I.

PENDAHULUAN

A. Judul
Enzim
B. Tujuan
1. Mengetahui pH dan suhu optimum aktivitas enzim amilase
2. Mengetahui pH dan suhu optimum aktivitas enzim nitrat reduktase
3. Menentukan pH optimum enzim nitrat reduktase dan aktivitas nitrat
reduktase secara kuantitatif
4. Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim

II.

TINJAUAN PUSTAKA

Enzim adalah protein yang diproduksi dari sel hidup dan digunakan oleh
sel-sel untuk mengkatalisis reaksi kimia yang spesifik (Shahib, 1992). Sebagai
mana protein pada umumnya, molekul enzim juga mempunyai struktur tiga
dimensi (Sadikin, 2002). Enzim memiliki tenaga katalitik yang luar biasa dan
biasanya lebih besar dari katalisator sintetik. Spesifitas enzim sangat tinggi
terhadap substratnya. Tanpa pembentukan produk samping enzim merupakan unit
fungsional untuk metabolisme dalam sel, bekerja menurut urutan yang teratur
(Shahib, 1992).
Fungsi enzim sebagai katalis untuk reaksi kimia dapat terjadi baik didalam
maupun diluar sel. Suatu enzim bekerja secara khas terhadap suatu substrat
tertentu. Suatu enzim dapat bekerja 108 sampai 1011 kali lebih cepat dibandingkan
laju reaksi tanpa katalis. Enzim bekerja sebagai katalis dengan cara menurunkan
energi aktifasi, sehingga laju reaksi meningkat (Poedjadi, 2006).
Secara singkat, beberapa sifat dari enzim menurut Dwidjoseputro (1992)
diantaranya :
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Berfungsi sebagi biokatalisator

Merupakan suatu protein
Bersifat khusus atau spesifik
Merupakan suatu koloid
Jumlah yang dibutuhkan tidak terlalu banyak
Tidak tahan panas
Adapula faktor-faktor yang dapat mempengaruhi fungsi enzim diantaranya

menurut Dwidjoseputro (1992) adalah :

1. Suhu
Oleh karena reaksi kimia itu dapat dipengaruhi suhu maka reaksi
menggunakan katalis enzim dapat dipengaruhi oleh suhu. Di samping itu,
karena enzim adalah suatu protein maka kenaikan suhu dapat menyebabkan
denaturasi dan bagian aktif enzim akan terganggu sehingga konsentrasi dan
kecepatan enzim berkurang.
2. pH
Umumnya enzim efektifitas maksimum pada pH optimum, yang lazimnya
berkisar antara pH 4,5-8.0. Pada pH yang terlalu tinggi atau terlalu rendah
umumnya enzim menjadi non aktif secara irreversible karena menjadi
denaturasi protein.

3. Konsentrasi enzim Seperti pada katalis lain, kecepatan suatu reaksi yang
menggunakan enzim tergantung pada konsentrasi enzim tersebut. Pada suatu
konsentrasi

substrat

tertentu,

kecepatan

reaksibertambah

dengan

bertambahnya konsentrasi enzim.

4. Konsentrasi substrat
Hasil eksperimen menunjukkan bahwa dengan konsentrasi substrat akan
menaikkan kecepat reaksi. Akan tetapi, pada batas tertentu tidak terjadi
kecepatan reaksi, walaupn konsenrasi substrat diperbesar.
5. Zat-zat penghambat
Hambatan atau inhibisi suatu reaksi akan berpengaruh

terhadap

penggabungan substrat pada bagian aktif yang mengalami hambatan.

Beberapa

enzim

berdasarkan

golongan

menurut

Poedjiadi

(2006)

diantaranya sebagai berikut :

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Oksidoreduktase
Transferase
Hidrolase
Liase
Isomerase
Ligase
Amilase adalah enzim yang mempunyai kemampuan memecah ikatan

glukosida pada polimer pati menghasilkan molekul lebih sederhana seperti

glukosa, maltosa, dan dekstrin. Enzim amilase akan memecah substrat pati
melalui tiga tahapan utama yaitu gelatinisasi, likuifikasi, dan sakarifikasi (Nangin
dan Aji, 2015). Begitu pula menurut Poedjiadi (2006) enzim amilase dapat
memecah ikatan pada amilum hingga terbentuk maltosa.
Ada tiga macam enzim amilase, yaitu amilase, amilase dan amilase.
Yang terdapat dalam saliva (ludah) dan pankreas adalah amilase. Enzim ini
memecah ikatan 1-4 yang terdapat dalam amilum dan disebut endo amilase sebab
enzim ini memecah bagian dalam atau bagian tengah molekul amilum. Enzim
amilase memiliki aktivitas spesifik pada kondisi suhu optimum 35 C, waktu
inkubasi 30 menit, dan pH = 6,1 (Poedjiadi, 2006).
Suhu berperan dalam meningkatkan interaksi antara substrat dengan enzim
dalam suatu reaksi enzimatis. Aktivitas -amilase mengalami peningkatan sampai
suhu 36 C (suhu optimum) dengan unit aktivitas sebesar 7,33 unit/mL. Kenaikan

aktivitas enzim di bawah suhu optimum disebabkan karena kenaikan energi

kinetika molekul-molekul yang bereaksi, namun jika suhu tetap dinaikkan terus,
energi kinetik molekul-molekul enzim menjadi besar sehingga memecahkan
ikatan-ikatan yang mempertahankan enzim dalam bentuk aslinya dan akibatnya
enzim mengalami denaturasi (Jayanti dkk., 2013).

