BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Gambaran umum TPA Supit Urang

Lokasi pengambilan sampel dilakukan di TPA Supit Urang yang berlokasi di

Desa Mulyorejo Kecamatan Sukun Kota Malang. Metode operasional sampah

yang digunakan merupakan semi sanitary landfill. Jenis tanah di lokasi TPA Supit
Urang yaitu jenis tanah mediteran coklat kekuningan (inceptisol), andosol
(andisol), dan litosol (entisol). Pada TPA supit urang terdapat lima sel : Sel I:
seluas : 86.163 m2 ; Sel II: seluas : 147.015 m2; Sel III: seluas : 133.237 m2; Sel
IV : seluas : 217.562 m2; Sel V : seluas : 110.425 m2. Sel I, Sel II dan Sel III
kondisinya sudah penuh dengan sampah dan sudah habis masa operasinya (sel
pasif). Sedangkan proses pembuangan sampah saat ini dilakukan pada Sel IV
dan Sel V.
Pengambilan titik sampel dilakukan di sel pasif dan sel aktif III dan IV. Titik
lokasi pengambilan dipilih secara acak yang mewakili sampel tanah TPA supit
urang. Lokasi tumpukan sampah di tanah dipilih mulai dari tumpukan sampah
umur 3 bulan dan 6 bulan. Pengambilan sampel tanah pada sel aktif dan pasif
bertujuan untuk memperoleh bakteri yang beragam. Berikut merupakan gambar
denah TPA Supit Urang dan lintasan survey lapangan.

Gambar 4.1 Denah TPA Supit Urang dan lintasan survei lapangan (Hakim et all, 2014)

Metode pengambilan sampel tanah dilakukan secara komposit untuk

mendapatkan gambaran umum (unbiased estimation) sebagai atribut mikroba
disuatu areal atau petak relatif homogen. Titik pengambilan sampel komposit
dengan pola acak pada sel III (zona III) dan sel IV (zona IV) ditentukan dengan
memilih sampel tanah yang agak basah dan sampel tanah basah (mengandung

27

air lindi). Sampel tanah dari 4 titik pengambilan sampel kemudian dicampur dan
diaduk secara rata menggunakan wadah. Sampel tanah yang sudah tercampur
dan belum segera digunakan kemudian diawetkan dengan suhu 40C. Suhu
terbaik penyimpanan contoh tanah adalah 2-40C, yakni untuk penyimpanan
sampai 4 minggu (Husein, 2007). Penyimpanan sampel tanah yang masih akan
digunakan dalam jangka panjang biasanya disimpan pada suhu -200C.
Sampel tanah yang akan digunakan untuk proses isolasi disimpan pada
suhu 40C sebanyak 100 gr. Sampel tanah yang diperoleh selain digunakan pada
proses isolasi mikroba juga digunakan untuk pengujian kandungan logam timbal
pada tanah. Tujuannya untuk mengetahui besarnya konsentrasi logam timbal
tanah tercemar lindi. Hasil yang diperoleh untuk menentukan besarnya
pencemaran logam tanah di TPA Supit Urang. Sampel tanah yang akan di uji
dikering anginkan terlebih dahulu selama 3 hari untuk mengurangi kadar air
tanah sehingga mempermudah pada proses pengabuan (ash). Pengujian sampel
awal tanah dilakukan di laboratorium pengujian mutu dan keamanan pangan
(laboratorium teknologi hasil pertanian). Berikut ini merupakan Tabel yang
menunjukkan hasil pengujian tanah TPA Supit urang bulan desember 2015.
Tabel 4.1 Hasil Pengujian Logam dalam Tanah
Parameter
Timbal (Pb)

Hasil, mg/l (ppm)

0,57

Berdasarkan hasil pengujian parameter pb, konsentrasi pb pada sampel

tanah adalah 0,57 ppm (Lampiran 3). Hasil pengujian tersebut mengindiikasikan
bahwa sampel tanah yang diperoleh dari TPA Supit Urang tercemar logam berat
timbal (pb). Berdasarkan SNI (1991) dalam Widyasari dkk (2013), batas
maksimum timbal (pb) adalah 0,0405 mg/l. Berdasarkan hasil pengujian diduga
dalam tanah tersebut terdapat kelompok bakteri yang toleran dan resisten
terhadap logam timbal sehingga mampu mereduksi logam timbal. Mikroba
merupakan organisme yang mempunyai niche yang sempit sehingga rentan
terhadap perubahan lingkungan dan mampu bermutasi untuk bertahan (Widyati,
2008).
Tingginya kadar timbal berasal dari tumpukan sampah di TPA supit urang
seperti baterai bekas, aki bekas, plastik pembungkus makanan, dan
pembungkus rokok. Pencemaran logam berat pada tanah sangat erat
hubungannya dengan pencemaran udara dan air. Partikel logam air akan

28

mengalami infiltrasi masuk dalam lapisan tanah sedangkan partikel logam di

udara akan terbawa oleh air hujan yang membasahi tanah sehingga timbul
pencemaran tanah. Kandungan logam berat dalam tanah secara alami sangat
rendah, kecuali tanah sudah tercemar.
4.2 Isolasi Bakteri
Proses isolasi merupakan suatu langkah untuk memindahkan mikroba dari
lingkungannya sehingga diperoleh kultur murni. Isolasi mikroba dapat dilakukan
dengan beberapa metode diantaranya, metode pour plate, streak plate, dan
spread plate. Metode yang dilakukan pada penelitian ini merupakan metode
isolasi mikroba dengan streak plate. Prinsip metode isolasi streak plate atau
cawan gores untuk mendapatkan koloni murni dengan membagi cawan menjadi
4 bagian dimana bagian 1, bagian 2, dan bagian 3 koloni bakteri digores secara
horizontal sedangkan bagian 4 digores secara zig-zag. Proses isolasi mikroba
dilakukan dengan pengenceraan sampel tanah yang diperoleh dari TPA Supit
Urang. Berikut merupakan gambar penggunaan metode streak plate untuk
memperoleh biakan murni.

