Anda di halaman 1dari 19

Deteksi Asam Nukleat

Meidina Sekar Nadisti (1406553045)

Abstrak
Asam nukleat merupakan makromolekul yang tersusun dari polimer nukleotida. Asam
nukleat memiliki fungsi utama dalam tubuh yaitu antara lain sebagai materi genetik dan juga
koenzim. Asam nukleat yang berperan sebagai materi genetik adalah DNA dan RNA. Deteksi
Asam Nukeat ialah rangkaian teknik analisis identifikasi DNA dan RNA yang terbagi menjadi
deteksi kulitatif dan deteksi kuantitatif. Analisis kualitatif asam nukleat bertujuan untuk mengetahui
susunan genetik meliputi bagaimana karakteristik yang dihasilkan dari sample uji. Analisis
Kualitatif asam nukleat meliputi Elektroforesis Gel Agrarosa, Hibridisasi In Situ; Flourence dan
Genomic, Restriction Fragment Length Polymorphom, Pewarnaan; Sederhana, Gram, Tahan
Asam, Spora dan Granula, Ligase Chain Reaction dan Sequencing. Analisis Kuantitatif pada asam
nukleat merupakan analisis yang didasarkan pada perolehan data yang bersifat numerik. Analisis
kuantitatif asam nukleat meliputi Polymerasi Chain Reaction, Micro Array, Serial Analysis of Gene
Expression, Spektroskopi UV-VIS, Differential Dispay dan Expressed Sequence Tag.
Kata Kunci : Elektroforesis Gel Agrarosa, Hibridisasi In Situ, RFLP, Pewarnaan, LCR,
Sequencing, PCR, Micro Array, SAGE, Spektroskopi, Differential Display dan EST

1. Analisis Kualitatif
Analisis Kualitatif asam nukleat meliputi Elektroforesis Gel Agrarosa, Hibridisasi In Situ;
Flourence dan Genomic, Restriction Fragment Length Polymorphom, Pewarnaan; Sederhana,
Gram, Tahan Asam, Spora dan Granula, Ligase Chain Reaction dan Sequencing.
1.1 Elektroforesis Gel Agrarosa
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu
makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis
merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi
molekuler (Magdeldin, 2012).
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin
digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis
(serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona.
Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan
suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan
listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010)
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik
ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju
kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Magdeldin,
2012). Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif
(anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub
negatif (katoda) (Klug and Cummings, 1994).
Elektroforesis gel dapat digunakan untuk memisahkan asam nukleat berdasarkan
ukurannya di dalam agar atau gel poliakrilamida. Metode ini dapat memisahkan pecahan-pecahan
asam nukleat dengan ukuran 20bp hingga 20 kb. Gel agarose ideal digunakan untuk pemisahan

DNA, produk PCR, dan gen DNA atau RNA sebelum dilakukan kloning, pengurutan (sequencing),
Southern atau Northern Blotting. Gel poliakrilamida dapat digunakan untuk elektroforesis gel
poliakrilamida atau PAGE.
Semua teknik elektroforesis membutuhkan arus listrik untuk menggerakkan molekul
bermuatan melalui matriks atau gel. Pada elektroforesis setiap makromolekul, prinsipnya molekul
yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat dan karena itu akan lebih jauh pada gel. Asam nukleat
yang akan dianalisis dimasukkan ke dalam gel agarose. Gel agarose tersebut akan berperean
sebagai matrix untuk menampung dan memisahkan molekul-molekul target. Gel tersebut
dicelupkan dalam ruang/peralatan elektroforesis beserta larutan penyangga yang memiliki arus
listrik. Larutan penyangga dibutuhkan untuk meminimalisir perubahan PH yang diakibatkan
medan listrik dan untuk mencegah gel menjadi terlalu panas akibat adanya arus listrik.

