Anda di halaman 1dari 11

I.

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Klasifikasi bakteri secara filogenetik dapat dilakukan melalui analisis
taksonomi molekular (Sembiring, 2010). Data yang digunakan adalah sekuens gen
yang mengkode 16S rRNA (16S rDNA) pada masing-masing strain yang akan
diklasifikasikan. Woese pada tahun 1980-an telah dapat menyimpulkan bahwa
perbandingan filogenetik berdasarkan bagian conserved dari genom lebih stabil
daripada klasifikasi berdasarkan pada sifat-sifat fenotipik (Woese, 1987). Oleh
karena itu, penggunaan molekul rRNA disebarluaskan untuk pembuatan
perbandingan filogenetik, dan gen 16S rRNA (1650 bp) adalah marker yang
paling umum digunakan dalam bidang sistematika mikrobia (Prakash et al.,
2007).
Molekul 16S rRNA terdiri atas daerah variabel dan daerah conserved, dan
primer universal untuk amplifikasi gen 16S rRNA biasanya dipilih dari daerah
conserved sedangkan daerah variabel digunakan untuk taksonomi perbandingan
(Prakash et al., 2007). Langkah awal dalam klasifikasi filogenetik adalah
mengisolasi dan memurnikan DNA kromosomal dari masing-masing strain. Gen
16S RNA selanjutnya diamplifikasi dengan teknik PCR (polymerase chain
reaction) dari masing-masing sampel DNA kromosomnya.

Hasil amplifikasi

tersebut dimurnikan untuk disekuensing.


Klasifikasi filogenetik dilakukan melalui konstruksi phylogeny tree.
Phylogeny tree yang diperoleh merupakan hasil klasifikasi yang menunjukkan
hubungan filogenetik masing-masing strain bakteri yang diklasifikasikan.
Terdapat 4 tahapan dalam mengkonstruksi phylogeny tree yang didasarkan atas
data sekuens 16S rDNA, yaitu:
a.
b.
c.
d.

Preparasi sekuens 16S rDNA


Aligment sekuens 16S rDNA
Konstruksi phylogeny tree
Konstruksi matriks similaritas dan perbedaan nukleotida 16S rRNA.

B. Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah mengetahui cara dan tahapan analisis
kekerabatan bakteri dengan metode filogenetik molekuler.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi
Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini antara lain
sekuesn nukleotida mikroba yang diujikan, dan komputer yang memiliki program
PFE, MVSP, ClustalX, MEGA dan Ms.Words.
B. Metode
Metode yang digunakan dala praktikum taksonomi numerik-fenetik
adalah sebagai berikut :
a. Koleksi data
1. Data sekuens 16S rRNA dari 15 isolat Flavobacetrium sp. dan satu isolat
Pseudomonas sp. (outgroup) di download dari situs ncbi.
2. Masing-masing dicopykan ke program Words atau Notepad. Data tersebut
berupa text file dan disimpan sebagai file.
b. Preparasi sekuens 16S rRNA
1. Data sekuens di atas selanjutnya dibuka dengan PFE (Programmer File
Editor) dan sekuens dari masing-masing isolat diberi kode nama pada
bagian depan sekuens (misal flav 1, flav 2 dan seterusnya).
2. Selanjutnya di depan kode sekuens diberi tanda fasta format (>), hal ini
agar dapat dibaca oleh program yang untuk melakukan alignment yaitu
CLUSTALX.
3. Selanjutnya file disimpan dan diberi kode nama (save as), file ini sudah
dalam bentuk fasta format file yang siap diload ke dalam CLUSTALX
untuk dilakukan alignment.
c. Alignment sekuens 16S rDNA (ClustalX)
1. Data sekuens dari masing-masing strain (Cara kerja b) di load ke dalam
program CLUSTALX untuk di align. Alignment bertujuan untuk menata
sekuens agar satu sama lain diletakkan sesuai dengan posisi homologi
antar sekuens. Artinya, daerah homolog harus diletakkan pada posisi yang
sama (conserved region dengan conserved region, variable region dengan
variable region). Dengan alignment antar sekuens gen 16S rRNA dari
masing-masing strain dapat dibandingkan. Semua sekuens yang
dialignment ditata dalam satu file oleh program ClustalX sebagai output
file dalam beberapa pilihan format. Agar file hasil alignment dapat dibaca