Gambar 4.2 Metode Streak Plate Secara Four Way Streak

Proses pemurnian isolat bakteri yang diperoleh dari koloni bakteri saat
proses kultivasi dilakukan dengan metode gores. Berdasarkan gambar 4.2, pada
bagian I, II, dan bagian III koloni digores secara horizontal dan ujung pada tiap
bagian goresan saling terhubung sebagai track/jalur. Sedangkan pada bagian IV
koloni bakteri yang akan dimurnikan digores secara zigzag. Isolat bakteri akan
tumbuh sesuai dengan track yang dibentuk. Sampel tanah digunakan untuk
memperoleh isolat bakteri yang mampu menurunkan konsentrasi logam timbal.
Tinggi konsentrasi logam timbal pada tanah di lahan TPA Supit Urang

29

mengindikasikan adanya bakteri toleran logam timbal yang dapat digunakan

sebagai agen bioremoval pencemar timbal untuk proses bioremediasi lahan
tercemar Pb.
Isolasi bakteri resisten timbal (Pb) dari sampel tanah dilakukan dengan
mengisolasi mikroba yang tumbuh dari seri pengenceran 10 -1 dan 10 -6 secara
duplo (Lampiran 4). Sampel tanah sebanyak 1 gr dilarutkan menggunakan
larutan garfis 85 % sebanyak 9 ml untuk melarutkan bakteri dari medianya
dengan tetap menjaga integritas sel mikroba. Masing-masing pengenceran
sampel kemudian diambil 0,1 ml untuk dipindahkan pada media padat NA.
Banyaknya nutrient agar yang digunakan 10 ml. Proses pencampuran media
dengan larutan sampel dilakukan dengan memutar cawan petri membentuk
angka 8 sebanyak 10 kali. Kemudian ditunggu hingga media padat, dibungkus
dengan kertas payung untuk menghindari kontaminasi. Inkubasi dilakukan
dengan membalik media (posisi terbalik) dan dilakukan selam 1x24 jam
menggunakan inkubator (MMM).
Pertumbuhan bakteri seri pengenceran 10 -1 dan 10 -2 sangat padat
sehingga tidak memungkinkan dilakukan pemurnian bakteri. Akan tetapi, koloni
bakteri pada pengenceran tersebut bisa ditemukan pada pengenceran 10-3
hingga 10-6. Proses pemilihan bakteri pada seri pengenceran 10-3 hingga 10-6
berdasarkan karakteristik koloni. Koloni bakteri kemudian diamati dan diberi
tanda untuk dimurnikan (Lampiran 5). Isolasi mikroba berdasarkan seri
pengenceran 10-3 hingga 10-6 secara duplo diperoleh 22 isolat. Koloni yang dipilih
dimurnikan dengan memindahkan ke media baru. Tujuannya untuk menghasilkan
isolat bakteri yang benar-benar murni. Gambar 4.3 berikut ini merupakan hasil
isolasi yang dilakukan untuk memperoleh isolat murni dari 22 koloni yang
ditemukan menjadi 10 isolat murni yang mampu bertahan.

Isolat 1

Isolat 3

Isolat 2

30

Isolat 4

Isolat 5

Isolat 6

Isolat 7

Isolat 8

Isolat 4
Isolat 9
Gambar 4.3 Isolat Bakteri Setelah Proses Pemurnian dari Koloni Bakteri

Berdasarkan gambar diatas (gambar 4.3 ), isolat murni diperoleh setelah

proses isolasi menggunakan metode streak plate. Pemilihan isolat bakteri
berdasarkan bentuk dan warna koloni yang terlihat berbeda. Koloni yang
diperoleh kemudian dilakukan pengamatan morfologi koloni meliputi bentuk,
warna, tepi koloni, elevasi, dan mengkilap/suram koloni bakterinya (Lampiran 8).
Isolat bakteri yang akan dimurnikan tidak boleh bertumpuk dengan koloni lain.
Koloni bakteri diambil menggunakan jarum ose steril sesuai dengan koloni yang
telah ditandai. Jarum ose dibakar hingga berpijar untuk menghindari kontaminasi
yang tidak diinginkan. Koloni digores perlahan pada media padat menggunakan
metode quadrant streak secara four way streak (Gambar 4.2). Pengambilan
koloni dilakukan secara perlahan agar tidak merusak medianya. Selain itu, saat
proses penggoresan koloni/pemurnian tidak merusak media NA karena akan
mempengaruhi pertumbuhan isolat bakteri. Proses penggoresan dilakukan
didekat api. Isolat bakteri yang diperoleh sebanyak 22 isolat yang telah
dimurnikan kemudian diinkubasi selama 1 x 24 jam. Berdasarkan 22 isolat awal
yang diperoleh, 12 isolat tidak dapat tumbuh saat pemurnian (Gambar 4.3). Isolat
bakteri yang mampu bertahan ditandai dengan memberi penamaan sepuluh
isolat, isolat 1 hingga isolat 10 (Lampiran 6). Isolat yang ditemukan memiliki
karakteristik yang berbeda-beda.
Karakteristik bentuk koloni yang mampu bertahan adalah bentuk koloni
bulat, bulat oval, bulat lonjong, dan bentuk koloni tidak beraturan. Setelah
pemurnian, sepuluh isolat bakteri kemudian dimurniakan kembali pada media

