Tugas Mid Bioteknologi Molekular

BUNGA LOTUS BERPENDAR PADA MALAM HARI DENGAN

MENYISIPKAN GEN GREEN FLUOROSENS PROTEIN DARI
UBUR-UBUR

Oleh :
NAMA

: NIRWANA

NIM

: F1C1 13 024

KELAS

: KIMIA B

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2016
I.
A. Latar Belakang

PENDAHULUAN

Sekitar 20 tahun silam beberarapa jenis tanaman air, seperti papyrus, enceng
gondok, teratai dan lotus lebih dikenal sebagai tanaman liar yang tumbuh di danau,
rawa, dan tepian sungai. Meskipun setiap tanaman tersebut memiliki sosok yang
menarik, para hobi tanaman hias kurang meliriknya.
Kini, seiring perkembangan bisnis tanaman hias, cara pandang masyarakat
mulai berubah. Selain penempatannya yang lazim pada kolam atau air, tanaman air
dapat pula ditanam secara soliter atau dipadukan dalam kombinasi yang harmonis
didalam pot yang indah. Makin maraknya pemuliaan berbagai jenis tanaman air,
membuat tanaman air ini mudah diperoleh. Pertimbangannya, selain kemampuan
untuk tumbuh dengan baik didalam ruangan, sosoknya juga tergolong unik dan
dekoratif sehingga cocok bila ditempatkan dimana saja.
Perkembangan sains teknologi yaitu pada bidang ilmu bioteknologi molekular
dalam hal rekayasa genetik bukanlah hal yang baru. Seperti dengan maraknya
beberapa tahun terakhir yaitu peran bioteknologi dalam pembuatan beras berinsulin
untuk mengatasi masalah gula darah pada penderita diabetes. Dimana, beras insulin
dibuat dengan menyisipkan gen pada bakteri menghasilkan insulin ke tanaman padi.
Peristiwa ini disebut dengan transgenik. Transgenik artinya adalah memiliki materi
genetik (DNA) dari organisme lain. Jadi, tanaman transgenik itu merupakan tanaman
yang memiliki gen atau telah disisipi gen dari organisme lain, dan dapat pula disebut
sebagai Genetically Modified Organism (organisme yang termodifikasi secara
genetik).

Hal ini membuka wawasan baru lagi mengenai aplikasi rekayasa genetika
yang beragam seperti membuat tanaman hias yang dapat menyala saat malam hari.
Misalnya, pada bunga lotus yang hanya mekar pada malam hari. Sifat berpendar yang
akan diberikan ke bunga ini, diperoleh dari gen fluorosens pada ubur-ubur. Oleh
karena itu, penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan estetika pada tanaman hias
bunga lotus dengan membuatnya berpendar pada malam hari.
B. Rumusan Masalah
Rumusan masalah pada penelitian yaitu :
1. Bagaimana cara memasukkan gen fluorosens dari ubur-ubur ke bunga lotus?
2. Bagaimana metode yang digunakan?
3. Bagaimana cara mendeteksi bahwa gen yang diperoleh berhasil masuk ke
dalam sel tumbuhan.?
C. Tujuan Penelitian
Tujuan pada penelitian ini adalah :
1. Mengetahui cara memasukkan gen fluorosens dari ubur-ubur ke bunga lotus
2. Mengetahui dan memahami metode yang digunakan
3. Mengetahui cara mendeteksi gen yang diperoleh berhasil masuk ke dalam sel
tumbuhan.
II.

TINJAUAN PUSTAKA

1. Bioteknologi Molekular
Bioteknologi diartikan sebagai penerapan prinsip ilmu dan rekayasa dalam
pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari
makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang
dan jasa. Bioteknologi dibagi atas dua yaitu biotenologi konvensional dan
bioteknologi modern. Bioteknologi modern adalah bioteknologi yang menggunakan
teknik rekayasa genetika, seperti DNA rekombinan.

Teknologi DNA rekombinan (recombinant DNA technology) adalah suatu

metode untuk merekayasa genetik dengan cara menyisipkan (insert) gena yang
dikehendaki ke dalam suatu organisme ke dalam organisme lain dalam satu spesies
atau berbeda spesies. Teknologi DNA rekombinan bertujuan untuk mengubah sifat
alami suatu individu menjadi sifat yang dikehendaki oleh manusia. Pengetahuan
mengenai struktur dan fungsi DNA secara mendalam telah diterapkan untuk
kepentingan manusia melalui rekayasa genetika. Rekayasa genetika merupakan salah
satu metode penting yang memberi kontribusi pada pengembangan bioteknologi
modern. Salah satu ciri karakteristik bioteknologi modern adalah melibatkan rekayasa
biologi (teknobiologi). Saat ini,rekayasa genetika telah merambah pada semua
organisme yang meliputi: bakteri, tumbuhan maupun hewan. Organisme yang telah
disisipi gen dari organisme lain disebut transgenik (Nurcahyo,2009).