Gambar 1. Suhu optimum -amilase dalam menghidrolisis substrat amilosa

menjadi maltosa (Jayanti dkk, 2013).
Proses hidrolisa pati/amilum merupakan pemutusan ikatan glikosidik pada
rantai polimernya oleh suatu reaktan yang dibantu oleh air. Proses ini digunakan
di industri untuk memproduksi molekul sederhana seperti glukosa, maltosa, dan
dekstrin. Ikatan glikosidik pada amilum cenderung stabil pada kondisi basa
namun kurang stabil pada kondisi asam. Ikatan tersebut juga dapat putus oleh
adanya enzim pemecah pati (Nangin dan Aji, 2015).
Hasil pemecahan tersebut akan menghasilkan gugus aldehid yang dikenal
sebagai gugus ujung reduksi. Banyaknya gugus ujung reduksi berbanding lurus
dengan derajat hidrolisis amilum (Nangin dan Aji, 2015). Tiga buah dekstrin yang
penting sebagai hasil antara hidrolisis amilum adalah amilodekstrin dengan
iodium memberikan warna ungu, eritrodekstrin dengan iodium menghasilkan
warna merah, dan akrodekstrin dengan iodium tidak memberikan warna. Tidak
seluruh amilum dapat diubah menjadi maltosa oleh pengaruh enzim amilase
(Poedjiadi, 2006).
Uji benedict merupakan uji kualitatif untuk mengidentifikasi gula reduksi,
seperti glukosa, maltosa, laktosa, dan fruktosa. Tes reduksi ini dilakukan dalam
medium basa. Gula reduksi dalam kondisi basa akan membentuk enediols.
Enediols tersebut tidak stabil dan terurai dan membentuk campuran aldehid yang

merupakan agen reduksi kuat yang akan mereduksi ion kupri menjadi ion kupru
sebagai kupri hidroksida (CuOH). Kupru hidroksida selama proses pemanasan
akan berubah menjadi endapan kupru oksida (CuO) yang berbeda yang
mengindikasikan adanya gula reduksi. Warna endapan bergantung pada
konsentrasi gula. Ketika amilum telah terhidrolisis sempurna menjadi maltosa,
maka ketika diuji benedict larutan akan berubah warna menjadi hijau kebiruan dan
adanya endapan merah bata (Shankara, 2008).
Sunarni, dkk (2007) mengidenfikasi fraksi etanol infusa daun kepel
memiliki kandungan flavonoid dengan aktivitas antioksidan yang kuat. Flavonoid
selain memiliki aktivitas antioksidan juga memiliki aktivitas sebagai antifungi
dengan merusak permeabilitas membran sel sehingga dapat mengganggu proses
metabolisme jamur. Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya yang menunjukan
daun kepel memiliki kandungan flavonoid perlu diteliti secara aktivitas antifungi
fraksi etanol infusa daun kepel (Stelechocarpus burahol, Hook F&Th) terhadap
Candida albicans serta diidentifikasi senyawa kimia yang terdapat dalam fraksi
etanol infusa daun.
Enzim nitrat reduktase merupakan salah satu enzim tanaman yang sangat
intensif diteliti. Perhatian besar terhadap regulasi nitrat reduktase tersebut
terutama karena aktivitas enzim tersebut merupakan faktor pembatas proses
asimilasi nitrat yang berperan penting terhadap pertumbuhan dan produktivitas
tanaman (Fitriana dkk., 2009). Lehninger (1994) menyatakan bahwa enzim nitrat
reduktase memperoleh elektron dari nukleosida atau NADPH 2/NADH2 yang
mentransfer elektron ke flavin adenin dinukleotida (FAD) dan dilanjutkan ke
molibdenum, kemudian akhirnya ke nitrat reduktase untuk mereduksi nitrat
menjadi nitrit. Menurut Boyer dkk. (1960) pada umumnya, nitrat reduktase
menunjukkan pH optimal 7,5-8,0 untuk berbagai macam tanaman. pH optimum
enzim ini dapat bekerja adalah 25oC. Nilai optimal dari pH dapat berubah sesuai
dengan pengaruh umur tanaman dan umur daun.
Aktivitas nitrat reduktase (ANR) mempunyai korelasi positif dengan
produksi, berat kering, total nitrogen dan daya hasil tanaman. Sebuah penelitian
memperlihatkan bahwa semakin tinggi aktivitas nitrat reduktase semakin tinggi