31

padat NA dalam cawan petri untuk memastikan bahwa tidak ada isolat lain yang
tumbuh. Teknik pemurnian menggunakan teknik streak plate. Isolat koloni yang
berhasil bertahan di isolasi pada media agar secara four way streak. Four way
streak merupakan metode untuk mengisolasi bakteri dengan membagi media
padat menjadi 4 ruang (Gambar 4.2). Setiap goresan koloni pada tiap ruang
menyambung satu sama lain dan pada ruang 4 digores secara zig-zag. Proses
penggoresan koloni bakteri dilakukan secara aseptis dalam laminar air flow dan
menggunakan pembakar bunsen untuk menghindari terjadinya kontaminasi.
Gambar 4.3 merupakan hasil dari proses pemurnian dari 10 isolat bakteri yang
mampu bertahan. Setelah terlihat pertumbuhan bakteri dan tidak ditemukan
pertumbuhan bakteri dengan bentuk berbeda, dilanjutkan dengan uji resistensi.
Isolat bakteri murni yang tumbuh kemudian diuji resistensinya dengan media
padat NA yang diperkaya Pb(NO3)2 sebesar 5 mg/l. Penambahan Pb(NO3)2 pada
media agar sebanyak 3 ml ke dalam 7 ml NA. Inkubasi pada inkubator dengan
suhu 370C selama 1 x 24 jam. Tujuannya untuk skrining bakteri yang mampu
bertahan dengan kondisi penambahan timbal pada medianya. Pada tahap ini
semua isolat yang di isolasi pada media padat NA yang diperkaya Pb(NO3)2
mampu bertahan dan tumbuh sesuai dengan metode yang digunakan (Lampiran
7). Berdasarkan isolat bakteri yang diperoleh berdasarkan pemurnian
menggunkan metode streak plate, sepuluh isolat diuji ketahanan terhadap
lingkungan yang mengandung logam timbal. Hasilnya sepuluh isolat yang
diperoleh resisten dan mampu hidup walaupun kondisi lingkungan (media)
diperkaya dengan Pb(NO3)2 5 mg/l. Gambar isolat yang resisten terhadap logam
pb seperti pada gambar 4.3.
4.3

Identifikasi Morfologi
Identifikasi secara morfologi merupakan bagian dari karakterisasi bakteri

secara bentuk, baik secara makroskopik maupun mikroskopik. Morfologi

makroskopik merupakan proses identifikasi yang bisa dilakukan secara langsung
sedangkan morfologi mikroskopik memerlukan alat mikroskop untuk proses
identifikasinya. Identifikasi makroskopik maupun mikroskopik bertujuan untuk
mengetahui perbedaan dari masing-masing isolat yang ditemukan. Identifikasi
morfologi juga dapat digunakan sebagai dasar untuk proses identifikasi genus
maupun spesies bakteri dengan uji lanjut (uji biokimia maupun uji molekuler).

32

Berikut ini merupakan gambar hasil pemurnian isolat pada media padat yang
diperkaya Pb.

Isolat 1

Isolat 2

Isolat 3

Isolat 4

Isolat 5

Isolat 6

Isolat 7

Isolat 8

Isolat 9
Isolat 10
Gambar 4.4 Isolat Bakteri pada Media yang Diperkaya Pb(NO3)2

Proses isolasi yang dilakukan menghasilkan 10 isolat bakteri yang resisten

terhadap logam timbal (Pb). Isolat bakteri diperoleh dari hasil pemurnian bakteri
kemudian diuji ketahanan terhadap logam timbal pada konsentrasi 5 ppm.
Berdasarkan pengamatan, sepuluh isolat bakteri mampu bertahan dengan
kondisi lingkungannya yang mengandung Pb. Isolat 4 dan isolat 5 mengalami
pertumbuhan sangat cepat sehingga terlihat memenuhi seluruh permukaan
media (block). Selain itu, berdasarkan pengamatan fisik (warna) terdapat dua (2)
isolat yang berbeda dari isolat bakteri lainnya. Isolat bakteri, isolat 6 dan isolat 9
memiliki warna permukaan media yang berbeda. Media agar padat sebagai
media tumbuh isolat 6 dan isolat 9 mengalami perubahan warna. Gambar
dibawah ini merupakan gambar dari permukaan media pertumbuhan untuk isolat
6 yang mengalami perubahan warna.

33

Gambar 4.5 Permukaan Media Isolat 6

Berdasarkan gambar 4.5 media padat berwarna abu-abu kebiruan. Warna

awal media padat NA berwarna kuning bening berubah menjadi abu-abu
kebiruan. Sedangkan isolat lainnya tidak mengalami perubahan warna pada
medianya. Perubahan warna pada media menjadi warna abu-abu kebiruan yang
merupakan ciri warna logam pada timbal. Perubahan warna media berhubungan
dengan adanya bioremoval yang dilakukan oleh bakteri untuk mengurai logam
timbal yang ada pada media tumbuhnya. Akan tetapi, untuk mengetahui
kemampuan isolat 6 merubah warna media merupakan salah satu bakteri yang
mampu ,mereduksi logam diperlukan uji terhadap ketahanan logam dengan
konsentrasi yang lebih besar. Uji ketahanan logam juga dilakukan pada sepuluh
isolat yang telah ditemukan untuk mengetahui ketahanan isolat terhadap logam
timbal. Isolat bakteri kemudian dipindahkan dari media padat ke media cair untuk
proses selanjutnya. Berikut merupakan sepuluh isolat dalam media cair nutrient
broth.

Gambar 4.6 Isolat Bakteri dalam Media Cair NB

Gambar diatas merupakan sepuluh isolat bakteri dalam media cair nutrient
broth. Proses pemindahan isolat menggunakan jarum ose steril. Isolat
dipindahkan sebanyak satu ose penuh (loopfull) dalam 7 ml NB. Kemudian