Gambar 1. Ilustrasi proses elektroforesis


(sumber: cdn.intechopen.com)
Langkah-langkah elektroforesis:

DNA dipotong-potong dengan enzim restriksi sesuai dengan recognition site yang
diinginkan.
Sampel kemudian diletakkan dalam media agar. Media agar yang digunakan adalah
media agarose dan poliakrilamid.
Sampel diletakkan pada kutub negatif sumbu-sumbu agar. Sampel diberi pemberat
berupa larutan buffer seperti polietilenglikol atau gliserin, bromofenol biru dan
aquades agar dapat masuk ke gel dengan baik.
Gel kemudian dialiri listrik dan sampel DNA akan bergerak menuju kutub positif.
Semakin panjang rantai DNA maka semakin banyak pula waktu yang dibutuhkan untuk
menuju kutub positif.
Kemudian sampel diberi warna (staining) agar dapat terlihat jelas.

Dalam metode elektroforesis, dibutuhkan pewarna untuk memudahkan penampakan


molekul asam nukleat. Pewarna ini dibutuhkan karena molekul asam nukleat tidak memiliki warna.
Terdapat beberapa pewarna yang dapat digunakan, beberapa diantaranya adalah bromophenol
blue dan ethidium bromida. Pewarna bromophenol blue biasa digunakan untuk memonitor

pergerakan molekul di dalam gel. Pewarna ethidium bromida merupakan pewarna fluoresens yang
digunakan untuk proses staining pada DNA di gel agarose dan gel poliakrilamida.

1.2 Hibridisasi In Situ


Metode hibridisasi asam nukleat dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan DNA dari
patogen dalam spesi klinis dan untuk mengetahui letak gen spesifik dalam sel. Hibridisasi DNA
merupakan metode atau teknik yang memanfaatkan kemampuan asam nukleat untuk membentuk
molekul dengan dua rantai yang stabil ketika dua rantai tunggal dengan basa yang komplementer
digabungkan dalam kondisi yang sesuai.
Proses pertama yang terdapat dalam proses hibridisasi adalah denaturasi. Proses
denaturasi dilakukan dengan cara memanaskan larutan yang berisi DNA pada suhu 100C atau
degan mengubah larutan tersebut dengan pH yang sangat tinggi (pH 13). Apabila hal tersebut
dilakukan, maka pasangan basa komplementer terdiri dari dua rantai/pita yang secara normal
membentuk double helix akan terpisah satu sama lainnya dan struktur double helix tersebut akan
terdisosiasi secara cepat membentuk dua rantai tunggal.
Setelah proses denaturasi berlangsung, dua rantai tunggal DNA kemudian
diletakkan/dilekatkan ke sebuah lembaran padatan seperti nitroselulosa atau membran nilon.
Untuk mengidentifikasi DNA target, sebuah molekul DNA atau RNA rantai tunggal yang telah
diketahui struktur basanya, biasa disebut dengan probe, ditambahkan ke membran dalam larutan
buffer. Hal tersebut memungkinkan pembentukan ikatan hidrogen atara basa yang saling
komplementer dari DNA target dan probe. Probe memiliki ukuran dengan panjang berkisar antara
15 hingga ribuan nukleotid. Probe (dikatakan seperti itu karena digunakan untuk mencari sekuens
DNA) diikatkan dengan reporter group, yaitu penanda kimia atau radioaktif, untuk memungkinkan
terjadinya pendeteksian. Hibridisasi menggunakan DNA probe sangatlah sensitif dan selektif
hingga dapat mendeteksi satu DNA sequence komplementer diantara ribuan yang lainnya.
Setelah probe berikatan dengan DNA target, kemudian dilakukan pemisahan/pembuangan
probe yang tidak bereaksi dengan DNA target dengan cara mencuci atau membilasnya dalam
larutan buffer. Setelah pembilasan dilakukan, hal yang tersisa di atas nitroselulosa adalah DNA
target dan molekul probe yang telah melekat ke sekuens komplementer di DNA target membentuk
hybrid yang stabil.
Hibridisasi dari DNA target dan probe dideteksi oleh pengujian terhadap reporter group
yang menempel pada probe. Jika reporter group terdeteksi, artinya hibridisasi telah terjadi. Jika
tidak ada reporter group yang terdeteksi, maka dapat diasumsikan bahwa molekul target tidak
memiliki sequences yang komplementer terhadap yang ada pada probe, dan itu menandakan
bahwa gen atau segmen DNA yang dicari tidak ada dalam sampel.