2. Tanaman transgenetik
Tanaman transgenik adalah tanaman yang telah disisipi (dengan sengaja) atau
memiliki gen asing dari spesies tanaman yang berbeda atau makhluk hidup
lainnya, atau adalah tanaman yang telah direkayasa genetiknya, dalam arti sifat asli
dari tanaman tersebut sudah tidak natural lagi..
Tanaman transgenik pertama kalinya yaitu bunga matahari yang disisipi gen
dari buncis (Phaseolus vulgaris) dibuat tahun 1983 oleh HerbertBoyer dan Stanley
Cohen. Pada tahun 1988 telah ada sekitar 23 tanaman transgenik, pada tahun 1989
terdapat 30 tanaman, pada tahun 1990 lebih dari 40 tanaman. Secara sederhana
tanaman transgenik dibuat dengan cara mengambil gen-gen tertentu yang baik pada

makhluk hidup lain untuk disisipkan pada tanaman, penyisipaan gen ini melalui suatu
vector (perantara) yang biasanya menggukan bakteri

Agrobacterium tumefeciens

untuk tanaman dikotil atau partikel gen untuk tanaman monokotil, lalu diinokulasikan
pada tanaman target untuk menghasilkan tanaman yang dikehendaki (Lindung, 2010)
3. Ubur-Ubur
Ubur-ubur adalah sejenis binatang laut yang termasuk dalam kelas
Scyphozoa. Tubuhnya berbentuk payung berumbai, dapat membuat gatal pada kulit
bila tersentuh. Rongga pada tubuh kelompok ubur-ubur disebut gastrovaskuler.
Lubang besar tempat keluarnya air disebut osculum. Larva ubur-ubur disebut planula.
Tercatat ada sekitar 1.800 jenis ubur-ubur. Ubur-ubur merupakan invertebrata(tak
bertulang belakang).
Jenis ubur-ubur yang paling berbahaya adalah dari kelompok Cubozoa.
Sengatan tentakelnya bisa menimbulkan kematian. Ubur-ubur yang paling mematikan
dari kelompok ini adalah ubur-ubur Irukandji, yang ukurannya kecil. Ubur-ubur ini
hidup di sekitar pantai Australia. Ubur-ubur memilki gen mengkodekan protein
berwarna hijau (GFP, green flourescent protein) yang telah digunakan secara luas
dalam penelitian transgenik. Keberadaan gen ini yang menyebabkan ubur-ubur dapat
berwarna pada malam hari di bawah laut. Gen semacam ini disebut sebagai gen
reporter yang bisa dimanfaatkan dalam pengembangan sistem promoter/enhanser
atau teknik transfer gen yang baru. Morfologi ubur-ubur sebagai berikut :
Kingdom
Filum
Kelas
Ordo

: Animalia
: Cnidarian
: Scyphozoa
: Stauromeduseae

Gambar 1. Ubur ubur

Spesies

: Aquorea Victoria L.

4. Bunga Lotus

Seroja atau lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) adalah spesies tumbuhan air
tahunan dari genus Nelumbo yang berasal dari India. Di Indonesia tanaman ini sering
kali disebut teratai (Nymphaea) walaupun sebenarnya keduanya tidak berkerabat.
Seroja memiliki tangkai bunga tegak dan bunganya tidak mengapung di permukaan
air, sebagaimana pada teratai. Seroja pernah dikenal dengan nama binomial
Nelumbium speciosum (Willd.) atau Nymphaea nelumbo.
Tangkai berbentuk tabung yang kosong di tengahnya untuk jalan lewat udara.
Daun terdapat di permukaan air, keluar dari tangkai yang berasal dari rimpang yang
berada di dalam lumpur pada dasar kolam, sungai, atau rawa. Tinggi tanaman sekitar
satu meter hingga satu setengah meter.
Daun tumbuh ke atas, tinggi di atas permukaan air. Daun berbentuk bundaran
penuh tanpa potongan, bergelombang di bagian tepi, dengan urat daun berkumpul ke
tengah daun. Diameter daun dapat mencapai 60 cm. Permukaan daun mengandung
lapisan lilin sehingga air yang jatuh ke permukaan daun membentuk butiran air.
Berbeda dengan teratai, bunga lotus mekar pada malam hari dan akan kuncup apada
siang hari. Berikut morfologi bunga lotus :
Kingdom