34

diinkubasi menggunakan inkubator shaker dengan kecepatan 120 rpm pada

suhu 370C selama 24 jam. Pertumbuhan isolat pada media cair NB ditandai
dengan keruhnya media cair setelah proses inkubasi. Pemindahan isolat pada
media cair hanya bisa digunakan sesaat karena luas permukaan media cair lebih
kecil sehingga tidak dapat digunakan untuk penyimpanan isolat.
Isolat yang lolos skrining diperbanyak dalam media agar miring untuk
stok/persediaan isolat bakteri. Proses penyimpanan dalam jangka panjang
dilakukan pada media agar miring karena memiliki luas permukaan yang lebih
besar. Sedangkan isolat pada media cair digunakan untuk proses pewarnaan uji
gram pada bakteri dan pengamatan mikroskop. Proses pewarnaan
menggunakan isolat bakteri yang sebelumnya ditumbuhakan pada media cair
nutrien broth (NB). Hal ini untuk mempermudah pengambilan isolat bakteri dari
pada menggunakn isolat yang ditumbuhkan pada media padat (Lampiran 9).
Proses pewarnaan dinding bakteri menggunakan pewarna berdasarkan
ketentuan pewarnaan gram. Pewarna yang digunakan antara lain, kristal violet,
safranin, dan iodine. Langkah awal proses pewarnaan adalah mempersiapkan
kaca obyek. Kaca obyek harus bersih dan bebas lemak untuk membuat apusan
bakteri. Kaca obyek sebelumnya difiksasi dengan pemanasan diatas api.
Usapkan suspensi bakteri dari media cair diatas kaca obyek kemudian fiksasi
dengan pemanasan selama 5 detik. Larutan kristal violet diteteskan hingga
memenuhi apusan suspensi (3 tetes) bakteri diatas kaca benda dan ditunggu
hingga 60 detik. Bersihkan dengan akuades setelah 60 detik, kemudian tetesi
lagi dengan iodine hingga memenuhi apusan (3 tetes) dan didiamkan kembali
selama 60 detik. Siram dengan alkohol 70 % untuk menghilangkan pewarna
dasar kemudian diamkan selama 30 detik. Langkah selanjutnya tetesi kembali
apusan bakteri dengan pewarna safranin hingga memenuhi apusan (3 tetes)
diamkan kembali selama 60 detik dan tetesi kembali dengan akuades. Hasil
pewarnaan dinding sel bakteri dilakukan pada mikroskop dengan perbesaran
1000x.
Pengamatan hasil pewarnaan pada perbesaran 1000x menggunakan
mikroskop ditetesi terlebih dahulu dengan emersi untuk memperjelas
pengamatan. Perbedaan gram tergantung pada warna yang dapat dipertahankan
oleh bakteri. Kristal violet merupakan warna dasar yang mewarnai dengan jelas.
Larutan iodine merupakan larutan pengikat warna dasar sedangkan alkohol
merupakan larutan pencuci warna dasar. Safranin merupakan pewarna

35

pembanding, apabila warna dasar tidak tercuci maka warna pembanding tidak
akan terlihat. Pewarnaan dinding sel bakteri untuk identifikasi morfologi bakteri
secara mikroskopik. Selain itu, identifikasi morfologi juga meliputi identifikasi
secara makroskopik pada koloni bakteri yang diperoleh dari proses isolasi.
Berikut merupakan Tabel pengamatan morfologi isolat bakteri secara
makroskopik yang dilakukan pada koloni bakteri.
Tabel 4.2 Pengamatan Morfologi Secara Makroskopik
Nama
Isolat
Isolat 1
Isolat 2
Isolat 3
Isolat 4
Isolat 5
Isolat 6
Isolat 7
Isolat 8
Isolat 9

Bentuk
Koloni
Round
Round
Bulat Oval
Round
Bulat Lonjong
Round
Round
Round
Irregular

Warna Koloni

Tepi Koloni

Elevasi

Putih
Kuning Mentega
Putih
Biru
Putih
Kuning mentega
Putih
Putih Suram
Putih

Isolat10

Irregular

Putih

Smooth
Smooth
Smooth
Smooth
Smooth
Smooth
Wavy
Smooth
Ciliate
Irregular
(Erose)

Flat
Raised
Raised
Flat
Raised
Flat
Convex
Raised
Raised
In growing
into medium

Mengkilap/
Suram
Vague
Glossy
Vague
Glossy
Glossy
Vague
Glossy
Vague
Vague
Vague

Berdasarkan data pada Tabel 4.2, pengamatan morfologi secara

makroskopik dilakukan secara langsung. Pengamatan meliputi bentuk koloni,
warna koloni, tepi koloni, elevasi, dan sifat koloni mengkilap atau suram.
Penggolongan karakteristik biologi secara makroskopik mengacu pada metode
Benson (Company, 2001). Berdasarkan pengamatan secara makroskopik
maupun mikroskopik, setiap isolat bakteri yang berhasil dimurnikan memiliki
karakteristik koloni yang berbeda. Bentuk koloni umumnya adalah bulat, bulat
oval, bulat lonjong, dan tidak beraturan. Warna koloni putih, kuning mentega,
biru, dan putih suram. Tepi koloni isolat bakteri memiliki tepi yang halus,
bergelombang, tidak beraturan, dan tepi dengan cilia. Sedangkan elevasinya
diperoleh dengan pengamatan elevasi koloni terhadap mediumnya. Elevasi flat
atau datar artinya koloni bakteri memiliki elevasi yang sama rata dengan
mediumnya. Elevasi reised atau terangkat artinya elevasi koloni memiliki
perbedaan dengan mediumnya (timbul). Elevasi convex merupakan elevasi pada
koloni yang terlihat cembung. Sedangkan tepi koloni dengan tipe in growing into
medium merupakan elevasi koloni yang yang timbul seperti kedalam medium.
Pengamatan secara makroskopik sesuai dengan acuan literatur metode Benson
(Lampiran 8). Koloni bakteri juga diamati apakah termasuk koloni bakteri yang

36

mengkilap atau suram (tidak bercahaya). Pengamatan secara makroskopik pada

Tabel 4.2 digunakan untuk mengetahui perbedaan secara jelas pada masingmasing isolat yang diperoleh. Selain itu, pengamatan secara mikroskopik juga
diperlukan untuk mengetahui perbedaan isolat berdasarkan proses pewarnaan.
Berikut ini merupakan Tabel pengamatan morfologi secara mikroskopik.
Tabel 4.3 Pengamatan Morfologi Secara Mikroskopik
Nama Isolat
Isolat 1
Isolat 2
Isolat 3
Isolat 4
Isolat 5
Isolat 6
Isolat 7
Isolat 8
Isolat 9
Isolat10

Bentuk Bakteri
Basil/ Diplobasil
Basil/Monobasil
Coccus
Basil/Diplobasil
Basil/Streptobasil
Basil/Monobasil
Basil/Monobasil
Basil/Monobasil
Coccus
Basil/Monobasil

Gram
(+) Positive
(-) Negative
(+) Positive
(+) Positive
(+) Positive
(+) Positive
(-) Negative
(+) Positive
(+) Positive
(+) Positive