juga berat kering tanaman (Fitriana dkk., 2009). Aktivitas nitrat reduktase (ANR)
tinggi akan menyebabkan terjadinya kenaikan laju reaksi pada reduksi nitrat
(Sadikin, 2002).
Hubungan antara laju reaksi dengan aktivitas enzim adalah berbanding
lurus. Makin besar aktivitas enzim, makin cepat laju reaksi. Makin cepat laju
reaksi, makin banyak pula produk yang terbentuk. Adanya hubungan yang
berbanding lurus tersebut dapat mendukung tanaman untuk meningkatkan
produktivitasnya. Apabila terjadi kenaikan pada aktivitas nitrat reduktase, maka
produk yang dihasilkan juga akan naik seiring dengan kenaikan laju reaksinya
(Sadikin, 2002).
Ketersediaan air di lingkungan memiliki hubungan dengan enzim nitrat
reduktase sebagai penyedia proton dan elektron untuk aktivitasnya. Setiap langkah
dalam proses perubahan nitrat menjadi nitrit memerlukan perpindahan enam
elektron untuk tiap molekulnya (Campbel dkk., 1999). Molekul air yang tersedia
memberikan sumbangan proton dan elektron melalui fotosintesis yang
menghasilkan NADPH2 pada saat reaksi terang. NADPH2 yang dihasilkan
tersebut cukup untuk mendukung aktivitas enzim nitrat reduktase saat mereduksi
nitrat menjadi nitrit (Fitriana dkk., 2009).
Larutan buffer adalah campuran asam/basa lemah dan basa/asam
konjugasinya yang dapat mempertahankan pH di sekitar daerah kapasitas buffer.
Adapun kapasitas buffer adalah kemampuan mempertahankan pH sebesar =
pKa1. Larutan buffer dibuat dari senyawa sitrat dan fosfat. Campuran ekivalen
antara asam sitrat dan garam natrium konjugasinya menghasilkan larutan buffer
pH 4. Sedangkan campuran ekivalen antara dihidrogen fosfat dan monohidrogen
fosfat menghasilkan larutan buffer pH 6 (Sadikin, 2002).
Larutan 5M NaNO3 yang merupakan substrat dari enzim nitrat reduktase
(Purbajanti dkk., 2010). Menurut Fitriana dkk. (2009) untuk mengamati nilai
optical density dari aktivitas enzim nitrat reduktase panjang gelombang yang
digunakan adalah 540 nm. Larutan SA dan NED berperan sebagai pemberi warna
pada larutan yang mengandung enzim nitrat reduktase bereaksi dengan nitrat.

III.

METODE

A. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada percobaan enzim diantaranya yaitu gelas
beker, tabung reaksi, rak tabung reaksi, spektrofotometer, tabung film,
water bath, label, alummunium foil, pro pipet, pipet ukur, pipet tetes, drop
plate, bunsen, penjepit, kuvet plastik dan vortex.
Bahan yang terpakai dalam percobaan enzim adalah larutan amilum,
saliva, buffer fosfat pH 6, larutan iod, reagen benedict, daun kepel, larutan

NaNO3 5M, akuades, larutan SA, larutan NED, buffer fosfat pH 5, buffer
fosfat pH 7, buffer fosfat pH 8, buffer fosfat pH 9.
B. Cara Kerja
1. Hidrolisis Amilum
Larutan amilum diambil sebanyak 10 ml dan dimasukkan pada
keempat tabung reaksi. Saliva ditambahkan ke tabung reaksi masingmasing tabung sebanyak 3 ml. Pada tabung reaksi 3 dan 4 dimasukkan
sejumlah 3 ml larutan buffer fosfat dengan pH 6, sedangkan tabung 1
dan 2 tidak diberi tambahan larutan buffer fosfat. Pada tabung 1 dan 3
diinkubasi pada suhu ruang yaitu 27 0C. Disamping itu, tabung reaksi 2
dan 4 diinkubasi pada suhu 350C pada waterbath.
Setiap satu menit larutan pada tabung reaksi yang diinkubasi
baik pada suhu ruang maupun di water bath diambil satu tetes dan
diletakkan pada drop plate. Masing-masing larutan pada drop plate
tiap menitnya ditetesi dengan larutan iod hingga berwarna kuning,
kemudian waktu hidrolisis dari larutan dicatat. Apabila larutan sudah
terhidrolisis yaitu ditandai dengan warna kuning, dilanjutkan dengan
uji benedict.
Reagen benedict dimasukkan pada keempat tabung reaksi yang
lain masing-masing sebanyak 2 ml, barulah ditambahkan dengan 10
tetes sampel dari tabung reaksi yang telah diinkubasi sebelumnya.
Tabung reaksi yang berisi larutan sampel dengan reagen benedict lalu
dipanaskan di atas bunsen hingga terbentuk gelembung. Perubahan
pada larutan sebelum dan sesudah dipanaskan diamati terbentuk
endapapn atau tidak.
2. Pengaruh Suhu dan pH Pada Enzim Nitrat Reduktase
Sampel berupa daun kepel muda yang sudah dipotong menjadi
bagian-bagian kecil dan ditimbang sejumlah 300 mg sebelumnya,
dimasukkan pada keempat tabung reaksi. Masing-masing tabung
ditambahkan dengan larutan NaNO3 sebanyak 0,1 ml. Larutan buffer
fosfat dengan pH 6 ditambahkan pada tabung reaksi 1 dan 2 masingmasing sebanyak 5 ml, sedangkan pada tabung reaksi 3 dan 4