oleh program MEGA dan PHYLIP yang digunakan untuk mengkonstruksi


phylogeny tree berdasarkan sekuens tersebut, maka file ini dibuat dalam
phylip format (file name.phy). Hal ini dapat dilakukan dengan memilih
format output file pada waktu melakukan alignment dalam CLUSTALX.
2. Output file ini disimpan dalam direktori CLUSTALX (Misal
C:\ClustalX\Flav.phy), sehingga setelah alignment dapat dicari hasil
alignment berupa file yang diberi nama seperti contoh, dalam direktori
ClustalX.
3. File ini selanjutnya digunakan untuk mengkonstruksi phylogeny tree
dengan program MEGA atau PHYLIP.
d. Konstruksi Phylogeny Tree
Program MEGA 3.0.1
Seluruh sekuens 16S rDNA hasil alignment digunakan untuk
mengkonstruksi phylogeny tree dengan program Mega 3.0.1.
1. Program Mega 3.0.1 dibuka, pilih alighment, lalu alighment explorer,
kemudian pilih retrieve.
2. Selanjutnya mengambil file dengan format .aln hasil dari Clustalx.
Klik file, lalu pilih Export alighment, pilih Mega format, dan save.
Close, kemudian ketik 16S lalu OK, kemudian no dan pilih
close.
3. Selanjutnya muncul perintah open data in mega? Pilih yes, lalu
minimize.
4. Pilih phylogeny, Construct phylogeny, pilih Neighbor Joining, lalu
Test phylogeny, Bootstrap dengan replikasi 1000. Selanjutnya pilih
compute.

II.

HASIL DAN PEMBAHASAN


A.Hasil

99
29

fl4
fl12
fl14

51

fl9
87

45

fl10
fl1

24
52

fl11
fl2

30
90

fl5
xant
fl7

65

fl3

64
96

fl8
fl6

46

fl13
al15

Gambar 1. Hasil Dendogram Isolat Flavobacterium sp.

B. Pembahasan
Taksonomi numerik merupakan kajian kekerabatan taxa yang mengacu
berdasarkan nilai similaritas. Taksonomi numerik digunakan untuk memperoleh
suatu klasifikasi yang bersifat lebih teliti, dan padat informasi. Taksonomi
numerik diawali dengan analisis karakter yang diuji dari berbagai uji yang
menghasilkan data fenotip yang beragam, data fenotip yang didapat, akan diolah
lebih lanjut sehingga menghasilkan koefisien similaritas, yaitu sebuah fungsi yang

mengukur tingkat kemiripan yang dimiliki oleh dua atau lebih stain mikroba yang
dibandingkan (Edwards dan Cavalli, 1964). Taksonomi numerik juga dikenal
sebagai taksonomi Adansonian. Taksonomi numerik ini berdasarkan atas lima
prinsip utama, yaitu taksonomi ideal merupakan taksonomi yang mengandung
informasi terbesar, dimana masing-masing karakter diberi nilai yang setara dalam
mengkonstruksikan takson yang bersifat alami, tingkat kedekatan antara dua strain
merupakan fungsi proporsi similaritas sifat yang dimiliki bersama, taksa yang
berbeda dibentuk berdasarkan atas sifat yang dimiliki, dan similaritas tidak
bersifat filogenetik melainkan bersifat fenetik (Boone & Castenholz, 2001).
Koefisien ini terdiri atas dua jenis yaitu, Simple Matching Coeficient
(Ssm) dan Jaccard Coeficient (SJ). Ssm merupakan koefisien similaritas yang
umum digunakan pada ilmu bakteriologi untuk mengukur proporsi karakter yang
sesuai, baik hubungannya bersifat ada (positif) maupun tidak ada (negatif).
Sedangkan SJ dihitung tanpa memperhitungkan karakter yang tidak dimiliki oleh
kedua organisme tersebut (Edwards dan Cavalli, 1964). Koefisien Asosiasi Ssm
semua sifat yang ada dilihat dan digunakan, sedangkan pada SJ tidak
memperhatikan sifat yang sama-sama tidak dimiliki. Kemudian dari matriks IS
tersebut, akan diperoleh dendogram (Felsenstein, 2004).
Sebanyak-banyaknya sifat (minimal 50 sifat) dari organisme yang akan
dikelompokkan kemudian dicari indeks similaritas (IS) dari satu organisme
terhadap organisme lain dalam daftar organisme yang akan dikelompokkan
(disebut OTUs). Pengamatan meliputi sifat morfologi, baik koloni maupun sel dan
dilanjutkan dengan pengujian sifat biokimia. Proses pengklasteran dalam
melakukan analisis taksonomi numerik dapat dilakukan dengan cara, langkah
pertama menentukan minimal 10 isolat dan 30 karakter dalam proses analisis.
Kemudian, dibuat tabel n x t pada Microsoft Excel dengan n sebagai jumlah
karakter, dan t sebagai jumlah isolat. Setelah itu, seluruh matrix di copy dan
masukkan dalam aplikasi PFE. Kemudian, ketik rumus *L t n nilai + diganti
menjadi 1, dan nilai diganti jadi 0. Langkah selanjutnya, di save dengan format
.mvs. Langkah selanjutnya, masuk dalam program MVSP yang bertujuan untuk
mendapatkan index similiarity dan nilai koefisien, serta dendogramnya. Program
MVSP dibuka kemudian pilih menu analysis kemudian, pilih cluster analysis dan