Pengamatan secara mikroskopis dilakukan menggunakan mikroskop untuk

mengamati bentuk bakteri dan hasil dari pewarnaan gram. Tabel pengamatan 4.3
menunjukkan perbedaan bentuk bakteri dan gram bakteri pada isolat 1 hingga
isolat 10. Bentuk bakteri beragam mulai dari basil/batang, kokus/bulat, spiral, dan
vibrio/koma. Pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop trinokuler dengan
perbesaran 1000x dengan penambahan minyak emersi untuk memperjelas
pengamatan. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa isolat bakteri yang
ditemukan umumnya berbentuk basil dengan tipe bentuk basil yang berbeda.
Isolat memiliki bentuk diplobasil, monobasil, dan streptobasil. Monobasil
merupakan bentuk batang yang terdiri dari satu sel batang. Diplobasil merupakan
bentuk bakteri batang yang bergandengan/dua sel batang. Sedangkan
streptobasil merupakan bentuk basil yang panjang/bentuk sel batang panjang.
Selain bentuk batang, bentuk lain yang ditemukan adalah kokus atau bentuk
bakteri bulat. Isolat yang memiliki bentuk bulat adalah isolat 3 dan 9, sedangkan
yang lainnya memiliki bentuk batang.
Proses pewarnaan dinding sel bakteri untuk mengetahui jenis gram
bakteri. Berdasarkan Tabel pengamatan secara mikroskopik, gram bakteri dibagi
menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Isolat 2 dan isolat 7 merupakan
bakteri yang tergolong bakteri gram negatif. Sedangkan isolat lainnya merupakan
bakteri gram positif. Kristal violet akan memberikan warna biru keunguan

37

sehingga menghasilkan bakteri dengan gram positif. Bakteri dengan gram negatif
karena pewarnaan dinding sel oleh safranin.
Dinding sel sendiri merupakan struktur lapisan terluar. Dinding sel
merupakan struktur kaku yang berfungsi menahan tekanan turgor atau tekanan
air pada membran sel. Pada bakteri gram negatif dinding sel terdiri dari beberapa
lapis peptidoglikan sedangkan pada bakteri gram positif terdiri dari berlapis-lapis
peptidoglikan. Perbedaan bakteri gram positif dan negatif terletak pada lapisan
dinding sel yang mempertahankan warna yang diberikan. Bagian terluar dinding
sel bakteri gram negatif adalah membran luar, maka pewarnaan gram yang
mewarnai membran luar menghasilkan warna pink. Gram positif yang bagian
terluarnya adalah peptidoglikan, hasil pewarnaan gram, menghasilkan warna biru
keunguan. Warna berasal dari kristal violet yang mewarnai peptidoglikan.
Menurut Purwoko (2009), dinding sel bakteri gram positif dan negatif
tersusun oleh komponen kimia diantaranya;
1. Komposisi kimia dinding sel bakteri gram positif
Terdiri dari peptidoglikan dan non peptidoglikan. Senyawa non peptidoglikan
menyusun sampai 50% berat kering dinding sel. Senyawa nonpeptidoglikan
tersebut adalah asam teikoat, asam teikuronat, polisakarida, asam lipotekoat,
dan asam mikolat. Permukaan sel bakteri gram positif; membran sel (MS) terdiri
atas fosfolipid (FL), dan protein membran sel (Pt & Ptb). Dinding sel terdiri atas
polimer peptidoglikan (Pep), asam lipotekoat (LTA), protein dinding sel (S),
polisakarida (Ps), asam teikoat (Tei), dan asam teikorunat (Te).
2. Komposisi kimia dinding sel bakteri gram negatif
Dinding sel bakteri gram negatif lebih kompleks, karena terdapat membran
luar yang melindungi peptidoglikan. Struktur membran luar tersebut mirip dengan
membran sel. Hal yang membedakan kedua membran tersebut adalah membran
terdiri atas fosfolipid (lapisan dalam) dan lipopolisakarida (lapisan luar),
sementara pada membran sel terdiri atas dwilapis fosfolipid. Permukaan sel
bakteri gram negatif ; membran sel terdiri atas fosfolipid (FL), protein terbenam
(Ptb), dan protein tepi (Pt). ruang periplasmik (Per) terdiri atas protein
periplasmik (Pp) dan peptidoglikan (Pep). Membran luar (ML) terdiri atas
fosfolipid (FL), lipoprotein murein (LPM), porin (Por), dan lipopolisakarida (LPS)
yang terdiri atas lipid-A (A), core (C), dan antigen O(O)
Berdasarkan pengamatan secara mikroskopis bentuk sel dan jenis gram
pada masing masing isolat dapat diamati pada mikroskop. Umumnya isolat

38

bakteri yang ditemukan memiliki bentuk sel basil/batang kecuali pada isolat 3 dan
isolat 9 yang memiliki b entuk kokus/bulat. Hasil pewarnaan gram menunjukkan
bahwa sebagian besar isolat memiliki gram positif kecuali pada isolat 2 dan isolat
7. Pengamatan mikroskopik penting untuk mengetahui bentuk dan gram bakteri
yang resisten terhadap logam timbal sesuai literatur maupun penelitian
sebelumnya. Berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan Isa (2013),
bakteri dengan genus Bacillus merupakan bakteri yang toleran terhadap
toksisitas logam berat serta mampu menghilangkan logam berat di lingkungan
dengan kemampuan menyerap logam tinggi. Bakteri Bacillus digolongkan ke
dalam bakteri gram positif, berbentuk batang, aerobik dan aerobik fakultatif, dan
umumnya dijumpai ditanah. Berdasarkan pengamatan mikroskopis isolat bakteri
yang diperoleh umumnya berbentuk basil dan memiliki gram positif sesuai
dengan pengamatan dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x (Lampiran
10). Berdasarkan pengamatan mikroskopik yang dilakukan ciri-ciri dari isolat
yang ditemukan mengarah pada ciri-ciri bakteri bacillus. Akan tetapi, untuk
mengklasifikasikan isolat bakteri ke genus Bacillus memerlukan uji lanjutan
seperti uji biokimia dan uji molekuler.
4.4

