KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

I.

TUJUAN PERCOBAAN

Setelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat:

Melakukan analisa sampel (zat warna) secara kromatografi lapis tipis

II.

a.

ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN

Alat yang Digunakan

b.

Pelat TLC
Chamber Chromatography
Bahan yang Digunakan

III.

DASAR TEORI

Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar. Fase
diamnya (Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada gelas/kaca,
plastik, aluminium. Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase) berupa cairan atau
campuran cairan, biasanya pelarut organi dan kadang-kadang juga air. Fase diam yang
berupa lapisan tipis ini dapat dibuat dengan membentangkan /meratakan fase diam
diatas plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium.
KLT (kromatgrafi Lapis Tipis)/TLC (Thin Layer Chromatography) merupakan
salah satu cara untuk memisahkan dan menganalisa zat dalam jumlah yang kecil. Pada
TLC, adsorben tersebar secara merata dalam permukaan gelas dan membentuk suatu
lapisan tipis, terbentuk pita-pita yang tidak horizontal, maka sulit untuk mengumpulkan
komponen-komponen. Ujung dari pita kedua akan terbawa sebelum seluruh pita
pertama keluar dari kolom. Ada dua factor penyebab masalah ini yaitu permukaan atas
dari adsorben tidak rata serta kolom tidak benar-benar vertical.

Fenomena lain adalah terbentuknya lengkungan pada salah satu sisi pita. Hal ini
dapat terjadi bila ada ketidakteraturan pada permukaan adsorben atau terdapat
gelembung udara pada kolom.
Pada TLC, cuplikan yang akan dipisahkan atau dianalisa diteteskan pada pelat dengan
menggunakan kapiler. Pemisahan dapat terjadi dengan memasukkan pelat ke dalam
chamber (kamar) yang telah jenuh dengan pelarut. Pelarut akan naik secara perlahanlahan sepanjang pelat tersebut. Cuplikan akan terdistribusi antara fasa diam (adsorben)
dan fasa gerak (pelarut). Sebagai fase gerak umumnya zat yang kurang polar
dibandingkan dengan fasa diam sehingga komponen dalam cuplikan yang kurang
polar akan bergerak lebih cepat dari komponen cuplikan yang lebih polar. Bila larutan
hamper mencapai ujung pelat maka pelat dikeluarkan dari chamber dan dibiarkan
hingga pelarut yang menempel pada pelat menguap. Akan terlihat noda-noda pada
pelat yang menunjukan jumlah komponen yang ada dalam cuplikan. Perbandingan
antar jarak perjalanan komponen dengan jarak perjalanan pelarut disebut Rf. Rf
dinyatakan dengan bilangan dan dapat digambarkan seperti berikut ini.

Distance travelled by
The solven

Distance travelled by
The various dyes
M

Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Rf

= Jarak yang ditempuh komponen

Jarak yang ditempuh oleh pelarut

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1,7 cm dari garis
awal, sementara pelarut berjarak 5,0 cm sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna
merah menjadi:
Rf

= 1.7
5.0

= 0,34
Bila kondisi pengerjaan sama, maka niali Rf untuk kompoen tertentu adalah
sama. Nilai Rf dapat digunakan untuk mengidentifikasi komponen. Faktor-faktor yang
mempengaruhi harga Rf pada TLC
Struktur kimia darei senyawa yang dipisahkan
Sifat dari penyerap dan derajat aktifasinya
Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap
Kemurnian pelarut (fase gerak)
Jumlah cuplikan yang digunakan
Suhu
kesetimbangan
Pelaksanaan KLT
1.

Fase Diam

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap

berukuran kecil

dengan diameter partikel antara 10-30 m. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase
diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT
dalam hal efisiensi dan resolusinya.
Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara
mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsidan partisi (Gandjar &
Rohman, 2007).
Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena strukturnya,
ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa diam yang
digunakan TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk kromatografi kolom,
terutama karena ukuran dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan spesifikasi
tertentu, iaitu ukuran (diameter) dalam mesh dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC
atau kromatografi kolom). Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran:

Silika gel

Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam
perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40m. Makin kecil diameter
akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian mempengaruhi
kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 300-1000 m2/g. Bersifat
higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Macam
macam silka gel yang dijual dipasaran: Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya

digunakan pengikat gypsum, (CaSO4 5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada
juga menggunakan pengikat pati (starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati
sebagai pengikat mengganggu penggunaan asam sulfat sebagai pereaksi penentuan
bercak. Silika gel dengan pengikat dan indicator flouresensi.
Jenis silica gel ini sama seperti silika gel diatas dengan tambahan zat berfluoresensi
bila diperiksa dibawah lampu UV A, panjang atau pendek. Sebagai indicator digunakan
timah kadmium sulfida atau mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau
Silika gel GF254 (berflouresensi pada 254 , nm). Silika gel tanpa pengikat, dikenal
dengan nama Silika gel H atau Silika gel N. Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan
indicator flouresensi. Silika gel untuk keperluan pemisahan preparative

Alumina

Banyak digunakan setelah silika gel, alumina termasuk kelompok fase diam yang
beraktifitas tinggi. Alumina yang digunakan TLC bersifat sedikit basa (pH 9), ada juga
yang bersifat netral (pH 7) dan alumina yang bersifat asam (pH 4). Juga digunakan
CaSO4 sebagai pengikat yang dapat menurunkan bebasaan pada tinggkat tertentu.
Sepertihalnya Silica gel, alumina dikenal dengan atau tanpa pengikat dan bahan
indicator. Pemberian namapun identik dengan silika gel dengan code G.H.P.F.