: Plantae

Divisi

: Magnoliophyta

Kelas

: Magnoliopsida

Ordo

: Proteales

Famili

: Nelumbonaceae

Genus

: Nelumbo

Spesies

: N. nucifera

Gambar 2. Nelumbo
nucifera

5. Isolasi DNA
Isolasi DNA adalah metode untuk mendapatkan asam deoksiribonukleat
dari suatu makhluk hidup. Isolasi DNA pertama kali dilakukan oleh ilmuwan
asal Swiss bernama Friedrich Miescher pada tahun 1869. Ia menemukan senyawa
asam yang mengandung nitrogen dan fosfat pada inti sel dari sel darah
putih. Senyawa ini diberi nama nuklein, namun pada tahun 1889 muridnya
yaitu Richard Altmann menamainya asam nukleat . Metode yang digunakan oleh
Miescher adalah alkalyne lysis untuk memecahkan sel dan mengisolasi DNA.
Menurut Wilson, Keith and John, (2010) Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA
untuk dianalisa atau dimanipulasi yang harus diisolasi terlebih dahulu dan murni
kandungannya.

Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai
organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan
bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan
menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang
digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure
sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan GeneJETTM Genomic
DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap
langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan.
Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan
kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan
digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif
lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.

6. Blot Southern
Blot Southern merupakan proses perpindahan fragmen DNA yang terpisah
secara elektroforesis dari gel ke membran. Prinsipnya adalah kapilaritas, dimana
bufer yang merupakan fase gerak diasumsikan akan membawa fragmen DNA dari
gel ke membran. Karena muatan DNA negatif sedangkan muatan membran positif
maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada membran. Membran yang
digunakan pada proses blot southern adalah membran nitroselulosa. Metode ini
ditemukan oleh seorang ahli biologi dari Inggris yang bernama Edward M.

Southern, yang mengembangkan prosedur ini pada tahun 1975 di Universitas

Edinburgh.
7. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR
(kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan
suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa
menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah
besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain
yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983
dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut.
Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular
karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.

8. Enzim Retriksi
Enzim Restriksi Endonuklease

merupakan

enzim yang memotong

bagian internal DNA yang bekerja secara spesifik (urutan tertentu), disebut
sebagai gunting biologi. Enzim Restriksi Endonuklease memotong DNA tepat
pada ikatan fosfodiester. Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong DNA pada
lokasi-lokasi spesifik yang mampu mengenali 4 8 urutan nukleotida, dimana
urutan DNA yang dikenali tersebut bersifat PALINDROME .Enzim restriksi yang
digunakan harus sama antara pemotongan plasmid dengan pemotong DNA

asing.Enzim restriksi diisolasi dari bakteri. Enzim restriksi biasanya terdapat

dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain yang melindungi DNA-nya
sendiri dari pemotongan, yaitu DNA-metil transferase (dnmt).

9. Kloning Gen
Kloning gen merupakan suatu terobosan baru untuk mendapatkan sebuah
gen yang mungkin sangat dibutuhkan bagi kehidupan manusia. Kloning gen
meliputi serangkaian proses isolasi fragmen DNA spesifik dari genom suatu
organisme, penentuan sekuen DNA, pembentukan molekul DNA rekombinan, dan
ekspresi gen target dalam sel inang. Kloning ialah suatu proses perbanyakan
fragmen gen target dengan mengintroduksi DNA rekombinan ke dalam suatu sel
inang. Teknologi kloning adalah suatu cara reproduksi yang menggunakan teknik
tingkat tinggi di bidang rekayasa genetika untuk menciptakan makhluk hidup
tanpa melalui perkawinan. Teknik reproduksi ini menjadi terkenal sejak
penemuan domba Dolly (Broker, 2005).
10. Enzim DNA Ligase
Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi untuk menyambung dua ujung
potongan DNA. Mengkatalisis pembentukan ikatan antara 3-OH dari satu untai
dan 5-PO4 dari untai DNA lain. Ligase bekerja lebih efisien pada ujung lancip
dibanding dengan ujung tumpul. Enzim DNA ligase bekerja dengan bantuan
kofaktor, yaitu NAD+ atau ATP. Jenis kedua enzim tersebut memerlukan kofaktor

yang berbeda, tetapi memiliki mekanisme katalitik yang sama. Enzim ligase yang
sering digunakan adalah DNA ligase dari E. Coli dan DNA ligase dari Fage T4.
11. Isolasi Protein
Isolasi protein adalah suatu cara memisahkan protein dari makromolekul
yang lain atau memisahkan protein dari protein lain yang tidak diinginkan. Secara
sederhana, proses dari isolasi protein konsepnya sama dengan isolasi DNA, hanya
saja isolasi protein menggunakan buffer lysis untuk melisiskan sel. Suatu teknik
isolasi dan identifikasi protein harus mempertimbangkan sifat-sifat fisik, kimiawi
dan kelistrikan suatu protein sedemikian rupa sehingga konformasi dan
aktifitasnya tidak berubah. Pada tahap awal isolasi, biasanya digunakan metode
yang memiliki daya pemisah terendah seperti pengendapan dengan ammonium
sulfat. Pengendapan ini dipengaruhi olah berbagai factor antara lain jumlah dan
posisi gugus polar, berat molekul, pH dan temperature larutan.