ditambahkan akuades sebanyak 5 ml. Tabung reaksi 1 dan 3

diinkubasi pada suhu ruang yaitu 270C. Pada suhu 350C tabung reaksi
2 dan 4 diinkubasi dengan water bath.
Setiap tiga menit larutan yang diinkubasi pada suhu ruang dan
suhu 350C diteteskan pada drop plate sebanyak 3 tetes. Larutan SA
dan larutan NED secara berurutan ditambahkan pada drop plate
sebanyak 3 tetes. Larutan diamati hingga terjadi perubahan warna
yaitu menjadi merah muda. Waktu reduksi yang ditunjukkan oleh
larutan sampel dicatat.
3. Penentuan pH Optimum Enzim Nitrat Reduktase
a. Pembuatan larutan blanko
Larutan NaNO3 sebanyak 0,1 ml pada tabung reaksi
ditambahkan dengan akuades sebanyak 5 ml. Larutan tersebut
diambil sebanyak 0,4 ml. Larutan SA dan larutan NED sebanyak
0,3 ml ditambahkan ke dalam tabung reaksi berisi 0,4 larutan
sampel sebelumnya dengan akuades sejumlah 6 ml.
b. Penentuan pH optimum
Daun kepel muda yang berupa potongan-potongan kecil
dengan berat sampel 300 mg masing-masing dimasukkan ke
tabung film. Pada tabung film mulai dari 1 hingga 4
ditambahkan dengan larutan buffer fosfat pH 5, buffer fosfat pH
6, buffer fosfat pH 7, buffer fosfat pH 8, dan buffer fosfat pH 9
secara berurutan sebanyak 5 ml pada tiap tabung film. Masingmasing tabung diinkubasi pada suhu ruang 27 0C selama 15
menit. Larutan buffer fosfat sebelumnya ditambahkan pada
tabung dibuang dan digantikan kembali dengan larutan buffer
fosfat sesuai pH pada tiap tabung film masing-masing 5 ml.
Keempat tabung film ditambahkan dengan larutan NaNO 3
dengan konsentrasi 5M sebanyak 0,1 ml kemudian digojog
perlahan agar homogen dan didiamkan hingga 30 menit. Larutan
pada masing-masing tabung diambil sebanyak 0,4 ml

dan

dimasukkan pada kelima tabung reaksi. Pada tabung reaksi 1

ditambahkan larutan SA sebesar 0,3 ml, tabung reaksi kedua

larutan NED dimasukkan sebanyak 0,3 ml, dan yang ketiga

ditambahkan akuades sebanyak 6 ml. Pada ketiga tabung reaksi
yang telah ditambahkan dengan SA, NED, dan akuades divortex
barulah kemudian diukur absorbansinya pada spektrofotometer
dengan panjang gelombang 540 nm.
Nilai ANR (Aktivitas Nitrat

Reduktase)

dihitung

menggunakan rumus seperti berikut :

absorbansi sampel 1000 1 Vm
1
ANR=
+
+ +
+
absorbansi standar W
T Va 1000
Keterangan :
W

= Berat sampel

Va

= Volume Larutan Blanko

Vm = Volume Larutan Buffer Fosfat

T

= Waktu

IV.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hidrolisis Amilum
Berdasarkan percobaan dari hidrolisis amilum terhadap saliva
diperoleh data pada tabel sebagai berikut :
Tabel 1. Hasil Uji Hidrolisis Amilum
Tabung

Perlakuan

Waktu

Warna Akhir
Uji Iod

Saliva (suhu ruang)

1 menit

Kuning

Saliva + buffer fosfat

pH 6 (suhu ruang)

1 menit

Kuning

Saliva (water bath)

2 menit

Kuning

Saliva + buffer fosfat

2 menit

Kuning

Warna Akhir
Uji Benedict
Hijau +
endapan
Hijau biru +
endapan
Hijau +
endapan
Hijau +

pH 6 (water bath)
endapan
Tujuan dari pengujian hidrolisis amilum yaitu untuk mengetahui pH
dan suhu optimum yang dimiliki oleh enzim amilase pada saliva untuk
menghidrolisis amilum. Fungsi dari saliva yaitu menghasilkan enzim
amilase khususnya enzim amilase. amilase pada saliva dapat memecah
ikatan glikosidik 1-4 yang terdapat dalam amilum. Amilum sendiri berperan
sebagai substrat pada saliva yang akan dihidrolisis oleh enzim amilase.
Reaksi yang terjadi sebagai berikut :

maltosa + glukosa + oligosakarida

amilase
Inkubasi pada suhu ruang (27oC) dan waterbath pada suhu 35oC
Amilum

bertujuan untuk mengetahui pengaruh suhu terhadap kerja optimum dari

enzim amilase dalam proses hidrolisis amilum. Inkubasi pada suhu ruang
memberikan pengaruh terhadap enzim, khususnya enzim amilase, seesuai
teori menurut Dwidjoseputro (1992) bahwa reaksi kimia dapat dipengaruhi
suhu.

Disamping

itu,

inkubasi

pada

waterbath

(35oC)

berfungsi

mengkondisikan suhu pada rongga mulut dimana enzim amilase dapat

bekerja dan akan mempengaruhi aktvitas enzim.
Selain itu, inkubasi dengan waterbath (35oC) bertujuan untuk
memecah ikatan yang ada pada amilum. Penambahan buffer fosfat pH 6
berperan dalam mengkondisikan perubahan pH agar menjadi asam pada
enzim amilase. Pada lain hal, buffer fosfat pH 6 juga berfungsi dalam
mempertahankan pH larutan amilum yang mengandung enzim amilase
karena buffer fosfat dapat mempengaruhi aktivitas kerja dari enzim amilase
pada suhu optimum.
Pada percobaan hidrolisis amilum, setiap 1 menit larutan dari masingmasing tabung reaksi diambil sebanyak 1 tetes dan dimasukkan ke dalam
drop plate yang kemudian diuji dengan larutan iod. Hal ini bertujuan untuk
menguji hidrolisis yang terjadi secara bertahap dalam rentang waktu yang
sama. Uji iod bertujuan untuk mengetahui amilum yang telah terhidrolisis
seluruhnya yaitu dengan memperlihatkan hasil negatif pada sampel hingga
bewarna kuning. Reaksi negatif pada uji iod menandakan bahwa enzim

amilase telah menghidrolisis amilum dengan sempurna dari bentuk

kompleks menjadi bentuk sederhana, yaitu disakarida berupa maltosa.