Gambar 2. Hibridisasi asam nukleat


(sumber: classes.midlandstech.edu)
Berdasarkan objek pengamatannya, hibridisasi dibedakan menjadi
1.2.1

Flourence

Metode ini menggunakan probe yang mengandung komponen berflouresen. Komponen ini
dapat berpendar jika dikenakan sinar UV sehingga lokasi gen yang dicari dapat diketahui. Adapun
probe yang digunakan hanya berupa potongan asam nukleat pendek untuk gen jenis tertentu saja.

Gambar 3. Fluoresence In Situ Hybridization


(sumber: abnova.com)
1.2.2

Genomic

Prinsip dasarnya hampir sama dengan FISH, hanya saja komponen yang menjadi probe
adalah keseluruhan genom DNA dari suatu spesies. Metode ini digunakan untuk memeriksa
penyebaran genomic DNA interspesies dan organisasi sekuensnya. Dewasa ini, CGH adalah
sebuah metode yang umum digunakan dalam bidang perawatan reproduksi untuk memastikan
kualitas dari sel telur atau embrio. Tindakan ini biasanya dilakukan dalam pemeriksaan bayi,
mendiagnosis penundaan perkembangan dalam anak-anak, dan juga untuk menganalisa
beberapa macam penyakit, seperti tumor jinak.

Gambar 4. Comparative Genomic Hybridization


(sumber: www.breenlab.org)

Prinsip dasar CGH adalah dengan membandingkan sampel susunan genetis denga
referensi dari organisme yang sama. Sebuah susunan genetis teridiri dari serangkaian gen yang
menyimpan semua informasi yang diperlukan untuk membuat organisme baru. Jika dua sampel
digabungkan dengan proses hibridisasi, para peneliti dapat menentukan kromosom mana yang
berduplikasi atau terhapus. Hasil dari pengujian ini kemudian akan memberikan indikasi ada atau
tidaknya sebuah penyakit atau kelainan dalam tubuh seseorang.
1.3 Metode RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphom)
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) merupakan perbedaan pada homolog
urutan DNA yang dapat dideteksi dengan menggunakan adanya perbedaan fragmen DNA yang
telah dipotong dengan menggunakan enzim endonuklease tertentu. RFLP digunakan sebagai
penanda molekular karena spesifik untuk setiap tunggal atau kombinasi dari enzim restriksi.
Aplikasi dari RFLP dapat digunakan untuk pemetaan genom, genome typing tes paternitas,
forensik dan diagnostik hereditas penyakit. Tahapan RFLP meliputi 4 tahapan yaitu, isolasi DNA,
pemotongan DNA dengan enzim restriksi endonuklease, elektroforesis hasil pemotongan DNA dan
southern blot
1.4 Pewarnaan
Staining adalah metode identifikasi DNA atau RNA dengan cara menysipkan zat yang
dapat mengeluarkan warna kepada DNA atau RNA tersebut. Karena DNA atau RNA tidak dapat
kita lihat dengan mata telanjang, maka sebenarnya tujuan dari pemberian warna (staining)
tersebut berfungsi untuk mengetahui keberadaan(eksistensi) atau lebih spesifiknya letak DNA atu
RNA yang sedang kita uji. Zat-zat yang biasa digunakan dalam staining adalah

Etidium Bromida

Etidium bromida merupakan pewarna yang paling umum digunakan untuk


memvisualisasikan DNA. Pewarna ini dapat digunakan dalam gel, baik pada larutan penyangga
elektroforesis ataupun pada gel. Molekul-molekul pewarna ini menempel pada rantai DNA dan
bersifat fluoresens dia bawah cahaya UV. Namun etidium bromida bersifat karsinogen, karena itu
penggunaannya harus ditangani dengan baik.

Gambar 5. Gel Stained dengan Etidium Bromida


(sumber: www.edvotek.com)

SYBR Gold

Pewarna SYBR Gold dye digunakan untuk DNA rantai tunggal, rantai ganda, atau RNA.
SYBR Gold merupakan salah satu alternatif pewarna etidium bromida dan dinilai lebih sensitif
daripada pewarna etidium bromida. Tingkat fluoresens pewarna SYBR Gold di bawah sinar UV

1000 kali lebih tinggi daripada etidium bromida saat berikatan dengan asam nukleat. Pewarna ini
dapat juga digunakan pada gel formaldehida.