12. Western blot

Western Blot (WB) merupakan suatu teknik untuk menandai suatu protein
pada membran nitroselulosa, nilon, atau membran transfer lain setelah protein
tersebut terpisahkan melalui elektroforesis. Protein tersebut kemudian dapat
dideteksi melalui metode autoradiografi, pelabelan dengan senyawa-senyawa
fluoresen, pelabelan dengan, pelabelan dengan antibodi terikat protein, lektin atau
gen pengikat spesifik lainnya. Berdasarkan pengertian tersebut, WB dilakukan

melalui

beberapa

tahap.

Tahap

pertama,

elektroforesis.

Tahap

kedua,

elektrotransfer.Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil

elektroforesis ke membrane. Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel
daripada gel sehingga protein yang terblot pada membran dapat dideteksi dengan
cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme
dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi
sekunder (Attwood et al., 2006).

III.
METODE PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. Desain Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan 2 tahap yaitu :
1. Memasukkan gen fluorosens dari ubur-ubur ke bunga lotus
Langah-langkah yang mesti dilakukan pada tahap berikut :

Isolasi DNA
Elektroforesis
Polymerase Chain Reaction
(PCR)

Pemotongan DNA oleh enzim retriksi

Kloning Gen
Transformasi
Southern Blotting

2. Mendeteksi gen yang diperoleh berhasil masuk ke dalam sel tumbuhan.

Pendeteksian gen telah berhasil masuk ke dalam sel tumbuhan dapat
dilakukan melalui beberapa cara yaitu :
a. Mendeteksi DNA dengan metode southern blooting
b. Mengisolasi protein dari gen baru yang dihasilkan
c. Mendeteksi protein dengan metode western blotting
B. Pembahasan
1. Memasukkan gen fluorosens dari ubur-ubur ke bunga lotus
Penyisipan gen pada suatu tanaman membutuhkan proses yang sulit dan
panjang. Proses ini disebut dengan transgenik. Transgenik artinya adalah memiliki
materi genetik (DNA) dari organisme lain. Jadi, tanaman transgenik itu merupakan
tanaman yang memiliki gen atau telah disisipi gen dari organisme lain, dan dapat pula
disebut sebagai Genetically Modified Organism (organisme yang termodifikasi secara
genetik). Untuk menyisipkan sebuah gen pada sel tumbuhan, kita membutuhkan
vektor tertentu. Vektor adalah organisme yang berfungsi sebagai kendaraan pembawa
materi genetik yang akan disisipkan. Sel tumbuhan tidak memiliki plasmid seperti
bakteri sehingga pilihan vektor yang berpotensi untuk memasukkan gen ke dalam sel

tanaman juga terbatas. Sejauh ini, vektor terbaik untuk menyisipkan gen pada
tanaman adalah Agrobacterium tumefaciens. Hal ini karena bakteri tersebut memiliki
Ti-plasmid (Tumor Inducing Plasmid) yang dapat berintegrasi ke dalam DNA
tumbuhan.
2. Metode yang digunakan
Penelitain ini yang bertujuan untuk memasukkan gen green fluorosens protein
ke dalam sel tumbuhan bunga lotus melalui beberapa tahap diantaranya:
1. Isolasi DNA
DNA (Deoxyribonucleic acid) adalah polimer asam nukleat yang
tersusun secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang
diturunkan kepada jasad keturunannya. Pada organisme hewan dan tumbuhan
DNA terletak di dalam inti sel yang disebut nucleus. DNA berbentuk pita ganda
berpilin (double heliks) dan panjang membentuk untaian seperti tangga berpilin
yang tersusun atas rangkaian nukleotida (polinukleotida). Yang setiap nukleotida
disusun oleh senyawa gula ribose , gugus pospat dan basa nitrogen
Pada proses isolasi DNA, terdapat perbedaan kedua organisme
tersebut yang harus diperhatikan yaitu sel tumbuhan dinding sel sedangkan sel
hewan tidak memilikinya. Oleh karena itu isolasi DNA pada ubur-ubur (Aquorea
Victoria L.) Berikut merupakan diagram alir proses isolasi DNA :

Ubur-ubur (Aquorea Victoria L.)

