Nama

: Tiara Ismihayati K.

NIM

: 142210101099

Kelas

:A

1.

Apa perbedaan dan fungsi dari vektor pRSET dan pEASY-T1?

pRSET
Vektor pRSET adalah suatu vector yang dirancang untuk ekspresi prokariotik
tingkat tinggi yang dikendalikan oleh promotor T7 bakteriofag yang kuat. Selain itu,
sisipan DNA berada di posisi awal dan berada dalam urutan yang mengkodekan fusi Nterminal peptida. Urutan ini mencakup ATG inisiasi terjemahan kodon yang
menstabilkan urutan dari gen 10 dari fag T7, Xpress epitop, dan tempat pembelahan
enterokinase.
Fungsi : Ekspresi ini diinduksi oleh T7 RNA polymerase di E.coli. Sel-sel ini juga
memproduksi T7 lisozim untuk mengurangi ekspresi basal gen target. Ekspresi gen dari
pRSET dikendalikan oleh fage promotor T7 yang kuat yang mendorong ekspresi gen
10. T7 RNA polymerase secara spesifik mengenali promotor ini. Untuk ekspresi gen
yang diinginkan, hal ini diperlukan untuk memberikan T7 RNA polimerase pada sel-sel
dengan menginduksi ekspresi polymerase yang menggunakan penginduksi isopropil DThiogalactoside, atau menginfeksi sel dengan fage yang mengekspresikan polimerase.
Setelah polimerase RNA T7 yang cukup diproduksi, ia mengikat promotor T7 dan
mentranskripsi gen yang diinginkan. Satu set ketiga vektor disediakan (A, B, dan C).
Masing-masing memiliki N-terminal tag coding dengan urutan kerangka pembacaan
yang relatif berbeda terhadap situs kloning beberapa untuk menyederhanakan di-frame
kloning gen yang dipilih. Mereka hanya berbeda dalam jarak antara urutan kode untuk
peptida N-terminal dan beberapa situs kloning. Untuk ekspresi yang tepat, ditentukan
dulu situs restriksi yang sesuai untuk ligase.
Vektor pRSET menyediakan:
a) Bacteriophage promoter T7 untuk ekspresi tingkat tinggi
b) Gen T7 urut 10 untuk memberikan stabilitas protein
c) Polyhistidine N-terminal (6xHis) tag untuk pemurnian dengan cepat menggunakan
resin nikel-pengkhelat dan deteksi dengan Anti-HisG Antibodi
d) N-terminal Xpress epitop untuk deteksi dengan Anti-Xpress Antibody
e) Tempat pembelahan Enterokinase untuk penghapusan tag fusion

f) Satu set dari ketiga vektor disediakan (yaitu A, B, dan C) masing-masing memiliki
urutan N-terminal tag coding yang berbeda, reading frame relatif terhadap beberapa
situs kloning berguna untuk menyederhanakan di-frame kloning gen.
pEASY-T1
pEASY-T1 menyediakan metode yang sangat efisien untuk kloning Taq
polymerase produk PCR secara langsung yang menghasilkan produk berupa vector
plasmid. Ekspresi vektor ini memiliki T7 / lac kontrol promotor yang tepat, dan ekspresi
ini memiliki kemampuan efisien yang tinggi. Ukuran insert fragmen 750 bp, dan protein
tujuan adalah sekitar 27 kDa. Produk PCR tidak perlu pemurnian dan intisari enzim.
Efisiensi kloning tinggi. Kontrol promotor ekspresi T7 / lac tepat. Protein rekombinan
mudah dimurnikan oleh terminal 6xHis.
Kloning Kit (perlengkapan kloning) dirancang untuk kloning dan sekuensing Taq
dari produk PCR yang telah diamplifikasi. pEASY-T1 kloning kit menyediakan:
a) 5 menit ligasi yang cepat dari produk PCR Taq-diperkuat.
b) Kanamisin dan Ampisilin resistensi gen untuk pilihan seleksi.
c) Seleksi biru / putih.
d) Promotor T7 primer, M13 forward primer dan M13 adalah reverse primer untuk
sequencing.
e) Promotor T7 untuk transkripsi in vitro.
f) Trans1-T1 fag tahan sel kimia yang kompeten, efisiensi transformasi yang tinggi (>
109 cfu / g pUC19 DNA) dan cepat tumbuh.
2.