SYBR Green

Pewarna SYBR Green I dan II dapat berikatan dengan DNA dan berpotensial sebagai
mutagen, karena itu pewarna ini harus ditangani dengan hati-hati. SYBR Green I lebih cocok untuk
digunakan pada DNA rantai ganda, sedangkan SYBR Green II lebih cocok digunakan untuk DNA
rantai tunggal or RNA.

SYBR Safe

SYBR Safe merupakan pewarna yang dirancang agar menjadi pewarna yang lebih aman
daripada pewarna etidium bromida dan pewarna SYBR lainnya. Pewarna ni tidak bersifat beracun
dan aman untuk dibuang langsung ke dalam sistem pembuangan limbah. Pewarna SYBR Safe
dapat digunakan dengan blue-light transillluminator yang mengakibatkan lebih sedikit kerusakan
terhadap DNA yang diamati dan lebih efisien untuk proses kloning selanjutnya.

Eva Green

Eva Green adalah pewarna hijau-fluoresens yang digunakan pada PCR (Polymerase Chain
Reaction). Selain itu, pewarna ini juga cocok digunakan untuk gel yang memiliki titik leleh yang
rendah. Pewarna Eve Green bersifat sangat stabil di dalam suhu tinggi dan memiliki tingkat
fluoresens yang tinggi saat berikatan dengan DNA. Pewarna Eva Green juga dinilai memiliki
tingkat toksisitas yang rendah.

Berdasarkan pewarnaannya pada bakteri, staining dapat dibedakan menjadi:


1.4.1

Sederhana

Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat
bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai
macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam
zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).
Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut.
Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara
umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik),
ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).
1.4.2

Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia
dan fisik dinding sel mereka. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan
menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan
Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat
semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna
untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel
mereka.

Gambar 6. Uji Gram pada Bakteri


(sumber: infoskep.com)

1.4.3

Tahan Asam

Bertujuan untuk mempelajari dasar dasar kimiawi pada reaksi tahan asam dan kinerja
prosedur pewarnaan tahan asam untuk membedakan bakteri tahan asam dan tidak tahan asam.
Pemanasan akan membantu penyerapan zat warna utama (karbol fuchsin) melalui pemberian
larutan pemucat (asam alkohol) bakteri tahan asam tetap berwarna merah sedangkan pada
bakteri tidak tahan asam zat warna utama akan luntur sehingga pada penambahan warna kedua
(Methylen blue) bakteri akan menyerap zat warna tersebut (biru).
1.4.4

Spora

Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik
pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.
Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endospores, perlu dilakukan
pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora, seperti halnya pada
pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa
menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium.

Gambar 7. Pewarnaan Spora


(sumber: www.microbiologyinfo.com)
1.4.5

Granula

Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin
bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Neisser Stain membedakan sel bacteria dan fillamen.
Tes positif terhadap neisser akan berwarna ungu, sementara negatif akan berwarna kuning.

1.5 Ligase Chain Reaction (LCR)


Reaksi berantai ligase (LCR) adalah metode amplifikasi DNA. Yang sudah diketahui, lebih
dikenal sebagai PCR melakukan amplifikasi dengan polimerisasi nukleotida, sementara LCR
menggunakan asam nukleat sebagai probe. Untuk masing-masing dua untai DNA, dua probe
parsial diikat untuk membentuk satu; dengan demikian, LCR menggunakan dua enzim yaitu
polimerase DNA (digunakan untuk amplifikasi template awal dan kemudian tidak aktif) dan ligase
DNA termostabil. Setiap siklus menghasilkan dua kali lipat dari molekul asam nukleat sasaran.
Keuntungan utama dari LCR adalah spesifisitas lebih besar dibandingkan dengan PCR.