-

digerus
ditambahkan larutan sodium dodecyl sulphate
(SDS)
ditambahkan kloroform
disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm

2.
Supernatan
-

ditambahkan isoamilalkohol dan enzim

RNAse
Endapan DNA
- disentrifugasi kembali pada kecepatan
6.000 rpm etanol
- ditambahkan
-- dibuang supernatan karna DNA berada pada
natan
Isolat DNA murni

Prinsip dasar

isolasi DNA dari jaringan adalah dengan memecah dan

mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yaitu DNA. Pada
tahap pelisisan, ubur-ubur digerus untuk

menghancurkan sel. Selanjutnya

ditambahan larutan penglisis, misalnya sodium dodecyl sulphate (SDS) berperan

dalam melisiskan membran sel. Larutan penglisis ini dapat merusak membran sel
dengan melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein
dan lemak pada membran membentuk senyawa lipid protein-deterjen kompleks.
Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik
dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu
ikatan kimia

Tahap berikutnya yaitu sentrifugasi. Tahap ini dilakukan untuk mengendapkan

protein, komponen fenolik, dan polisakarida sehingga dapat dipisahkan dengan
larutan DNA menggunakan larutan CIAA (Kloroform, isoamil alkohol). Setelah itu
tube disentrifuga selama 15 menit pada 12.000 rpm untuk mengendapkan molekul
kasar yang bercampur dengan DNA (dinding sel, protein, karbohidrat) serta
kloroform. Hasil yang diperoleh yaitu lapisan dari hasil sentrifugasi. Karena DNA
bersifat ringan, maka DNA berada di lapisan paling atas (supernatant). Lapisan kedua
berbentuk padatan, berisi material padat hasil lisis sel (debris) sehingga yang diambil
adalah lapisan yang berisi DNA. Kemudian larutan berisi DNA (supernatant)
ditambahkan isoamilalkohol berfungsi mendenaturasi protein sedangkan enzim
RNAse berfungsi melisiskan RNA dari ekstrak DNA tersebut.
Tahap berikutnya yaitu tabung di sentrifugasi kembali pada kecepatan 6.000
rpm selama 15 menit. Hasil yang didapat yaitu berupa supernatan yang bening dan
pelet (endapan DNA murni) yang berwarna putih terdapat pada dasar tabung dan
penambahan senyawa etanol. Kemudian supernatan tersebut dibuang karena DNA
berada pada bagian natan. DNA murni yang dihasilkan adalah DNA yang terbebas
dari campuran material dan komponen intraceluler yang mengandung larutan
kompleks berupa RNA, protein, lemak dan karbohidrat.
3. Elektroforesis DNA
Selanjutnya tahap elektroforesis. Tahap ini penting dilakukan karena
molekul DNA dan campurannya dipisahkan menjadi pita-pita ynag masing-masing

terdiri tas molekul DNA yang panjang. Elektroforesis adalah teknik pemisahan
komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya
dalam sebuah medan listrik.. Salah satu jenis elektroforesis yang digunakan untuk
elektroforesis DNA yaitu elektroforesis gel. Berikut proses kerja elektroforesis :

Gambar 3. Elektroforesis gel pada DNA

Prinsipnya berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif
(anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode),
sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub
negatif (anode). Migrasi DNA tersebut dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu
ukuran molekul DNA, konsentrasi gel, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori
gel, voltase, dan larutan buffer elektroforesis.
Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase
diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein.

Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan

poliakrilamida sebagai gel media. Gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan
dilakukan

penambahan running

buffer. Penambahan running

buffer dilakukan

dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan.

Running elektroforesis
menit. Kecepatan

dilakukan

migrasi

DNA

pada

tegangan

sangat

100

Volt

dipengaruhi

selama

oleh

30

tegangan

elektroforesis. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan
dengan fragmen DNA yang kecil .
Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA hasil amplifikasi lewat proses
PCR dengan loading buffer yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke
dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah
berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru.

Proses pemindahan

dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar
campuran DNA dengan loading buffer tidak bergabung ke bagian well yang
lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO4) sehingga
diharapkan akan bergerak menuju kutub positif .

Pewarna dalam elektroforesis ada dua yaitu EtBr dan gel red. EtBr merupakan
pewarna yang umum digunakan. Pewarna tersebut menghasilkan warna terang
apabila

terpapar

sinar

UV. Pewarna

ini

digunaan

untuk

mempermudah

memvisualisasikan DNA
4. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR
(kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan
suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa
menggunakan organisme. Dengan

teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam

jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik
lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun
1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya
tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi
molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 2030
kali siklus yang tergantung oleh kebutuhan berarti memperbanyak sekuens DNA
spesifik agar tidak menggunakan ubur-ubur secara berlebihan . Setiap siklus
terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu
siklus, diantaranya :