pilih UPGMA dan pilih Simple Matching Koefisien dan Jaccard Koefisien. setelah
itu akan muncul dendogramnya.
Prinsip pengklasteran ini didasarkan pada OTU (Operational Taxonomic
Unit), clustering ini dilakukan dengan mencari similaritas paling tinggi yang
menunjukan besarnya kemungkinan dua strain merupakan satu spesies. Pada
percobaan ini digunakan UPGMA. Konstruksi dendogram dibuat berdasarkan
pengklasteran yang telah dilakukan. Dengdogram merupakan hal penting sebagai
alat untuk mempermudah membaca hasil taksonomi numerik fenetik. Garis
garis pada dendogram menunjukan sejumlah strain yang satu spesies. Setelah itu
dilakukan analisis cophenetic-correlation-coefficient atau nilai koefisien korelasi.
Perhitungan koefisien korelasi dilakukan untuk mengetahui validitas konstruksi
dendrogram. Nilai koefisien korelasi yang > 60% diasumsikan sebagai konstruksi
dendogram yang dapat diterima. Nilai koefisien korelasi dapat diterima dan
dipertanggungjawabkan klasifikasinya jika didapatkan hasil > 70%. Hasil
menggunakan Simple Matching Coefficient menunjukan perbedaan dengan
menggunakan Jaccards Coefficient. Hal ini dikarenakan Simple Matching
Coefficient merupakan koefisien similaritas yang umum digunakan untuk
mengukur proporsi karakter yang sesuai, baik hubungannya bersifat ada (positif)
maupun tidak ada (negatif). Sedangkan Jaccards Coefficient mengabaikan
karakter-karakter yang negatif pada kedua spesies, hanya memuat proporsi yang
sesuai untuk karakter positif saja (Bayane et al., 2010).
Berdasarkan hasil praktikum kali ini Isolat yang dibandingkan ialah
Penicillium sejumlah 10 strain, terdiri dari P. expansum, P. solitum, P.
chrysogenum, P. echinulatum, P. olivinoviride, P. hirtusum, P. hordei, P.
camembertii, P. verrucosum, dan P. claviforme. 30 karakter yang dibandingkan
antara lain kemampuan hidup pada suhu 37C, asam laktat, hidrolisis kasein,
ada/tidaknya percabangan, dan gentisyl alkohol (Bridge et al., 1989). Hasil
analisis Jaccards dan Simple Matching menunjukkan perbedaan seperti yang
terlihat pada dendogram. Jaccards menunjukkan adanya dua kubu besar
Penicillium yang terpisah menjadi kelompok 1 (P. hirtusum, P. olivinoviride, P.
camembertii, P. chrysogenum) dan kelompok 2 (P. expansum, P. solitum, P.
echinulatum, P. hordei, P. verrucosum, P. claviforme), sedangkan Simple