Selulosa

Menggunakan selulosa sebagai fase diam maka mekanisme pemisahannya sama

seperti mekanisme pemisahan pada kromatografi kertas. Perbedaannya hanya serat
selulosenya pada TLC/KLT lebih pendek dari pada serat selulosa kromatografi kertas.
Panjang serat bervariasi 2-20 . Serat lebih pendek menyebabkan difusi rendah selama
elusi dan menghasilkan bercak yang sempit (lebih kecil). Selulosa untuk TLC terdapat
dim bentuk selulosa serat asli (contohnya MN 300) dan selulosa mikrokristal
(contohnya Avicel). Fase diam selulosa biasanya digunakan senyawa yang bersifat
polar.
2.

Fase Gerak

Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik. Dapat
digunakan satu macam pelarut organic saja ataupun campuran. Bilamana fase gerak
merupakan campuran pelarut organik dengan air maka mekanisme pemisahan adalah
partisi. Pemilihan pelarut organic ini sangat penting karena akan menentukan
keberhasilan pemisahan. Pendekatan polaritas adalah yang paling sesuai untuk

pemilihan pelarut. Senyawa polar akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang
bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa non polar lebih
mudah terelusi oleh fase gerak non polar dari pada fase gerak yang polar.
Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :
1.

Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan

2.

teknik yang sensitif.

Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara

3.

0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase
gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai
Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam
pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara
signifikan (Gandjar & Rohman, 2007).
Tabel Beberapa Sistem Pemisahan dengan KLT dari Bahan Alam (Gibbons, 2006)
Eluen
Heksan : Etil
asetat
Petrol :
Dietileter
Petrol :
Kloroform
Toluen : Etil
asetat : Asam
asetat (TEA)
Kloroform :
Aseton
n-Butanol : Asam
Asetat : Air
Metanol : Air

FaseDiam
Silika Gel

Keterangan
Sistem umum yang digunakan
Sistem umum yang digunakan

Silika Gel

Silika Gel

Silika Gel

Silika Gel
Silika Gel

untuk senyawa nonpolar seperti terpen

dan asam lemak
Berguna untuk pemisahan derivat
asam sinamat dan kumarin
Komposisi 80:18:2 v/v atau
60:38:2 v/v baik untuk pemisahan
metabolit asam
Sistem umum untuk produk
dengan polaritas sedang
Sistem polar untuk flavonoid dan
glikosida
Dimulai dengan metanol 100%

C18

dilanjutkan dengan penambahan

Asetonitril : Air

C18

konsentrasi air
Sistem umum Reverse phase
Memisahkan senyawa dengan

Metanol : Air

Selulosa

kepolaran tinggi seperti gula dan

glikosida

3.

Penotolan Sampel

Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit

0,5 l. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 l, maka penotolan
harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan (Gandjar
& Rohman, 2007).
4.

Pengembangan

Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan

sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase
gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam
fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah
lempeng yang telah berisi totolan sampel.
Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak
sedikit mungkin, akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian
lempeng yang telah ditentukan. Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya
bejana dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah mencapai ujung dari kertas
saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh (Gandjar & Rohman,
2007).
5.

Deteksi Bercak

Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia yang
biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara
penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk
menampakkan bercak adalah dengan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar
ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat
berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas (Gandjar & Rohman, 2007).
Deteksi senyawa dilakukan dengan menggunakan detektor UV di bawah sinar UV
254 nm, indikator pada plat KLT akan memancarkan warna hijau dan pada UV 366 nm
akan memancarkan warna ungu. Komponen yang menyerap cahaya pada 254 atau 366
nm akan tampak sebagai bercak gelap pada plat yang bercahaya (Gibbons, 2006).
Metode deteksi lain adalah dengan menggunakan pereaksi semprot.
Tabel Beberapa Jenis Pereaksi Semprot untuk KLT (Gibbons, 2006)
Pereaksi
semprot

Komposisi

Perlakuan

Keterangan

Vanilin
asam sulfat

gram

dalam

asam

vanilin

Disemprot

Pereaksi umum

sulfat dan dipanaskan yang

pekat

digunakan.

hingga muncul Terpen

warna

akan

menghasilkan
warna merah atau

Asam
fosfomolibdat

Asam

Disemprot

fosfomolibdat 5% b/v dan dipanaskan mendeteksi

dalam etanol

40%

terpen

hingga muncul dengan bercak biru

warna
10 mL larutan KI
Jika

Reagen
Dragendorff

biru
Untuk

ditambahkan tidak

berlatar kuning
reaksi
Deteksi alkaloid
spontan menghasilkan

dengan 10 mL larutan maka

warna oranye pekat

0,85 gram bismuth diperlukan

hingga merah

subnitrat dalam 10 pemanasan

mL asam asetat dan
50 mL air. Larutan
tersebut

diencerkan

dalam 10 mL asam
asetat dan 50 mL air
Prinsip Kerja TLC
Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara
sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam
dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin
dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin
dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh
fase gerak tersebut.
IV. PROSEDUR PERCOBAAN
1.
Pelat yang telah selesai dilapisi silica disiapkan
2.
diteteskan dengan menggunakan pipa kapiler pada permukaan pelat
3.
Pelat dimasukkan ke dalam chamber yang berisi
. Tetesan yang berada
pada pelat tidak boleh terkena/terendam pelarut.

dapat digunakan

4.

karena bersifat lebih polar.

Pelarut telah naik secara perlahan-lahan disepanjang pelat sehingga sampai

5.

diujung yang lain dari pelat. Batas perjalanan pelarut ditandai.

Pelat dikeringkan dan telah dibandingkan harga Rf dari noda yang terbentuk.

V.

GAMBAR ALAT (TERLAMPIR)