Gambar 4. Ilustrasi proses PCR

1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada
suhu tinggi, 9496 C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA

menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini
dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA
terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi
templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 12 menit.
2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA
templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara
4560 C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat
menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di
sembarang tempat. Durasi tahap ini 12 menit.
3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis
DNA polimerase (ditunjukkan oleh P pada gambar) yang dipakai. Dengan
Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 C. Durasi tahap
ini biasanya 1 menit.
Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan
renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain.
Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai.
Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara
eksponensial.
5. Pemotongan DNA menggunakan Enzim Retriksi
Sebelum gen green fluorosens protein pada ubur-ubur dikloning terlebih
dahulu dilakukan pemotongan bagian internal DNA yang diperoleh yang bekerja

secara spesifik (urutan tertentu) menggunakan enzim retriksi . Enzim Restriksi

Endonuklease merupakan enzim yang memotong bagian internal DNA yang
bekerja secara spesifik (urutan tertentu), disebut sebagai gunting biologi. Enzim
Restriksi Endonuklease memotong DNA tepat pada ikatan fosfodiester. Enzim
restriksi yang digunakan harus sama antara pemotongan plasmid dengan pemotong
DNA asing.
Cara kerja enzim retriksi melalui beberapa tahap, sebagai berikut :

Gambar 5. Cara Kerja Enzim Retriksi

1. Enzim restriksi menghidrolisis ikatan fosfodiester yang menghasilkan gugus
3 hidroksil (OH) dan gugus 5 fosfat (PO 4-) yang berbentuk asimetris atau
sticky ends dan bentuk simetris atau blunt ends
2. Enzim restriksi dapat melakukan scanning pada untaian molekul DNA. Jika
tidak menemukan restriction sites yang spesifik (mekanisme slidding), maka
enzim akan melakukan pergerakan di sepanjang lekukan DNA. Namun, enzim
restriksi endonuklease akan mengubah konformasinya ketika mengenali
daerah restriction sites yang spesifik dan sisi katatiliknya bekerja untuk
memotong ikatan fosfodiester.

3. Enzim retriksi bekerja dengan bantuan kofaktor , contoh Mg 2+, sehingga

dalam prosedur percobaannya sekuens DNA terkadang diberi MgCl. Kation
bivalen Mg2+ dari MgCl tersebut berfungsi dalam proses pemotongan plasmid
yang dibutuhkan untuk meningkatkan aktivitas enzim restriksi .
Melalui proses ini, diharapkan dapat diperoleh DNA dari gen gfp dari uburubur sebagai DNA sisipan pada proses pengkloningan.
6. Kloning Gen
Tahap selanjutnya yaitu kloning gen. Diketahui proses sebelumnya
diperoleh gen penghasil nyala hijau pada ubur-ubur atau gen green fluorosens
protein (gfp) maka, gen ini siap di perbanyak melalui proses kloning gen. Kloning
merupakan proses perbanyakan fragmen gen target dengan mengintroduksi DNA
rekombinan ke dalam suatu sel inang. Teknologi kloning adalah suatu cara
reproduksi yang menggunakan teknik tingkat tinggi di bidang rekayasa genetika
untuk menciptakan makhluk hidup tanpa melalui perkawinan.
Teknik penyisipan sebuah gen hewan pada sel tumbuhan, kita
membutuhkan vektor tertentu. Vektor adalah organisme yang berfungsi sebagai
kendaraan pembawa materi genetik yang akan disisipkan. Sel tumbuhan tidak
memiliki plasmid seperti bakteri sehingga pilihan vektor yang berpotensi untuk
memasukkan gen ke dalam sel tanaman juga terbatas. Sejauh ini, vektor terbaik
untuk menyisipkan gen pada tanaman adalah Agrobacterium tumefaciens. Hal ini
karena bakteri tersebut memiliki Ti-plasmid (Tumor Inducing Plasmid) yang
dapat berintegrasi ke dalam DNA tumbuhan. Proses kloning gen gfp ubur-ubur ke
tanaman bunga lotus sebagai berikut :

Gambar 6. Ilustrasi penyipan gen ubur-ubur ke tanaman bunga lotus

Berikut ini adalah langkah-langkah dalam menyisipkan gen pada suatu sel tanaman :
1. Ti-Plasmid yang terdapat pada bakteri Agrobacterium dikeluarkan dari sel
bakteri Agrobacterium kemudian dipotong dengan menggunakan enzim
endonuklease restriksi.
2. Sisipkan gen green fluorosens protein (gfp) dari ubur-ubur yang peroleh pada
plasmid dan rekatkan dengan enzim DNA ligase.
3. Masukkan kembali plasmid yang sudah disisipi gen ke dalam bakteri
Agrobacterium.
4. Plasmid

yang

Agrobacterium.