Gambar 8. Ligase Detection Reaction


(sumber: p53.free.fr)
1.6 Sequencing
Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang relatif
pendek. Pengurutan (sequencing) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetik dari
molekul DNA.
Ada dua metode yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA. Metode MaxamGilbert dan Metode Sanger. Kedua metode tersebut menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan
panjang bervariasi, yang satu sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal. Dari fragmenfragmen tersebut kita dapat menarik kesimpulan mengenai sequence asam nukleat molekul DNA
yang diperiksa. Teknik yang digunakan adalah gel-gel poliakrilamid pendenaturasi (denaturing
polyacrylamide gels). Gel agarosa dapat memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan
panjang 30-50 basa, sedangkan gel poliakrilamid dapat memisahkan molekul-molekul DNA
dengan perbedaan panjang satu basa. Gel-gel pendenaturasi menyebabkan molekul DNA menjadi
beruntai tunggal dan tetap dalam keadaan seperti itu sepanjang proses elektroforesis. Gel
pendenaturasi mengandung urea dan dijalankan dengan suhu yang ditinggikan. Kedua hal
tersebut mendorong terjadinya pemisahan kedua rantai molekul DNA.

1.6.1

Maxam Gilbert

Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang dikembangkan
oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang

akan disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif
atau suatu nukleotida pada ujung 3. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA
untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan
dalam dua tahap.
Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin.
Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen DNA
yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan
kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G,
hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T
sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen,
masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.

Gambar 9. DNA Sequencing


(sumber: biomine.skelleftea.se)
1.6.2

Sanger

Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA
polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk
menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP
dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2
gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH
pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP
disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut
tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya
adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP.

10

Gambar 10. Sanger Sequencing


(sumber: abmgood.com)
Sekuensi DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah.
Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada
masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi
akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam
tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3nya
selalu berakhir dengan basa yang sama.

1.6.3

Next Generation

Gambar 11. Next Generation Sequencing


(sumber: circgenetics.ahajournals.org)
Generasi sekuensing baru menggunakan pendekatan fundamental berbeda dari metode
Sanger klasik. Ia memanfaatkan sequencing oleh sintesis teknologi (SBS) - pelacakan
penambahan nukleotida yang dicap sebagai rantai DNA lalu disalin secara massal paralel.
Next-gen sequencing menghasilkan massa DNA dengan urutan data yang lebih kaya dan
lebih lengkap daripada yang dibayangkan dengan Sanger sequencing. sistem sequencing Illumina
dapat memberikan data output mulai dari 300 kilobases hingga 1 terabyte dalam menjalankan
tunggal, tergantung pada jenis instrumen dan konfigurasi.

1.6.4

Single Molecule

Single molecule real time sequencing (SMRT) adalah metode sekuensing DNA molekul
tunggal yang diparalelkan. Molekul tunggal real time sequencing menggunakan nol-modus
Waveguide (ZMK). Sebuah enzim DNA polimerase tunggal ditempelkan di bagian bawah ZMW
dengan satu molekul DNA (sebagai template). ZMW adalah struktur yang menciptakan volume
pengamatan yang berukuran kecil sehingga bisa untuk mengamati hanya nukleotida tunggal DNA
yang dimasukkan oleh polimerase DNA.

11

Masing-masing dari empat basa DNA melekat ke salah satu dari empat pewarna
fluorescent yang berbeda. Ketika nukleotida dimasukkan oleh polimerase DNA, tag neon dimatikan
dan berdifusi keluar dari wilayah pengamatan ZMW mana fluoresensi yang tidak lagi diamati.
Sebuah detektor mendeteksi sinyal neon dari penggabungan nukleotida, dan basis panggilan
dibuat sesuai dengan fluoresensi sesuai pewarna.