Apa perbedaan dari plasmid, bakteriofage, cosmid dan YAC (Yeast Artificial
Chromosom)?
Plasmid
Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara autonom
dan bisa ditemukan pada sel hidup. Umumnya, plasmid mengkodekan gen-gen yang
diperlukan agar dapat bertahan pada keadaan yang kurang menguntungkan sehingga
bila lingkungan kembali normal, DNA plasmid dapat dibuang. Plasmid dapat
bereplikasi secara autonom karena mempunyai origin of DNA replication (ori)
tersendiri. Ori beberapa plasmid mempunyai spesifitas yang tinggi, sehingga plasmid
tersebut hanya dapat bereplikasi pada satu spesies bakteri saja (narrow host range
plasmid). Sedang kelompok plasmid yang lain mempunyai ori yang kurang spesifik,
sehingga dapat bereplikasi pada beberapa spesies bakteri (broad host range plasmid).
Plasmid dapat mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat bertahan pada
keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan kembali normal, DNA
plasmid dapat dibuang. Sebagian besar plasmid memiliki struktur sirkuler, namun ada
juga

plasmid

linear

yang

dapat

ditemukan

pada

mikroorganisme tertentu

(seperti Borrelia burgdorferi dan Streptomyces) dan berukuran 1 kb sampai lebih dari
500 kb.
Plasmid ditemukan dalam bentuk DNA utas ganda yang sebagian besar tersusun
menjadi superkoil atau

kumparan

terpilin.

Struktur

superkoil

terjadi

karena enzimtopoisomerase membuat sebagian DNA utas ganda lepas (tidak terikat)
selama replikasi plasmid berlangsung. Struktur ini akan menyebabkan DNA plasmid
berada dalam konformasi yang disebut lingkaran tertutup kovalen ataucovalently closed
circular (ccc), namun apabila kedua utas DNA terlepas maka akan plasmid akan
kembali dalam keadaan normal (tidak terpilin) dan konformasi tersebut disebut
sebagai open circuler (oc).
Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memiliki beberapa
kriteria, yaitu:
o berukuran kecil berkisar dari beberapa kb mendekati 100 kb
o relatif memiliki jumlah salinan yang tinggi (high copy number) memiliki gen
resistensiantibiotik sebagai penanda seleksi dan gen pelapor,
o memiliki situs pemotongan enzim restriksi untuk memudahkan penyisipan DNA ke
dalam vektor plasmid.
o Setelah pertumbuhan, fragmen klon dapat dipulihkan dengan mudah. Sel-sel yang
segaris dan DNA yang diisolasi dan dimurnikan
o Dapat menyimpan hingga 10 fragmen kb serta dapat disimpan tanpa batas waktu
jika dicampur dengan gliserol maka suhu diatur -70C dalam freezer.
Plasmid yang sudah tidak berguna dapat dicegah agar tidak dibuang dengan
mekanisme seperti beberapa plasmid menyandikan protein yang dapat membunuh sel
yang

membuangnya.

addiction)

yang

Mekanisme

diklasifikasikan

ini

disebut ketergantungan

menjadi

tiga

jenis

plasmid (plasmid

berdasarkan

aksi

yang

dilakukan protein antitoksin yang disandikan plasmid. Ketiga jenis aksi tersebut adalah
berinteraksi dengantoksin, melindungi target yang akan diserang toksin, dan
menghambat ekspresi toksin tersebut.
Bakteriofage
Bakteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya
yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning
pada sel inang bakteri. Ada beberapa macam bakteriofag yang biasa digunakan sebagai
vektor kloning.

Bakteriofag I
Bakteriofag merupakan virus kompleks yang menginfeksi bakteri E. coli.
DNA l yang diisolasi dari partikel fag ini mempunyai konformasi linier untai
ganda dengan panjang 48,5 kb. Namun, masing-masing ujung fosfatnya berupa

untai tunggal sepanjang 12 pb yang komplementer satu sama lain sehingga

memungkinkan DNA l untuk berubah konformasinya menjadi sirkuler.
Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA l, yaitu vektor
insersionalyang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing; vektor
substitusiyang untuk membawa fragmen DNA asing harus membuang sebagian
atau seluruh urutan basanya yang terdapat di daerah nonesensial dan
menggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut.
Di antara keduanya, vektor substitusi lebih banyak digunakan karena
kemampuannya untuk membawa fragmen DNA asing hingga 23 kb.

Bakteriofag M13
Ada jenis bakteriofag lainnya yang dapat menginfeksi E. coli. Berbeda
dengan l yang mempunyai struktur ikosahedral berekor, fag jenis kedua ini
mempunyai struktur berupa filamen.
Keuntungan penggunaan M13 sebagai vektor kloning bila dibandingkan
dengan plasmid dan l adalah sel inang genom M13 dapat cepat berubah menjadi
untai ganda sirkular yang dengan cepat akan bereplikasi menghasilkan sekitar 100
salinan. Salinan tersebut akan membentuk untai tunggal sirkuler baru yang
kemudian akan terselubungi oleh membran dan keluar dari sel inang menjadi
partikel fag yang infektif tanpa menyebabkan lisis, maka tidak ada batas ukuran
DNA asing yang dapat disisipkan kepadanya. euntungan lainnya adalah bahwa
M13 dapat digunakan untuk sekuensing (penentuan urutan basa) DNA dan
mutagenesis tapak terarah (site directed mutagenesis) karena untai tunggal DNA
M13 dapat dijadikan cetakan (templat) di dalam kedua proses tersebut.
Meskipun demikian, M13 hanya mempunyai sedikit sekali daerah pada
DNAnya yang dapat disisipi oleh DNA asing. Di samping itu, tempat pengenalan
restriksinya pun sangat sedikit.