Screening Isolat Bakteri

Proses screening isolat bakteri dilakukan untuk menentukan isolat yang

lebih tahan pada kondisi lingkungan yang tercemar logam timbal. Proses
screening dilakukan dengan metode kekeruhan dan uji reduksi. Metode
kekeruhan digunakan untuk mengetahui tingkat kepadatan mikroba pada media
setelah proses inkubasi. Sedangkan uji reduksi dilakukan setelah menentukan
jenis isolat yang memiliki nilai OD yang tinggi untuk mengetahui daya reduksi
isolat bakteri terhadap logam.
4.4.1 Metode Turbidimetri
Uji ketahanan terhadap logam pada media cair untuk proses skrining isolat
bakteri berdasarkan nilai optical density atau nilai kepadatan bakteri. Nilai optical
density (OD) merupakan metode turbidimetri yang dapat dilakukan untuk
mengetahui jumlah koloni baik yang masih hidup maupun yang sudah mati.
Semakin keruh suatu kultur maka semakin banyak jumlah selnya. Prinsip dasar
metode turbidimetri adalah, jika cahaya mengenai sel, maka sebagian cahaya
diserap dan sebagian cahaya diteruskan (Purwoko, 2009). Jumlah cahaya yang
diserap berbanding lurus dengan jumlah sel bakteri. Semakin banyak jumlah sel

39

semakin sedikit cahaya yang diteruskan sehingga semakin kecil nilai

absorbansinya.
Proses isolasi bakteri yang menghasilkan sepuluh isolat bakteri yang
resisten logam timbal selanjutnya dipindahkan ke media cair nutrient broth (NB)
untuk uji lanjut resistensi terhadap logam. Setiap isolat bakteri, Isolat 1 hingga
Isolat 10 dipindahkan dari media padatnya dengan mengambil satu ose penuh ke
media cair NB sebanyak 7 ml. Kemudian isolat bakteri yang telah ditumbuhkan
dimedia cair diambil sebanyak 0,5 ml untuk ditumbuhkan pada media cair NB 5
ml yang diperkaya logam timbal. Isolat bakteri ditumbuhkan pada tiga kondisi
media NB yang berbeda. Perbedaan kondisi berdasarkan penambahan
konsentrasi logam timbal yang ingin diketahui. Konsentrasi logam yang
ditambahkan adalah 10 ppm, 30 ppm, dan 50 ppm dengan masing-masing
menambahkan 2,5 ml.
Berdasarkan metode turbidimetri, sepuluh isolat bakteri yang telah
dipindahkan kemudian diinkubasi selama 1 x 24 jam pada incubator shaker.
Setelah inkubasi, masing-masing isolat diuji nilai kekeruhannya menggunakan
spechtrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. Hasil yang diperoleh
digunakan sebagai dasar untuk menentukan isolat bakteri yang memiliki daya
reduksi logam timbal yang lebih efektif berdasarkan tingkat kekeruhan . Berikut
hasil uji OD dari masing-masing isolat yang diperoleh.

40

Tabel 4.4 Nilai Optical Density Masing-Masing Isolat Bakteri

Isolat Bakteri
Isolat 1
Isolat 2

Isolat 3
Isolat 4
Isolat 5
Isolat 6
Isolat 7
Isolat 8
Isolat 9
Isolat 10

Konsentrasi Logam
Timbal
10 ppm
30 ppm
50 ppm
10 ppm
30 ppm
50 ppm
10 ppm
30 ppm
50 ppm
10 ppm
30 ppm
50 ppm
10 ppm
30 ppm
50 ppm
10 ppm
30 ppm
50 ppm
10 ppm
30 ppm
50 ppm
10 ppm
30 ppm
50 ppm
10 ppm
30 ppm
50 ppm
10 ppm
30 ppm
50 ppm

%T
(Absorbansi)
0.594
0.588
0.568
0.535
0.531
0.506
0.533
0.542
0.572
0.383
0.389
0.405
0.369
0.144
0.134
0.157
0.131
0.118
0.697
0.630
0.620
0.570
0.704
0.730
0.617
0.738
0.628
0.692
0.463
0.450

OD
(-Log(%T))
0,226
0,231
0,246
0,272
0,275
0,296
0,273
0,266
0,243
0,417
0,410
0,393
0,433
0,842
0,873
0,804
0,883
0,928
0,157
0,201
0,208
0,244
0,152
0,137
0,210
0,132
0,202
0,160
0,334
0,347

Berdasarkan data Tabel 2.3 diatas, diperoleh nilai OD masing masing

konsentrasi pada tiap-tiap isolat bakteri. Nilai OD memiliki perbedaan yang
signifikan. Isolat bakteri memiliki nilai OD yang semakin tinggi dengan
meningkatnya konsentrasi logam yang diberikan. Hal tersebut diwakili Isolat 1,
Isolat 2, Isolat 5, Isolat 6, Isolat 7, dan Isolat 10. Sedangkan pada Isolat 3, Isolat
4, dan Isolat 8 mengalami penurunan nilai OD. Pada isolat 9 terjadi
penyimpangan nilai OD yang terukur, dimana nilai OD tidak menunjukkan
penurunan maupun peningkatan. Hal tersebut terjadi karena pengaruhi beberapa
faktor kesalahan seperti, kesalahan pembacaan oleh pengamat, proses
penanaman bakteri , pemanasan alat serta faktor lain yang mempengaruhi nilai
OD maupun proses saat inkubasi. Langkah-langkah untuk menentukan niali OD
adalah menyalakan spechtrofotometer (Genesys 20) selama 15-20 menit.
Tujuannya untuk pemanasan alat agar mencapai titik keseimbangan saat
pembacaan larutan uji. Sebelum pengujian larutan, setting blank alat
41

