
mengandung senyawa pembanding. Sampel dikatakan mengandung senyawa

pembanding apabila baik harga Rf maupun warna bercaknya sama. Harga Rf bukan
merupakan konstanta fisik karena akan berubah sesuai dengan kondisi percobaan.
Pada percobaan ini, senyawa yang digunakan sebagai sampel adalah
golongan senyawa jalur metabolit asam mevalonat yaitu Oregano, Daun mint (Mentha
piperita), Minyak kayu putih (Melaleuca leucadendron) dan Rhizoma pacing (Costus
specisous). Untuk senyawa pembanding digunakan campuran thymol-menthol dan
stigmasterol. Pembanding thymol-menthol digunakan untuk sampel Oregano, Daun
mint (Mentha piperita), dan Minyak kayu putih (Melaleuca leucadendron) sedangkan
stigmasterol adalah pembanding untuk Rhizoma pacing (Costus specisous).
Metode pemisahan yang dapat digunakan pada teknik KLT diantaranya adalah
metode pemisahan secara adsorpsi dan secara partisi. Pada metode pemisahan secara
partisi digunakan campuran fase gerak yang salah satunya adalah air. Air akan
melapisi permukaan fase diam, sehingga senyawa pada sampel akan terpartisi pada
fase gerak maupun fase diam. Namun metode yang digunakan pada percobaan ini
adalah metode pemisahan secara adsorpsi di mana senyawa pada sampel akan
teradsorpsi oleh fase diam yaitu silica gel F 254.
Praktikan diberi dua buah plat KLT yang dilapisi silica gel F 254 sebagai fase
diam. Kedua plat telah diberi tanda 1 cm dari dasar plat sebagai titik awal penotolan.
Sebelum dilakukan penotolan larutan pembanding dan sampel, diberi tanda pada titik
yang berjarak 5 cm dari titik awal penotolan sebagai titik batas elusi. Setelah itu
dilakukan penotolan senyawa sampel dan pembanding pada plat KLT menggunakan
pipa kapiler. Penotolan dilakukan sebanyak 4 kali dan tiap kali penotolan harus
ditunggu kering sebelum dilakukan penotolan selanjutnya. Penotolan yang dilakukan
harus menghasilkan titik yang sekecil mungkin agar bercak yang terjadi tidak melebar
sehingga tidak mengurangi derajat pemisahan. Setelah penotolan, plat dimasukkan ke
dalam wadah tertutup berisi fase gerak. Pada plat dengan sampel Oregano, Daun mint
(Mentha piperita), dan Minyak kayu putih (Melaleuca leucadendron), fase gerak
yang digunakan adalah Toluen Etil asetat ( 93:7 v/v). Sedangkan untuk plat berisi
sampel Rhizoma pacing (Costus specisous), fase gerak yang digunakan adalah nheksana Etil asetat (4:1 v/v). Memasukkan plat KLT ke dalam fase gerak harus
dilakukan dengan segera dan hati-hati agar fase gerak tidak menguap. Setelah itu
dibiarkan agar fase gerak bergerak ke atas plat hingga batas yang ditentukan.
Setelah fase gerak mencapai batas elusi, plat KLT segera diambil dan
dikeringkan di udara. Plat KLT kemudian diamati dengan sinar tampak, sinar UV 254
nm dan UV 366 nm. Setelah dilakukan pengamatan dengan sinar tampak, didapatkan
hasil bahwa kedua plat KLT tidak terlalu menunjukkan bercak yang jelas, bahkan
bercak senyawa pembanding tidak terlihat. Sedangkan di bawah sinar UV 254 nm
pada plat 1 (Oregano, Daun mint (Mentha piperita), Minyak kayu putih (Melaleuca
leucadendron), dan thymol-menthol), bercak senyawapembanding mulai terlihat dan
bercak senyawa sampel terlihat lebih banyak dan jelas. Sedangkan pada plat 2
(Rhizoma pacing (Costus specisous) dan stigmasterol) masih belum terlihat bercak
senyawa pembanding. Pada pengamatan di bawah sinar UV 366 nm, plat 1 hanya
terlihat bercak pada sampel 1 dan 2, sampel 4 sedangkan bercak senyawa pembanding