Gambar 12. Single Molecule Sequencing


(sumber: www.sciencedirect.com)

12

2. Analisis Kuantitatif
Analisis Kuantitatif pada asam nukleat merupakan analisis yang didasarkan pada
perolehan data yang bersifat numerik. Analisis kuantitatif asam nukleat meliputi Polymerasi Chain
Reaction, Micro Array, Serial Analysis of Gene Expression, Spektroskopi UV-VIS, Differential
Dispay dan Expressed Sequence Tag.
2.1 PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR merupakan teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro (dalam
tabung reaksi) pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer
yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang
urutannya komplemen dengan DNA cetakannya. Metode ini merupakan metode yang paling
sensitif untuk mendeteksi asam nukleat karena primer perbanyakan yang sesuai dapat diatur.
Sensitivitas PCR mengikuti persamaan eksponensial berikut:

Nn =No x (1+E)n
Dimana :
Nn

= jumlah molekul DNA setelah n siklus dari PCR

N0

= jumlah molekul sebelum PCR

= efisiensi dari amplifikasi (0<E<1). Nilai E mendekati 0 menandai PCR mendekati plateau
phase

= banyak siklus

PCR melakukan perbanyakan DNA antara dua primer tanpa perlu memasukkannya ke
dalam sel (in vivo). Dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (template) yang
mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim
DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida.
Selanjutnya, kedua primer akan saling mengenali dan berikatan dengan untaian DNA
komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target sehingga kedua primer
tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3. Setelah kedua primer
menempel pada DNA cetakan, DNA polimerase mengatalisis proses pemanjangan kedua primer
dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida cetakan. DNA
polimerase mengatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3 dengan
gugus 5 fosfat dNTP yang ditambahkan sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh
enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 53. Peristiwa ini disebut reaksi
polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan
nukleotida yang terdapat pada rantai DNA cetakan.
Komponen proses PCR:
1. Enzim DNA Polymerase
2. Primer oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan
DNA template yang akan diperbanyak.
3. Reagen lainnya : dNTP untuk reaksi polimerisasi dan buffer yang mengandung MgCl2.
Konsentrasi ion Mg 2+ sangat penting untuk mempengaruhi proses primer annealing,
denaturasi, spesifisitas produk, aktivitas enzim, dan fidelitas reaksi.

13

Gambar 13. Polymerase Chain Reaction


(sumber: biologyreferences.com)
Tahapan PCR:
a. Denaturasi
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda membelah menjadi dua untai tunggal. Hal ini
disebabkan suhu denaturasi yang tinggi mampu memutuskan ikatan hidrogen antara basa-basa
yang komplemen. Akibat denaturasi, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi
polimerisasi pada siklus sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90oC95oC.
b. Penempelan Primer (Annealing)
Pada tahap ini, primer menuju ke daerah spesifik yang berkomplementer dengan urutan
primer. Ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplementernya pada
template. Proses ini terjadi pada suhu 50oC60oC. Selanjutnya, DNA polimerase akan berikatan
sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila
dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72oC.
c. Reaksi polimerisasi (extension)
Reaksi polimerisasi (perpanjangan rantai) terjadi pada suhu 72oC. Primer yang telah
menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3nya dengan penambahan dNTP yang
komplemen dengan templat oleh DNA polimerase. Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka
daerah yang dibatasi oleh dua primer akan diamplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon
yang berupa untai ganda) sehingga mencapai jumlah salinan yang dapat dirumuskan dengan
(2n)x dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA.

2.2 Microarray
DNA microarray adalah teknologi yang digunakan untuk melihat urutan sekuens asam
nukleat yang berada pada lokasi tertentu dan dapat digunakan untuk menganalisis beribu-ribu
sampel pada waktu yang bersamaan. Prinsipnya adalah mengandalkan kemampuan DNA sampel
yang telah dilabel dengan zat fluorescent untuk melakukan rekombinasi dengan probe yang telah
ada pada chip microarray
Aplikasi microarray banyak digunakan dalam deteksi kanker dimana sel kanker
mengalami abnormalitas dalam mengekspresikan gennya. Teknologi ini juga memungkinkan untuk
mengetahui tahapan perkembangan sel kanker dengan melihat level ekspresinya terhadap probe
spesifik yang telah terdapat pada chip microarray. Dalam analisis ini digunakan sampel DNA
normal dan DNA kanker atau tumor. Kedua jenis DNA ini kemudian diamplifikasi dan masing-