menggunakan larutan blanko akuades untuk proses kalibrasi. Tombol setting

blank ditekan setelah larutan blanko dimasukkan pada kuvet dan diletakkan pada
spechtrofotometer. Kemudian ditunggu hingga isolat pada layar menunjukkan
nilai 0,00. Larutan uji masing masing perlakuan siap untuk diukur absorbansinya.
Berdasarkan hasil Tabel pengamatan, Tabel 4.4 diperoleh nilai OD terukur
pada masing-masing isolat. Hasil tersebut diperoleh berdasarkan serapan
cahaya yang terbaca oleh spechtrofotometer. Data pada Tabel merupakan data
pengukuran nilai awal untuk mengetahui besarnya cahaya yang dapat diserap.
Setelah diperoleh data awal kemudian dilakukan pengambilan data secara triplo
(3 kali) untuk mengetahui rata-rata OD secara akurat dan teliti. Pengukuran data
dilakukan dengan ulangan pada tiap perlakuan yang diberikan menggunakan
larutan blanko yang sama, yaitu akuades. Tabel dibawah ini merupakan
pengukuran OD yang diulang sebanyak 3 kali pada masing-masing
perlakuannya.

42

Tabel 4.5 Nilai Optical Density Secara Triplo

Isolat
Isolat 1

Isolat 2

Isolat 3

Isolat 4

Isolat 5

Isolat 6

Isolat 7

Isolat 8

Isolat 9
Isolat 10

konsentrasi logam
10
30
50
10
30
50
10
30
50
10
30
50
10
30

Rata-rata %T

OD

0.554
0.562
0.524
0.602
0.474
0.568
0.795
0.538
0.589
0.236
0.264
0.245
0.525
0.570
0.517
0.221
0.127
0.155
0.616
0.608
0.582
0.731
0.779
0.747
0.657
0.582
0.619
0.603
0.562
0.5667

0.257
0.250
0.280
0.220
0.324
0.246
0.100
0.269
0.230
0.627
0.579
0.611
0.280
0.244
0.287
0.656
0.897
0.811
0.210
0.216
0.235
0.136
0.109
0.127
0.183
0.235
0.208
0.220
0.251
0.247

50
10
30
50
10
30
50
10
30
50
10
30
50
10
30
50

Pengukuran nilai OD pada Tabel diatas menunjukkan hasil dari rata-rata

absorbansi yang dilakukan secara triplo. Berdasarkan pengukuran konsentrasi
timbal yang digunakan berpengaruh terhadap nilai OD. Penambahan konsentrasi
timbal dengan konsentrasi 10 ppm, 30 ppm dan 50 ppm menunjukkan hasil yang
berbeda. pada isolat 7 dan 10 semakin besar konsentrasi timbal yang
ditambahkan maka nilai OD juga mengalami kenaikan. Sedangkan pada
pengukuran nilai OD isolat lainnya menunjukkan peningkatan dari konsentrasi 10
ppm ke 50 ppm kecuali pada konsentrasi 30 ppm. Konsentrasi timbal 30 ppm
mengalami perbedaan yang signifikan. Nilai OD yang terukur pada konsentrasi

43

ini sangat tinggi. Pada konsentrasi 3o ppm memungkinkan bakteri tumbuh

secara efektif dan maksimal dalam proses bioremoval logam. Pada konsentrasi
tersebut logam dapat diurai dan ditolerir oleh bakteri. Akan tetapi, pada
konsentrasi 50 ppm isolat bakteri juga tumbuh dengan baik dibuktikan dengan
tingginya nilai OD atau nilai kepadatan bakteri.
Pengukuran OD memungkinkan untuk mengetahui pertumbuhan isolat
dengan kondisi lingkungan yang diinginkan. Nilai OD diperoleh dari nilai
transmitan (%T) cahaya berdasarkan pembacaan pada isolat spechtrofotometer.
Nilai OD dapat diperoleh dari log (%T) karena yang terbaca pada isolat
merupakan nilai dari transmitan maka perlu dikonversi untuk mengetahui nilai
OD. Selain nilai OD perbedaan juga tampak pada kekeruhan pada larutan uji
sebelum proses inkubasi dan setelah proses inkubasi. Perbedaan sebelum
inkubasi (Lampiran 11) dan setelah inkubasi (Lampiran 12) tampak pada warna
dan kekeruhannya. Proses inkubasi mengubah warna pada larutan masingmasing tabung. Warna larutan tampak lebih keruh dari sebelum proses inkubasi.
Hal itu dipengaruhi adanya peningkatan jumlah koloni yang tinggi saat proses
inkubasi. Selain itu, isolat bakteri dengan kode Isolat 6 tampak berbeda dari
isolat bakteri lainnya. pada isolat bakteri Isolat 6 lapisan atas tampak berwarna
hijau sedangkan lapisan bawah tetap berwarna kuning (warna media NB)
(Lampiran 12). Selain perubahan warna Isolat 6 merupakan isolat bakteri yang
memiliki nilai OD yang paling tinggi. Berdasarkan pengujian tersebut Isolat 6
merupakan salah satu isolat yang diduga memiliki kemampuan tinggi untuk
mendegradasi logam Pb dari pada isolat lainnya.
Pengukuran OD dilakukan untuk proses skrining lanjutan menentukan dari
10 isolat yang memiliki kemampuan yang lebih tinggi. Berdasarkan pengukuran
OD awal dan pengukuran OD secara triplo menunjukkan adanya potensi pada
tiga isolat yang memiliki nilai OD paling tinggi dari isolat lain. Selain kode isolat
bakteri 6, kode Isolat bakteri 4 dan isolat 5 juga memiliki potensi sebagai bakteri
yang mampu mengurai logam Pb karena nilai OD berdasarkan pengamatannya
tinggi setelah Isolat 6. Berdasarkan penelitian Lewaru dkk (2012) , hasil optical
density (OD) menunjukkan tingkat kepadatan bakteri artinya isolat yang memiliki
nilai OD tinggi tersebut tahan dan dapat beradaptasi terhadap logam.
Isolat 4, 5, dan 6 memiliki nilai OD yang tinggi dibandingkan isolat lain.
Tingginya nilai OD dipengaruhi oleh kepadatan pertumbuhan bakteri. Bakteri
mengalami peningkatan jumlah karena kondisi lingkungan yang sesuai,