sudah

tersisipi

gen

akan

terduplikasi

pada

bakteri

5. Selanjutnya, bakteri akan masuk ke dalam sel tanaman dan mentransfer gen.
6. Kemudian, sel tanaman akan membelah. Tiap-tiap sel anak akan memperoleh
gen baru dalam kromosom dari sel tanaman dan membentuk sifat/karakteristik
yang baru (yang sesuai dengan gen yang disisipkan).
7. Tranformasi
Sementara itu, proses transformasi gen pada plasmid ke sel tanaman
dan proses perbanyakan (multiplikasi) sel-sel tanaman sebagai berikut :

Gambar 7. Ilustrasi transformasi gen pada plasmid ke tanaman

Berdasarkan gambar di atas diketahi bahwa bakteri yang telah
terintegrasi dengan Ti-plasmid akan dimasukkan ke dalam potongan kecil dari
sel tanaman/eksplan (misalnya potongan kecil dari daun). Metode untuk
memasukkan DNA plasmid yang terdapat pada sel bakteri ke dalam sel
tanaman ini disebut dengan transformasi. Di sini, gen pengkode protein

tertentu yang sudah bergabung pada Ti Plasmid akan tersisip pada kromosom
tanaman.
Selanjutnya, eksplan yang sudah memiliki gen tertentu tersebut akan
dikulturkan/dibiakkan secara in vitro (di luar tubuh tanaman, misalnya pada
cawan petri). Eksplan dari tanaman tersebut akan tumbuh menjadi kalus
(kumpulan sel) yang dapat diinduksi untuk membentuk batang dan akar.
Kalus ini akan tumbuh menjadi plantlet (tanaman kecil). Plantlet kemudian
akan tumbuh menjadi individu tanaman transgenik yang bisa ditanam di
tanah.
3. Mendeteksi gen yang diperoleh berhasil masuk ke dalam sel tumbuhan.
Mendeteksi gen pengkode protein tertentu yang kita inginkan sudah
masuk atau belum ke dalam suatu tanaman, kita membutuhkan tes/ujicoba seperti
melalui metode pendeteksian DNA (southern blotting), isolasi protein dan
pendekteksian protein (western blotting)
Southern Blotting
Metode ini ditemukan oleh seorang ahli biologi dari Inggris yang bernama
Edward M. Southern, yang mengembangkan prosedur ini pada tahun 1975 di
Universitas Edinburgh. Southern blotting ialah sebuah metode yang sering
digunakan dalam bidang biologi molekular untuk menguji keberadaan dari suatu
sekuen DNA dalam suatu sampel DNA. Tahap-tahap southern blotting yaitu :

Isolasi DNA dan

pemotongan DNA

Fragmentasi DNA
dengan elektroforesis
gel

Deteksi DNA

Transfer DNA ke
Membran (Blot)

Hibridisasi DNA

Gambar 8. ilustrasi proses southern blooting

Tahap pertama ialah mengisolasi DNA dari bunga lotus yang telah disisipkan
gen green fluorosens protein dari ubur-ubur dan

dipotong menggunakan enzim

retriksi (endonuklease retriksi) yang bersifat spesifik terhadap DNA. Selanjutnya

fragemntasi DNA yang terbentuk dielektroforesis gel. Tahap ini merupakan tahap
dimana fragmen-fragmen dari DNA akan terpisah berdasarkan ukuran berat
molekulnya. Berdasarkan prinsip elektroforesis, fragmen DNA yang ukuran berat

molekulnya lebih kecil akan lebih cepat bergerak dari kutub negatif kekutub positif
dibandingkan dengan fragmen DNA dengan berat molekul lebih besar.
Selanjutnya yaitu proses denaturasi DNA dilakukan dengan merendam gel
dalam larutan denaturan (NaOH ). NaOH bersifat basa sehingga dapat menyebabkan
rusaknya ikatan hidrogen antar untai DNA. Ikatan hidrogen antar untai DNA yang
putus menyebabkan struktur DNA yang semula double heliks menjadi DNA single
strand. DNA yang telah diperoleh kemudian ditransfer ke membran nitroseluloasa,
tahap inilah yang disebut dengan blotting.
Tahapan transfer DNA ke membran nitroselulosa yang berdasarkan pada
prinsip kapilaritas. Kapilaritas adalah peristiwa naiknya zat cair pada pembuluh,
celah atau pori-pori kecil. Fragmen DNA yang telah terjiplak pada membran
nitroselulosa kemudian dipanaskan pada suhu 60 oC kemudian membran diberi radiasi
UV agar terbentuk ikatan kovalen dan permanen antara pita-pita DNA dengan
membran. Tahap berikutnya adalah hibridisasi DNA. Hibridisasi DNA adalah proses
pembentukan molekul double helix dari single strand DNA probe dan single strand
DNA target. Tahap ini terjadi ketika membran nitroselulosa direndam dalam larutan
yang berisi probe DNA Ss* (diberi radioisotop). Nah, setelah melalui proses ini,
barulah DNA dapat dideteksi yang menggunakan pelacak/probe. Probe biasanya
merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik
radionukletida.Pada tahap deteksi DNA digunakan Autoradiogram untuk melihat
lokasi sinyal DNA. Apabila DNA yang diinginkan dalam hal ini gen gfp(gen yang