14

masing diberi pewarna fluorescent yang berbeda satu sama lain. Pada contoh yang ditampilkan,
DNA normal diberi warna hijau, dan DNA tumor memiliki warna merah. Setelah proses hibridisasi,
tiap DNA akan memancarkan cahaya sesuai dengan zat warna yang dibawa masing-masing. Bila
DNA membawa ekspresi normal dan tumor, maka akan muncul wana lain, seperti kuning. Namun
bila tidak ada DNA yang mampu melakukan hibridisasi dengan probe, pewarna tidak terekspresi
dan terlihat berwarna hitam. Warna tersebut kemudian dibaca oleh detektor dan diubah menjadi
data grafik sehingga dapat dianalisis secara kuantitatif

Gambar 14. DNA Microarrat Assay of Gene


(sumber: www.wonderwhizkids.com)
2.3 SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)
Analisis Serial ekspresi gen (SAGE) adalah teknik yang digunakan oleh ahli biologi
molekuler untuk menghasilkan snapshot dari populasi messenger RNA dalam sampel yang
menarik dalam bentuk tag kecil yang sesuai dengan fragmen dari transkripnya. Basis unik dari
teknik ini ialah gen dapat diidentifikasi menggunakan unit kecil dari ujung 3 nya (10-30nt). Tagline
diekstrak (dari cDNA) dan digabungkan ke molekul panjang hasil dari PCR dan disekuenskan.
Jumlah berapa kali tagline muncul sama dengan jumlah mRNA nya.

15

Gambar 15. Serial Analysis of Gene Expression


(sumber: www.gene-quantification.de)
2.4 Spektroskopi UV VIS
Uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometri UV-Vis sebenarnya memanfaatkan
kemampuan DNA murni yang dapat menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basabasa purin dan pirimidin. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang
kontaminan protein atau phenol akan menyerap cahaya pada 280 nm. Sehingga kemurnian
DNA dapat dukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai
absorbansi 280 (A260/A280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0. DNA
memiliki nilai tingkat kemurnian yang tinggi jika nilai absorbannya antara 1.8 sampai 2.0, jika
melebihi nilai 2.0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan dari protein
membran atau senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat belum murni. Jika
kurang dari 1.8 makan ddHO2 yang diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil
terlalu sedikit.
Selain menentukan kemurniannya, kita juga dapat menentukan konsentrasi DNA atau RNA
dalam suatu sampel. Rumus yang dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi dari DNA
atau RNA tersebut adalah sebagai berikut :

[DNA] = A260 x 50 x faktor pengenceran

A260
50

= nilai absorbansi pada 260 nm


= larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 g untai ganda DNA
per ml

[RNA] = A260 x 40 x faktor pengenceran

16

40

= 40 g untai ganda RNA per ml

2.5 Differential Display


Metode Diferensial Tampilan dikembangkan oleh Liang dan Pardee telah memperoleh
banyak perhatian yang besar dan sekarang merupakan metode pilihan untuk dengan cepat
mengidentifikasi dan mengisolasi gen diferensial dinyatakan dalam beberapa sistem
eksperimental. Metode ini ampuh karena kesederhanaan dalam pelekatan dan memungkinkan
perbandingan simultan gen up and down-regulated dengan sejumlah kecil bahan baku.

Gambar 16. Differential Display


(sumber: openi.nlm.nih.gov)
2.6 Expressed Sequence Tag (EST)

Gambar 17. Expressed Sequence Tag


(sumber: www.mun.ca)
EST adalah fragmen dari urutan mRNA yang diperoleh melalui reaksi sekuensing tunggal
dilakukan pada klon yang dipilih secara acak dari perpustakaan cDNA. Sampai saat ini, lebih dari
45 juta EST telah dihasilkan dari lebih dari 1400 spesies yang berbeda dari eukariota. Untuk
sebagian besar, proyek EST digunakan untuk baik melengkapi proyek genom yang ada atau

17

berfungsi sebagai alternatif murah untuk tujuan penemuan gen. Namun, dengan perbaikan akurasi
dan cakupan, mereka mulai menemukan aplikasi di bidang-bidang seperti filogenetik, transkrip
profiling dan proteomik. Volume ini memberikan rincian praktis tentang generasi dan analisis EST.