tidak terlihat. Sedangkan untuk plat 2, terlihat bercak yang cukup banyak pada
senyawa sampel dan pembanding.
Karena belum semua sampel dan pembanding terlihat bercaknya, dilakukan
visualisasi dengan jalan penyemprotan plat menggunakan pereaksi vanilinasam
sulfat untuk plat 1 dan pereaksi anisaldehidasam sulfat untuk plat 2. Setelah
penyemprotan dilakukan pemanasan yang merata pada kedua plat. Pada plat 1,
setelah penyemprotan dan pemanasan, lebih banyak bercak yang teramati dengan
sinar tampak maupun sinar UV 366 nm. Pada plat 2, setelah penyemprotan dan
pemanasan, lebih banyak bercak senyawa sampel yang teramati dengan sinar tampak
maupun sinar UV 366 nm dan mulai terlihat bercak senyawa pembanding.
Setelah pemvisualisasian bercak selesai, dilakukan penghitungan Rf agar
identifikasi dapat dilakukan. Untuk menganalisa senyawa pada suatu sampel, perlu
diamati harga Rf dan warna bercak sampel dan pembanding. Sampel dikatakan
mengandung senyawa pembanding apabila harga Rf dan warna bercaknya sama.
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan didapatkan hasil bahwa pada plat
1 ketiga sampel tidak menunjukkan harga Rf dan warna bercak yang sama dengan
senyawa pembanding, sehingga dapat dikatakan bahwa ketiga sampel tidak
mengandung senyawa pembanding thymol-menthol. Sedangkan pada plat 2
didapatkan hasil bahwa sampel mengandung stigmasterol dibuktikan dengan harga Rf
yang sama yaitu 0,42 dan bercak berwarna biru yang terlihat setelah penyemprotan
menggunakan anisaldehid-asam sulfat dan dilihat dibawah sinar UV 366 nm.
Hasil tersebut merupakan analisa awal sesuai pengamatan. Setelah dicocokkan
dengan literatur, seharusnya pada plat 1 sampel oregano (sampel 1) dan daun mint
(sampel 2) mengandung senyawa pembanding yaitu campuran thymolmenthol
karena kandungan utama dari Oregano adalah Thymol dan Carvacrol sedangkan
kandungan dari daun mint adalah menthol, menthone, 1,8-cineole, methyl acetate,
methofuran, isomenthone, limonene, b-pinene, a-pinene, germacrene-d, transsabinene hydrate dan pulegone. Hal ini menunjukkan bahwa hasil percobaan tidak
sesuai teori. Sedangkan sampel minyak kayu putih berdasarkan literature memiliki
kandungan berupa a-pinene, b-pinene, myrcene, a-terpinene, limonene, 1,8-cineole, yterpinene, p-cymene, terpinolene, linalool, terpinen-4-ol dan a-terpineol. Hal ini
menunjukkan bahwa hasil percobaan sampel minyak kayu putih sesuai teori.
Ketidaksesuaian hasil percobaan pada sampel oregano dan daun mint dapat
disebabkan karena pengamatan yang kurang teliti, penotolan sampel yang kurang
tepat ataupun karena penyemprotan dan pemanasan yang kurang sempurna.
Sampel rhizoma pacing pada plat 2 berdasarkan hasil percobaan tmengandung
senyawa pembanding yaitu stigmasterol karena teramati harga Rf dan warna
bercaknya sama. Rf yang sama yaitu 0,42 dan berwarna biru yang terlihat setelah
penyemprotan menggunakan anisaldehid-asam sulfat dan dilihat dibawah sinar UV
366 nm. Hal ini tidak sesuai teori. Rhizoma Pacing (Costus speciosus) berdasarkan
literatur memiliki kandungan berupa beta-sitosterol, diosgenin, diosgenon,
sikloartanol, asam oktacosanoat, asam tetracosanoat, asam suksinat, serta daucosterin.
Meskipun Rhizoma Pacing tidak mengandung stigma sterol tetapi mengandung
sitosterol, diosgenin, dan kandungan kandungan senyawa lain yang termasuk dalam