Gambar 2. Reaksi uji iod (Poedjiadi, 2006).

Perlakuan uji benedict yaitu setelah larutan sampel pada uji iod
menunjukkan hasil negatif dengan ditandai perubahan warna menjadi
kuning. Uji benedict berfungsi untuk mengetahui kandungan gula pereduksi
pada larutan sampel sebagai hasil hidrolisis dari enzim amilase terhadap
amilum. Ketika amilum telah terhidrolisis sempurna menjadi maltosa, maka
pada uji benedict akan terjadi perubahan warna pada larutan menjadi hijau
hingga hijau kebiruan dan ditandai dengan endapan merah bata. Hasil positif
pada uji benedict ditunjukkan pada sampel gula pereduksi seperti, glukosa,
maltosa, laktosa, dan fruktosa.

Gambar 3. Reaksi uji benedict (Poedjiadi, 2006).

Hasil pada uji hidrolisis amilum yaitu pada tabung 1 berisi saliva dan
3 berisi saliva dengan buffer fosfat pH 6 yang diinkubasi pada suhu ruang
(27oC) menunjukkan perubahan warna ketika bereaksi denga reagen iod
pada waktu 1 menit. Pada tabung reaksi 2 dengan 4 yang masing-masing
secara berurutan berisi saliva dan saliva ditambah buffer fosfat pH 6
diinkubasi pada water bath dengan suhu 35oC. Hasil yang diperoleh baik
pada tabung 2 ataupun tabung 4 waktu yang dibutuhkan untuk terhidrolisis
adalah sama yaitu selama 2 menit dengan perubahan warna larutan menjadi
kuning.

Gambar 4. Larutan sampel setelah ditambah dengan reagen benedict

dan dipanaskan (Dokumentasi Pribadi, 2015).
Pada uji benedict (gambar 4), tabung 2 hingga 4 menunjukkan
perbahan warna yang sebelumnya biru menjadi warna hijau, kecuali pada
tabung 1 terdapat sedikit perbedaan warna yaitu hijau kebiruan. Endapan
yang dihasilkan pada tabung 1 (saliva) dan 3 (saliva+buffer fosfat pH 6)
hasil dari inkubasi pada suhu ruang menunjukkan bahwa endapan paling
sedikit terdapat pada tabung 1, sedangkan pada tabung 3 tidak jauh berbeda
dengan jumlah endapan sedikit. Hasil dari tabung 2 dan 4 yang diinkubasi
pada suhu 35oC pada water bath menunjukkan bahwa pada tabung 2 yang
berisi saliva terdapat endapan dalam jumlah banyak, begitupun dengan
tabung 4 (saliva+ buffer fosfat pH 6) menghasilkan jumlah endapan paling
banyak diantara tiga tabung lainnya.
Hasil yang diperoleh sesuai dengan teori bahwa enzim amilase pada
saliva dapat memecah ikatan 1-4 yang terdapat dalam amilum dan disebut
endo amilase sebab enzim ini memecah bagian dalam atau bagian tengah
molekul amilum. Enzim amilase memiliki aktivitas spesifik pada kondisi
suhu optimum 35 C, waktu inkubasi 30 menit, dan pH = 6,1 (Poedjiadi,
2006). Selain itu pendapat yang mendukung dikemukakan oleh Jayanti dkk
(2013) bahwa suhu berperan dalam meningkatkan interaksi antara substrat
dengan enzim dalam suatu reaksi enzimatis. Aktivitas -amilase mengalami
peningkatan sampai suhu 36 C (suhu optimum) dengan unit aktivitas
sebesar 7,33 unit/mL.
B. Pengaruh pH dan Suhu Enzim Nitrat Reduktase

Berdasarkan percobaan dari enzim nitrat reduktase pada daun kepel

diperoleh data yang tertera pada tabel yaitu :
Tabel 2. Hasil Uji Pegaruh pH dan Suhu Enzim Nitrat Reduktase
Tabung
3

Perlakuan
Waktu
Warna Akhir
Daun Kepel + akuades (suhu ruang) 3 menit
Merah muda
Daun Kepel + buffer fosfat pH 6
1
15 menit
Kuning
(suhu ruang)
4
Daun Kepel + akuades (water bath) 3 menit
Merah muda
Daun Kepel + buffer fosfat pH 6
2
12 menit
Kuning
(water bath)
Tujuan dari uji pengaruh pada pH dan suhu enzim nitrat reduktase

adalah untuk mengetahui pH dan suhu optimum dari aktivitas enzim nitrat
reduktase pada daun kepel. Pada sampel daun kepel dapat diperoleh enzim
nitrat reduktase yang terletak pada bagian sitoplasma dari potongan daun
muda. Larutan 5M NaNO3 berperan sebagai substrat dari enzim nitrat
reduktase pada daun kepel.
Pada uji pengaruh pH enzim reduktase diberi perlakuan menambahkan
buffer fosfat yang mewakili pH asam dan netral-basa. Perlakuan
penambahan buffer fosfat pH 6 bertujuan untuk memberikan suasana asam
pada sampel daun kepel dan akuades berperan dalam memberikan suasana
netral hingga basa. Pada uji pengaruh suhu terhadap enzim nitrat reduktase
perlakuan inkubasi pada suhu 35oC dengan waterbath ataupun suhu ruang
(27oC) bertujuan untuk mengetahui suhu optimum dari enzim nitrat
reduktase pada daun kepel.
Inkubasi suhu ruang (27oC) bertujuan untuk memberikan pengaruh
suhu ruang terhadap enzim, khususnya pada enzim nitrat yang akan
mempengaruhi reaksi kimia yang terjadi. Inkubasi pada waterbath (35oC)
berfungsi dalam meningkatkan suhu dan kecepatan reaksi enzim. Dalam hal
ini, akan mempengaruhi aktivitas nitrat reduktase (ANR) menjadi tinggi dan
menyebabkan terjadinya kenaikan laju reaksi pada reduksi nitrat.
Reaksi yang terjadi pada enzim nitrat reduktase pada proses inkubasi
suhu ruang dan dalam water bath :

Gambar 5. Reaksi dari enzim nitrat reduktase (Fitriana dkk., 2009).