Kosmid
Kosmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggabungkan kos dari
DNA l dengan plasmid. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32
hingga 47 kb menjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada fag l dan plasmid.
Sebuah kosmid adalah jenis plasmid hibrida yang berisi fag Lambda cos
berurutan. Mereka sering digunakan sebagai vektor kloning dalam rekayasa genetika .
Kosmid dapat berisi 37-52 (biasanya 45 ) kb DNA , sedangkan plasmid normal
mampu membawa hanya 1-20 kb . Mereka dapat meniru sebagai plasmid jika mereka
memiliki asal-usul yang cocok replikasi. Mereka sering juga mengandung gen untuk

seleksi seperti resistensi antibiotik , sehingga sel-sel transfected dapat diidentifikasi

dengan plating pada media yang mengandung antibiotik . Sel-sel yang tidak mengambil
kosmid tidak akan mampu untuk tumbuh . Tidak seperti plasmid , mereka juga dapat
dikemas dalam capsids fag , yang memungkinkan gen asing yang akan ditransfer ke
dalam atau antara sel dengan transduksi.
Yeast Articial Chromosom
YACs dapat membawa fragmen DNA genomik sepanjang lebih dari 1 Mb. Oleh
karena itu, YACs dapat digunakan untuk mengklon gen utuh manusia, misalnya gen
penyandi cystic fibrosis yang panjangnya 250 kb. Dengan kemampuannya itu YACs
sangat berguna dalam pemetaan genom manusia seperti yang dilakukan pada Proyek
3.

Genom Manusia.
Apakah yang dimaksud dengan marka seleksi dari ketahanan antibiotik (ampisilin,
kanamisin) dan seleksi biru putih (Lac Z)?
a. Seleksi Marka
Seleksi marka adalah suatu proses dimana penanda ( morfologi , biokimia atau
yang didasarkan pada DNA / RNA variasi) digunakan untuk langsung pemilihan dari
penentu genetik atau faktor penentu dari sifat vektor (misalnya penyakit resistensi).
Berikut penjelasan dari seleksi marka vector pRSET A,B,C dan pEASY-T1 :
Ketahanan Antibiotik Ampisillin dan Kanamycin
Vektor pRSET A,B,C resisten terhadap Ampisillim, sedangkan vector pEASYT1 resisten terhadap Ampisillin dan Kanamycin. Hal ini menunjukkan bahwa ketika
vector diletakkan pada wadah yang diberi antibiotik Ampisillin maka vector tersebut
akan tetap hidup, begitu juga ketika diletakkan pada wadah yang diberi antibiotik
Kanamisin maka akan tetap hidup pula karena vektor itu telah resisten terhadap
antibiotik-antibiotik tersebut.
b. Seleksi Biru Putih
Kebanyakan vektor kloning modern, memiliki suatu MCS dalam gen lacZ. Gen
ini dalam keberadaan suatu induser seperti IPTG (isopropil--Dtiogalaktosida) akan
menghasilkan enzim -galaktosidase, yang akan mengkonversi laktosa menjadi
galaktosa dan glukosa. Enzim ini dalam kondisi normal akan disintesis oleh E.coli
jika ada laktosa, dan merubah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa.
Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC18/19 telah disisipi oleh DNA
asing pada bagian gen lacZ. Dalam hal ini gen lacZ menjadi tidak berfungsi (tidak
akan menghasilkan -galaktosidase) karena telah disisipi DNA asing.

Terbentuknya koloni berwarna putih berarti sel kompeten membawa DNA

rekombinan (DNA plasmid dan gen target). Adapun koloni berwarna biru berarti sel
kompeten yang tumbuh membawa DNA plasmid saja (tidak disisipi gen terget).
Dengan kata lain, bila gen lacZ-nya rusak atau dirusak maka sel akan
membentuk koloni yang berwarna putih. Jadi, dengan mata telanjang bisa
disimpulkan bahwa apabila sel bakteri membentuk koloni berwarna biru berarti gen
lacZ-nya masih berfungsi, sedangkan apabila koloninya berwarna putih gen lacZ-nya
sudah rusak dan tidak berfungsi. Bentuk ini menurut Nicholl (1994) adalah dasar
untuk metode skrining rekombinan secara langsung menggunakan X-gal substrat
kromogenik.

DAFTAR PUSTAKA

https://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/vektor-kloning/ (Diakses tanggal 14 Maret 2016

pukul 19.22 WIB)
https://en.wikipedia.org/wiki/Marker-assisted_selection (Diakses tanggal 14 Maret 2016
pukul 20.23 WIB)
http://www.generasibiologi.com/2012/08/marka-molekular.html (Diakses tanggal 14 Maret
2016 pukul 20.00 WIB)