golongan steroid. Dengan kata lain Rhizoma Pacing termasuk ke dalam golongan
steroid. (Zhongguo Z&Yao Za Zhi, 2002)
Kayu putih (Melaleuca leucadendron) merupakan anggota famili Myrtaceae
yang memiliki kandungan utama berupa eukaliptol atau kayuputol. Kayu putih dalam
bidang farmasi digunakan sebagai parasitisida, karminatif, stimulant, serta diaforetika.
Struktur eukaliptol adalah sebagai berikut:

Pepermint (Mentha piperita) dan Oregano merupakan anggota family


Lamiaceae. Keduanya memiliki kandungan utama berupa menthol. Dalam bidang
farmasi, pepermin banyak digunakan untuk meredakan sakit perut dan merupakan
obat ideal untuk mengatasi sakit kepala. Sedangkan oregano digunakan untuk
mengobati kuku atau kaki yang terkena jamur, membunuh parasit, menghilangkan
infeksi dan mengurangi infeksi sinus serta pilek. Struktur menthol:

Pacing (Costus specious) merupakan anggota famili costaceae yang memiliki


banyak kandungan senyawa kimia salah satunya yaitu beta-sitosterol. Beta-sitosterol
merupakan salah satu jenis senyawa steroid yaitu fitosterol. Selain beta-sitosterol,
jenis fitosterol yang lain adalah stigmasterol. Namun, stigmasterol tidak terdapat
dalam rhizoma pacing. Dalam bidang kesehatan, rhizoma pacing dapat digunakan
sebagai diuretic, antipiretik, serta antipruritik. Struktur beta-sitosterol:

VI.

KESIMPULAN
1. Minyak kayu putih tidak mengandung thymolmenthol karena tidak
menunjukkan warna bercak dan harga Rf yang sama dengan pembanding. Hal ini
sesuai teori.
2. Oregano dan daun mint pada percobaan tidak menunjukkan harga Rf dan warna
bercak yang sama dengan senyawa pembanding. Hal ini tidak sesuai teori.

3. Rhizoma pacing menunjukkan harga Rf dan warna bercak yang sama dengan
senyawa pembanding. Hal ini tidak sesuai teori.
4. Metode pemisahan yang digunakan pada percobaan ini adalah metode
pemisahan secara adsorpsi.
VII.

DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2015, Cajuput Essential Oil (Cajeput) Information,
http://www.essentialoils.co.za/essential-oils/cajuput.htm, diakses 14
Maret 2015.
Anonim, 2015, Oregano Oil: Extraordinary Oregano Oil,
http://articles.mercola.com/herbal-oils/oregano-oil.aspx, diakses 14
Maret 2015.
Anonim, 2015, Peppermint Essential Oil Information,
http://www.essentialoils.co.za/essential-oils/peppermint.htm, diakses 14
Maret 2015.
Anonim, 2015, Thin Layer Chromatography Information,
http://orgchem.colorado.edu/Technique/Procedures/TLC/TLC.html,
diakses 13 Maret 2015.
M. P Shafi, M. Thambi, 2015, Rhizome Essential Oil Composition of Costus
Speciosus and its Antimicrobial Properties,
http://ijpras.com/admin/uploads/Rhizome%20Essential%20Oil%20Co
mposition%20of%20Costus%20Speciosus.pdf, diakses 15 Maret 2015.
Zhongguo Z, Yao Za Zhi, 2002, Studies on Chemical Constituents of Two Plants
from
Costus,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12774385,
diakses 15 Maret 2015.

Yogyakarta, 15 Maret 2015


Praktikan,
Fera Maharani (FA/09636)
Sausanzahra A. (FA/09637)
Shella Syafira W. (FA/09638)