Pada percobaan enzim reduktase, larutan sampel pada tabung 1 hingga
4 baik diinkubasi pada suhu ruang maupun pada water bath masing-masing
diambil sebanyak 3 tetes dan di letakkan pada drop plate. Barulah diteteskan
dengan larutan SA dan NED secara berurutan tiap larutan pada rentang
waktu kelipatan 3 menit sebanyak 3 tetes. Larutan SA (sulfanilamide) dan
NED

(naphthyl

ethylenediaminedihydrochloride)

berfungsi

sebagai

indikator proses pembentukan nitrit dari hasil reduksi terhadap larutan

NaNO3 yang dikatalis oleh enzim nitrat reduktase pada daun kepel.
Nitrit dengan amina aromatik pada sulfanilamide akan membentuk
diazonium. Diazonium dan NED kemudian membentuk gugus kromofor
bewarna merah muda. Perubahan warna menjadi merah muda setelah diberi
indikator SA dan NED secara berurutan menandakan bahwa proses reduksi
nitrat telah berakhir. Apabila larutan sampel bereaksi dengan nitrit, larutan
sampel akan berubah warna menjadi merah muda pada kelipatan waktu dan
perlakuan tertentu.
Hasil pertama diperoleh pada uji pengaruh pH dan suhu enzim nitrat
reduktase pada tabung 1 (daun kepel+buffer fosfat pH 6) dan tabung 3 (daun
kepel+akuades) yang diinkubasi pada suhu ruang. Tabung 1 menunjukkan
perubahan warna pada menit ke-15 ketika penambahan reagen SA dan NED,
namun hanya terjadi perubahan warna menjadi warna kuning yang
menandakan hasil tersebut adalah negatif. Pada tabung 3 terjadi reaksi
antara larutan sampel daun kepel dengan reagen SA dan NED dengan
ditandai adanya perubahan pada warna larutan menjadi merah muda pada
menit ke-3.
Hasil kedua diperoleh pada uji pengaruh pH dan suhu enzim nitrat
reduktase pada tabung 2 (daun kepel+buffer fosfat pH 6) dan tabung 4
dengan sampel daun kepel + akuades dan diinkubasi pada suhu ruang.

Tabung 2 memperlihatkan perubahan warna selama 12 menit ketika

penambahan reagen SA dan NED ditandai dengan perubahan warna menjadi
kuning yang menunjukkan bahwa hasil tersebut adalah negatif. Pada tabung
4 terjadi reaksi antara larutan sampel dengan reagen SA dan NED yaitu
ditandai dengan adanya perubahan warna larutan selama 3 menit menjadi
merah muda.
Hasil positif ditunjukkan pada tabung 3 dan 4 dimana pada tabung 3
berisi daun kepel dengan akuades dan diinkubasi pada suhu ruang (27 oC),
sedangkan tabung 4 mendapat perlakuan inkubasi water bath (35o). Hasil
dari keduanya ditunjukkan dengan perubahan warna larutan menjadi merah
muda. Sebaliknya, pada tabung 1 (daun kepel+buffer fosfat pH 6) dan
tabung 2 menunjukkan hasil yang negatif ditunjukkan dengan perubahan
warna menjadi kuning pada waktu yang jauh lebih lama dibanding dengan
tabung 3 dan 4.
Pada hal ini, menurut Boyer dkk. (1960) enzim nitrat reduktase
bekerja optimal dalam suasana normal cenderung basa sedangkan pH
optimal untuk enzim nitrat reduktase adalah 25oC. Enzim nitrat reduktase
menunjukkan pH optimal 7,5 pada suhu 25oC untuk berbagai macam
tanaman. Hasil yang sesuai dengan teori ditunjukkan oleh tabung 3 dan 4,
namun pada tabung 3 yaitu daun kepel ditambahkan akuades dan diinkubasi
pada suhu ruang menunjukkan hasil yang paling optimal. Hal ini
dikarenakan inkubasi pada suhu ruang (27oC) membuat suhu larutan
mendekati suhu optimal enzim nitrat reduktase (25oC). Selain itu,
penambahan akuades mempercepat proses reduksi nitrat dibandingkan
dengan buffer fosfat karena aquades membuat pH larutan menjadi netral dan
mendekati pH optimal enzim nitrat reduktase bekerja, yaitu pH 7,5.
Pada tabung 1 dan 2 pun menunjukkan hasil yang sesuai teori bahwa
pada tabung yang berisi daun kepel dengan buffer fosfat pH 6 dan
diinkubasi dalam water bath menghasilkan warna larutan yang cenderung
kuning. Hal ini dikarenakan pH pada buffer fosfat yang memiliki rentang
cukup jauh dengan pH optimum dari enzim nitrat reduktase (7,5). Selain itu,

perlakuan inkubasi dalam waterbath justru akan meningkatkan atau

menjauhkan suhu optimum pada enzim nitrat reduktase (25oC).
C. Optimalisasi Enzim Nitrat Reduktase
Berdasarkan percobaan pada pH optimum enzim nitrat reduktase
diperoleh hasil sebagai berikut :
Tabel 3. Hasil Uji Penentuan pH Optimum Enzim Nitrat Reduktase
ANR (mol
NO2-/gram/jam)
1
5
0,078
457,75
2
6
0,081
475,35
3
7
0,100
586,85
4
8
0,152
892,02
5
9
0,132
774,65
Tujuan dari percobaan optimalisasi pH enzim reduktase yaitu agar