Matching menunjukkan terpisahnya P. expansum dari mayoritas strain lainnya,


ditambah P. solitum sebagai outgroup. Perbedaan ini dapat terjadi karena sistem
penilaian karakter pada Jaccards dan Simple Matching berbeda. Koefisien
korelasi antara Jaccards dan Simple Matching berbeda, yaitu 0,8050491815
untuk Jaccards Coefficient dan 0,8408615513 untuk Simple Matching
Coefficient. Terdapat perbedaan antara analisis fenetik Jaccards dan Simple
Matching terlihat contohnya pada hubungan kekerabatan P. camembertii dan P.
chrysogenum. Jaccards coefficient menyatakan P. camembertii dan P.
chrysogenum memiliki hubungan kekerabatan sekitar 80%, sedangkan pada
Simple Matching coefficient dinyatakan sekitar 84%. Berdasarkan kedua koefisien
korelasi tersebut, maka bisa dikatakan bahwa kedua strain ini memiliki
kekerabatan yang tinggi (Bridge et al., 1989).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN


A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan maka dapat disimpulkan bahwa :
1. Koefisien korelasi Simple Matching menunjukkan nilai yang lebih tinggi
dibanding Jaccards, yaitu 0,8408615513 berbanding 0,80504918.
2. Taksonomi Numerik membutuhkan program komputer berupa Excell, PFE,
MVSP, Words, dan Paintshop Pro.

B. Saran
Jurnal yang dipakai untuk praktikumnya mungkin lebih baik jika 1
kelompok 1 jurnal tidak 1 orang 1 jurnal agar lebih efisien dalam pengerjaannya
tidak memakan waktu yang lama. Terima kasih sudah membagi ilmunya, semoga
lebih baik lagi di praktikum selanjutnya.

DAFTAR REFERENSI
Bayane, A., B. Diawara, R. D. Dubois, J. Destain, D. Roblain, and P. Thonart.
2010. Isolation and Characterization of New Spore-forming Lactic Acid
Bacteria with Prospects of Use in Food Fermentation and Probiotic
Preparation. African Journal of Microbiology Research4(11): 1016-1025.
Boone, R. D. and R. W. Castenholz. 2001. Bergeys Manual Of Systematics
Bacteriology. 2nd edition. Springer, New York.
Bridge, P. D., D. L. Hawksworth, Z. Kozakiewicz, A. H. S. Onions, R. R. M.
Paterson, M. J. Sackin, & P. H. A. Sneath. 1989. A Reappraisal of the
Terverticillate Penicillia Using Biochemical, Physiological and

Morphological Features I. Numerical Taxonomy. Journal of General


Microbiology, 135: 2941 2966.
Edwards, A. W. F. and Cavalli-Sforza, L. L. 1964. Reconstruction of phylogenetic
trees. in Phenetic and Phylogenetic Classification. ed. Heywood, V. H. and
McNeill. London: Systematics Assoc. Pub No 6.
Felsenstein, J. 2004. Inferring Phylogenies. Sinauer Associates, Sunderland.
Harly, J. P. 2005. Laboratory Exorcises in Microbiology sixth Edition. McGraw
Hill Companies, inc, 1211, Avence of the Amonical. New York.
Holland, S. M. 2006. Cluster Analysis. University of Georgia. Athens.
Pelczar, M.J. dan E.S. Chan.1993. Dasar-dasar Mikrobiologi I. UI Press. Jakarta.
Sembiring, L. 2003. Petunjuk Praktikum Sistematik mikrobia. Laboratorium
Mikrobiologi, UGM, Yogyakarta.
Sembiring, L. 2011. Petunjuk Praktikum Sistematik mikrobia. Laboratorium
Mikrobiologi, UGM, Yogyakarta.
Suprapto, S., T. Gunaedi, dan B. T Rumahorbo. 2014. Aktivitas Enzim Amilase
Isolat Bakteri Amilolitik dari Tepung Sagu Basah dan Lingkungan
Tempat Penyediaannya Secara Tradisional di Jayapura. Jurnal Biologi
Papua, 6(2): 101-104.

KLASIFIKASI MIKROBA DENGAN METODE TAKSONOMI NUMERIK

Oleh :
Nama
NIM
Kelompok
Rombongan
Asisten

: Silviyatun Nimah
: B1J013016
:1
:I
: Hedi Susanto

LAPORAN PRAKTIKUM SISTEMATIKA MIKROBA

KEMENTERIAN RISET TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGI


UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2015