memancarkan sinar) pada ubur-ubur dapat dideteksi maka gen tersebut telah berhasil
masuk ke dalam bunga lotus.
Isolasi Protein
Isolasi protein adalah suatu cara memisahkan protein dari makromolekul yang
lain atau memisahkan protein dari protein lain yang tidak diinginkan. Secara
sederhana, proses dari isolasi protein konsepnya sama dengan isolasi DNA, hanya
saja isolasi protein menggunakan buffer lisis untuk melisiskan sel. Adapun proses
isolasi protein dapat dilihat pada diagram alir berikut :
Bunga Lotus yang telah disisipkan gen gfp ubur-ubur
-

digerus
ditambahkan
buffer
untuk
mempertahankan
agar
kondisi
komponen sel tidak berubah
dilisiskan
dinding
selnya
menggunakan deterjen
ditambahkan
kelator
selama
penggerusan
bertujuan
untuk
menghilangkan
ion-ion
aktivator
enzim protease
ditambahkan ammonium sulfat untuk
mengendapkan protein
disentrifuga

Supernatan yang berisi protein

-

Dimurnikan menggunakan
metode kromatografi kolom
penukaran ion

Isolat Protein

Setelah isolat protein diperoleh maka, protein inilah yang akan dideteksi
keberadaannya melalui metode western blotting.
Western Blotting
Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil
elektroforesis ke membran. Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel
daripada gel sehingga protein yang terblot pada membran dapat dideteksi dengan
cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme
dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi
sekunder. Tujuan dilakukannya western blotting, yaitu :
a. Mengetahui keberadaan & berat Molekul protein sampel pada campuran
b. Membandingkan reaksi silang antar protein
c. Mempelajari modifikasi protein selama sintesis
Teknik ini terdiri dari 3 tahap, diantaranya sebagai berikut :

Gambar 9. Ilustrasi proses western blooting

1. Elektroforesis

Elektroforesis adalah pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul

dalam suatu tegangan listrik tertentu. Proses kerjanya ialah :

Gambar 10. Proses kerja elektroforesis protein

Dalam elektroforesis, sampel yang mengandung protein biasanya dicampur
dengan SDS (sodium dodecyl sulfat). Muatan negatif SDS tersebut mengganggu
kestabilan protein, sehingga protein mengalami denaturasi. Suatu protein multimer
juga akan terurai menjadi monomer penyusunnya. Sampel dengan protein rantai
polipeptida lurus tersebut dimasukkan dalam suatu membran poliakrilamid yang
dialiri arus listrik. Dalam gel poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita-pita yang
merupakan protein-protein yang telah terpisah berdasarkan berat molekul.

2. Elektrotransfer
Terdapat 2 cara elektrotransfer yang dapat digunakan yaitu :

a. Blotting semi kering menggunakan kertas saring yang telah dibasahi

dengan buffer transfer
b. Blotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara gel
poliakrilamid dan gel transfer, tetapi kedua gel tersebut diimpitkan dan
direndam dalam buffer transfer.
3. Deteksi
Berdasarkan penggunaan antibodi primer dan antibodi sekunder, ada
dua metode deteksi, yaitu:
a. Metode langsung, menggunakan antibodi primer yang telah terkonjugasi
dengan molekulmarker. Antibodi primer berfungsi mengikat protein target
b. Metode tidak langsung, menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder.
Antibodi sekunder berfungsi mengikat antibodi primer dan terkonjugasi
dengan molekul penanda. Molekul penanda yang umum digunakan
diantaranya adalah enzim alkalin fosfatase (AP), enzim horsedish peroksidase
(HRP), immunogold, dan 125I

IV.

KESIMPULAN

Berdasarkan rumusan masalah dan pembahasan , maka dapat disimpulkan

bahwa :
1. Memasukkan gen fluorosens dari ubur-ubur ke bunga lotus dapat dilakukan
dengan menyisipkan sebuah gen pada sel tumbuhan, melalui vektor berupa

organisme yang berfungsi sebagai kendaraan pembawa materi genetik yang

akan disisipkan yaitu Agrobacterium tumefaciens
2. Metode yang digunakan yaitu isolasi DNA, elektroforesis, PCR, pemotongan
DNA oleh enzim retriksi, kloning gen dan transformasi gen.
3. Mendeteksi bahwa gen yang diperoleh berhasil masuk ke dalam sel tanaman
bunga lotus dilakukan dengan metode southern blooting untuk mendeteksi
DNA serta isolasi protein dan western blotting untuk mendeteksi protein.