Tabung

pH

OD (Optical Density)

dapat menetukan pH optimum enzim nitrat reduktase dan aktivitas nitrat

reduktase secara kuantitatif pada daun kepel berdasarkan nilai optical
density tiap pH. Potongan daun kepel muda dimasukkan ke dalam lima
tabung film masing-masing 300 mg. Tabung film dengan dinding hitam
berfungsi mencegah cahaya yang masuk sehingga reaksi yang terjadi di
dalam tabung tidak dipengaruhi oleh sumber cahaya. Hal tersebut bertujuan
supaya mencegah proses reduksi nitrit oleh enzim nitrit reduktase yang ada
pada daun kepel menjadi ammonium.
Pengguanaan buffer fosfat dikarenakan sifatnya yang cenderung stabil
dan memiliki kemampuan buffer kuat serta merupakan buffer biologis.
Penambahan buffer fosfat pada berbagai pH bertujuan untuk memberikan
suasana asam pada pH 5-6, netral pH 7, dan basa pada pH 8-9 sehingga
dapat dibandingkan optimalitas kerja dari enzim nitrat reduktase. Tujuan
dari larutan buffer digantikan dengan pH yang sama sebelumnya pada
kelima tabung reaksi yaitu untuk menghilangkan beberapa kontaminan dan
kotoran yang terlarut dalam larutan buffer awal, sehingga nantinya
pengukuran OD pada spektrofotometer lebih akurat.
Disamping itu, larutan buffer diganti kembali dengan buffer yang
sama sesuai pH tiap tabung berfungsi untuk aklimatisasi pada larutan atau
mengkondisikan larutan agar sesuai dengan kondisi optimal dan

memastikan pH tetap terjaga. Larutan di setiap tabung film digojog

bertujuan agar semua larutan yang tercampur dapat larut dengan
sempurna/homogen. Perlakuan didiamkan selama 30 menit bertujuan untuk
mereaksikan reagen-reagen yang ditambahkan dalam larutan sehingga
reaksi dapat berjalan dengan baik.
Larutan
SA
(sulfanilamide)

dan

ethylenediaminedihydrochloride)

sebagai

berfungsi

NED

(naphthyl

indikator

proses

pembentukan nitrit dari hasil reduksi terhadap larutan NaNO 3 yang dikatalis
oleh enzim nitrat reduktase pada daun kepel. Nitrit dengan amina aromatik
pada sulfanilamide akan membentuk diazonium. Diazonium dan NED
kemudian membentuk gugus kromofor bewarna merah muda.
Penambahan aquades bertujuan untuk mengencerkan larutan sehingga
dapat optical density pada larutan sampel dapat dianalisis oleh
spektrofotometer. Larutan yang terlalu pekat akan menyerap semua sumber
sinar sehingga kemungkinan untuk menentukan nilai optical densitiy larutan
cukup sulit. Nilai optical density dari aktivitas enzim nitrat reduktase,
panjang gelombang yang digunakan adalah 540 nm dimana disitulah
kemampuan penyerapan sinar dari larutan berwarna merah muda. Hal ini
didukung oleh teori menurut Basset (1994) bahwa pada panjang gelombang
500-560 nm, warna yang diserap adalah warna hijau yang memiliki warna
komplementer ungu kemerahan.
Hasil optical density pada pH 5, 6, 7, 8, 9 pada enzim nitrat reduktase
dalam daun kepel secara berturut-turut yaitu 0,078 ; 0,081 ; 0100 ;
0,152 ; 0,132 . Secara umum hasil menunjukkan bahwa semaik tinggi
nilai pH semakin tinggi pula nilai OD larutan sampel. Akan tetapi, nilai OD
paling optimum terdapat pada pH 8 yaitu dengan nilai 0,152 . Barulah
terjadi penurunan kembali pada pH 9 menjadi 0,132 .
Hasil OD yang diperoleh sebanding dengan nilai aktivitas nitrat
reduktase (ANR) pada daun kepel. Nilai ANR pada pH 5 hingga 9 secara
berurutan pada satuan

mol

NO2-1 g-1 jam-1 diperoleh hasil 457,75; 475,

35; 586, 85; 892, 02; dan 774, 65. Nilai ANR yang paling optimum terletak

pada pH 8 yaitu 892,02

mol

NO2-1 g-1 jam-1, sedangkan nilai ANR pada

suasana paling basa yaitu dengan pH 9 adalah 774, 65 mol

NO2-1 g-1

jam-1. Hasil pH optimum dapat dilihat pula pada grafik (gambar 7) bagian
lampiran.
Pada pH 9 nilai ANR mengalami penurunan kembali, hal ini sesuai
dengan teori menurut Boyer dkk. (1960) bahwa pada umumnya, nitrat
reduktase menunjukkan pH optimal 7,5-8,0 untuk berbagai macam tanaman.
pH optimum enzim ini dapat bekerja adalah 25oC. Didukung pula oleh teori
dari Sadikin (2002) apabila terjadi kenaikan pada aktivitas nitrat reduktase,
maka produk yang dihasilkan juga akan naik seiring dengan kenaikan laju
reaksinya.