Gambar 18. Aplikasi EST dan SAGE pada Cancer Tissue


(sumber: nature.com)

18

SUMMARY
Untuk mendeteksi asam nukleat, terdapat beberapa teknik analisis yang terdiri dari analisis
kualitatif dan analisis kuantitatif. Beberapa teknik analisis kualitatif bervariasi dengan
karakteristiknya masing-masing, Elektroforesis Gel Agrasoda digunakan untuk memisahkan
dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan
perbedaan ukuran. Hibridisasi In Situ digunakan untuk mendeteksi keberadaan DNA dari
patogen dalam spesi klinis dan untuk mengetahui letak gen spesifik dalam sel. Terdapat 2 jenis
Hibridisasi berdasarkan objek pengamatannya yaitu Flouresence, dimana probe DNA dilabeli
dengan Florence dan Genomic yang prinsip dasarnya hampir sama dengan FISH, hanya saja
komponen yang menjadi probe adalah keseluruhan genom DNA dari suatu spesies. RFLP /
Restriction Fragment Length Polymorphom digunakan sebagai penanda molekular karena
spesifik untuk setiap tunggal atau kombinasi dari enzim restriksi. Staining adalah metode
identifikasi DNA atau RNA dengan cara menysipkan zat yang dapat mengeluarkan warna
kepada DNA atau RNA, dimana terdapat beberapa pewarna seperti Etidium Bromida dan
SYBR. LCR / Ligase Chain Reaction yang merupakan metode amplifikasi DNA. Sequencing
ialah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang relatif pendek, dimana
terbagi menjadi Maxam Gilbert, Sanger, Next Generation dan Single Molecule.
Teknik analisis kuantitatif diantaranya ialah PCR / Polymerase Chain Reaction yang
merupakan teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro (dalam tabung
reaksi) pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Microarray,
teknologi yang digunakan untuk melihat urutan sekuens asam nukleat yang berada pada lokasi
tertentu dan dapat digunakan untuk menganalisis beribu-ribu sampel pada waktu yang
bersamaan. Analisis Serial ekspresi gen (SAGE) adalah teknik yang digunakan oleh ahli
biologi molekuler untuk menghasilkan snapshot dari populasi messenger RNA dalam sampel
yang menarik dalam bentuk tag kecil yang sesuai dengan fragmen dari transkripnya.
Spektroskopi UV VIS, yang memanfaatkan kemampuan DNA murni yang dapat menyerap
cahaya ultraviolet karena keberadaan basa- basa purin dan pirimidin. Differential Display, yaitu
metode pilihan untuk dengan cepat mengidentifikasi dan mengisolasi gen diferensial
dinyatakan dalam beberapa sistem eksperimental. EST / Expressed Sequence Tag yang
merupakan fragmen dari urutan mRNA yang diperoleh melalui reaksi sekuensing tunggal
dilakukan pada klon yang dipilih secara acak dari perpustakaan cDNA.
Dari beberapa teknik analisis bakteri tersebut, masing-masing mempunyai keunikan dan
identifikasi tersendiri yang mana masih tetap berkembang di dunia Biologi Molekular. Apabila
kita ingin mendeteksi DNA/RNA pada sebuah target, identifikasi dahulu kriteria dan pola hasil
yang ingin didapat sebelum menentukan teknik deteksi yang paling sesuai untuk percobaan.

19

DAFTAR PUSTAKA

Lehninger, Albert. 2008. Principles of Biochemistry. 5th. USA: WH Freeman.


Alberts, Bruce, 2008, Molecular Biology of The Cell,5th, Garland Science, Taylor & Francis Group,
New York.
Fatchiyah dkk. 2011. Biologi Molekuler: Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.
Fessenden & Fessenden. 1995. Organic Chemistry 5th. Cleveland: Delta State.
Karp, Gerald, 2010, Cell and Molecular Biology Concepts and Experiments, 6th, John Wiley &
Sons, USA.
Campbell NA, Reece JB. 2008.
BenjaminCummings.1393 p.

Biology.

8th

ed.

Upper

Saddle

River

(NJ):

D.Stainsfield, William, Jaime, S. Colome, Raul, J. Cano, 2003, Schaums Easy Outlines Molecular
and Cell Biology, The McGraw-Hill Companies, Inc., USA.