V.

KESIMPULAN

Berdasarkan uji enzim pada beberapa perlakuan atau percobaan dapat

diperoleh kesimpulan sebagai berikut :
1. pH optimum enzim amilase berdasarkan uji hidrolisis amilum yaitu pada
pH 6 terhadap penambahan buffer fosfat yang diinkubasi pada suhu
35oC pada water bath.
2. Suhu optimum pada uji enzim nitrat reduktase daun kepel yaitu pada
suhu ruang 27oC dan pada pH 7,5 dengan penambahan akuades.
3. pH optimum dari enzim nitrat reduktase pada daun kepel yaitu pada pH
8 dengan nilai ANR sebesar 892, 02 dan OD 0,152 .
4. Faktor yang mempengaruhi percobaan diantaranya suhu, pH, dan
perlakuan seperti inkubasi.

DAFTAR PUSTAKA
Boyer, P. D., Lardy, H. dan Myrback, L. 1960. The Enzymes. Academic Press,
New York.
Campbell, N. A., Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A.,
Minorsky, P. V., dan Jackson, R. B. 1999. Biologi. Erlangga, Jakarta.
Dwidjoseputro, D. 1992. Pengantar Fisiologi Tumbuhan, Gramedia Pustaka
Utama, Jakarta.
Fitriana, J., Pukan, K. K., dan Herlina, L. 2009. Aktivitas Enzim Nitrat Reduktase
Kedelai Kultivar Burangrang Akibat Variasi Kadar Air Tanah Pada Awal
Pengisian Polong. Jurnal Akta Agrosia 7(2): 47-51.
Jayanti, D., Wuryanti, dan Taslimah. 2013. Solasi, Karakterisasi, dan Amobilisasi
-Amilase Dari Aspergillus oryzae Fncc 6004. Jurnal FMIPA 1(1) : 76-84.
Lehninger, A. L. 1994. Kimia Organik. Erlangga, Jakarta.
Nangin, D., dan Aji S. 2015. Enzim Amilase Pemecah Pati Mentah Dari Mikroba.
Jurnal Pangan dan Agroindustri 3(3) : 1032-1039.
Poedjiadi, A. 2006. Dasar-dasar Biokimia. UI-Press, Jakarta.
Purbajanti, E.D., Soetrisno R.D., Hanudin E., dan Budhi S.B. 2010. Penampilan
Fisiologi dan Hasil Rumput Benggala (Panicum maximumjacq.) Pada Tanah
Salin Akibat Pemberian Pupuk Kandang, Gypsum dan Sumber Nitrogen.
Jurnal Ilmu-ilmu Pertanian Indonesia 12(1) : 61-67.

Sadikin, M. 2002. Biokimia Enzim. Widya Medika, Jakarta.

Shankara, S. 2008. Lab Manual for Practical Biochemistry. Jaypee Brother, New
Delhi.
Sunarni. T., Pramono. S., dan Asmah. R., 2007. Flavonoid Antioksidan Penangkap
Radikal dari Daun Kepel (Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook f.& Th.).
Majalah Farmasi Indonesia 18(3) : 111 116.

LAMPIRAN
A. Perhitungan
Perhitungan nilai ANR (Aktivitas Nitrat Reduktase):
ANR=

absorbansi sampel 1000 1 Vm

1
+
+ +
+
absorbansi standar W
T Va 1000

Keterangan:
Absorbansi standar
T
W
Vm

= 0,0142/ nm
= 0,5 jam
= 300 mg = 0,3 gr
= 5 ml

Va

= 0,4 ml

1. Tabung 1( pH 5)
ANR=

0,078 1000 1 5
1
.
.
.
.
0,0142 0,3 0,5 0,4 1000
g1 jam1
= 457,75 mol NO2

2. Tabung 2 (pH 6)
0,081 1000 1 5
1
ANR=
.
.
.
.
0,0142 0,3 0,5 0,4 1000
g1 jam1
= 475,35 mol NO2
3. Tabung 3 (pH 7)
0,100 1000 1 5
1
ANR=
.
.
.
.
0,0142 0,3 0,5 0,4 1000
1

g jam
= 586,85 mol NO2
4. Tabung 4 (pH 8)
0,152 1000 1 5
1
ANR=
.
.
.
.
0,0142 0,3 0,5 0,4 1000

g1 jam1
= 892,02 mol NO2
5. Tabung 5 (pH 9)
0,132 1000 1 5
1
ANR=
.
.
.
.
0,0142 0,3 0,5 0,4 1000
g1 jam1
= 774,65 mol NO2

B. Foto

Gambar 6. Uji enzim nitrat reduktase pada saat diinkubasi water bath
(Dokumentasi Pribadi, 2015).

Gambar 7. Uji enzim nitrat reduktase pada saat diinkubasi suhu runag
(Dokumentasi Pribadi, 2015).

ANR
1000
900

892.02

800

774.65

700
600

ANR

586.85

500

475.35

457.75

400
300
200
100
0
1

10

11

Gambar 7. Grafik hubungan nilai ANR dan pH enzim nitrtat reduktase