44

ketersediaan makanan, serta kecepatan pertumbuhan yang tinggi. Perbedaan

trend pada ketiga isolat untuk mengetahui pengaruh kenaikan nilai OD terhadap
konsentrasi logam serta penurunan nilai OD terhadap konsentrasi logam. Hal ini
dilakukan untuk mengetahui perbedaan kemampuan me-removal logam karena
pada kenyataannya Metode turbidimetri memiliki kelemahan bahwa bakteri tidak
dapat dibedakan antara bakteri yang mati dan bakteri yang hidup. Sedangkan
mekanisme toleran bakteri tergantung pada metabolismenya. Bakteri memiliki
beberapa mekanisme toleran untuk menggunakan ion-ion logam berat.
Mekanismenya termasuk membawa ion logam keluar sel, akumulasi dan
komoleksasi ion logam dalam sel, dan reduksi ion logam berat untuk mengurangi
zat toksik. Proses skrining berdasarkan nilai optical density diperoleh nilai OD
600 nm yang tertinggi pada isolat 4, 5 dan 6. Isolat tersebut dipilih untuk diuji
reduksi logam timbal dengan volume yang berbeda. Ketiga isolat bakteri
dilanjutkan pada tahap selanjutnya yaitu uji reduksi bakteri.
4.4.2 Uji Reduksi Timbal
Uji reduksi logam digunakan untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri
menurunkan logam timbal pada konsentrasi 10 ppm, 30 ppm, dan 50 ppm.
Screening isolat bakteri yang dilakukan berdasarkan metode turbidimetri
menghasilkan tiga (3) isolat bakteri yang memiliki nilai optical density yang tinggi.
Isolat tersebut merupakan isolat 4, isolat 5, dan isolat 6. Kecenderungan nilai OD
yang tinggi pada kondisi lingkungan dengan pencemar timbal menunjukkan
bahwa isolat tersebut tetap mampu bertahan dan berkembang dengan
memperbanyak sel. Uji reduksi timbal dilakukan untuk mengetahui penurunan
konsentrasi timbal pada isolat 4, isolat 5, dan isolat 6. Pengujian dilakukan
dengan perbandingan volume yang digunakan 1 : 20, volume media cair NB
yang digunakan 100 ml, logam pb 50 ml, dan kultur bakteri 10 ml. Kultur bakteri
diperoleh dari penanaman isolat sebanyak satu ose penuh dalam 50 ml NB.
Kultur isolat bakteri yang diperkaya logam timbal kemudian di inkubasi pada
incubator shaker dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 370C selama 24 jam.
Berikut .
Konsentrasi awal Pb berdasarkan pembuatan larutan standar kerja timbal
yang diperoleh berdasarkan rumus pengenceran. Pembuatan larutan standar
diperoleh berdasarkan pembuatan larutan induk dengan menggunakan 1,598
gram Pb(NO3)2 lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 1000 mL. Kemudian
ditambahkan akuades hingga tanda tera lalu dihomogenkan. Pembutan larutan

45

standar mengacu pada Inayah (2010), Larutan baku Pb 100 mg/L di pipet 10 ml,
kemudian dilarutkan dengan air suling dalam labu ukur 100 ml, dihomogenkan.
Sedangkan untuk pembuatan larutan kerja yang digunakan yaitu 10, 30 dan 50
diperoleh berdasarkan rumus pengenceran dimana :
V1.N1 = V2. N2 .. (1)
Keterangan :
V1 = volume total media dalam labu ukur (100 ml)
V2 = Volume larutan Hg yang akan digunakan (ml)
N1 = Konsentrasi logam Hg yang ditentukan (mg/l)
N2 = Konsentrasi logam Hg yang digunakan (100 mg/l)
1. Perlakuan 1 (Logam 10 mg/l)
V1.N1
= V2.N2
100.10 = V2.100
V2
= 1000/100
= 10 ml larutan logam standar 100 mg/l
2. Perlakuan 2 (Logam 30 mg/l)
V1.N1

= V2.N2

100.30

= V2.100

V2

= 3000/100
= 30 ml larutan logam standar 100 mg/l
3. Perlakuan 3 (Logam 50 mg/l)
V1.N1

= V2.N2

100.50

= V2.100

V2

= 5000/100
= 50 ml larutan logam standar 100 mg/l

Berdasarkan hasil tersebut diperoleh konsentrasi awal logam Pb yaitu 10, 30,
dan 50 ppm. Sedangkan nilai Pb setelah perlakuan pada masing-masing isolat
bakteri menggunakan metode pengukuran menggunakan AAS. Metode yang
digunakan seperti terlampir pada hasil pengujian menggunakan metode analisa
APHA.3111 B-2005. Berdasarkan hasil pengujian nilai konsentrasi logam
mengalami penurunan. Pada isolat bakteri Isolat 6 konsentrasi logam 10, 30, dan
50 ppm mengalami penurunan konsentrasi logam menjadi 0,912 , 3,003 , dan 6,
098 mg/l (Lampiran 15). Isolat bakteri Isolat 5 dengan konsentrasi awal yang
sama konsentrasi logam setelah perlakuan menjadi 1,588 , 3, 929, dan 6, 583
mg/l (Lampiran 16). Sedangkan pada Isolat 4 penurunan cukup signifikan pada
kondisi awal konsentrasi logam sama menjadi <0,0044, 0,025 , dan 0,266 mg/l
(Lampiran 16). Berikut merupakan hasil daya reduksi logam Pb oleh isolat 4, 5,
dan 6.

46

Tabel 4.6 Nilai Uji Penurunan Konsentrasi Logam

Isolat bakteri
Isolat 4
Isolat, 5
Isolat, 6

Konsentrasi awal
(ppm, mg/l)
10
30
50
10
30
50
10
30
50

Konsentrasi akhir
(ppm, mg/l)
<0,0044
0,026
0,266
1,558
3,929
6,583
0,912
3,003
6,098

Total reduksi
(ppm,mg/l)
9,996
29,974
49,734
8,442
26,071
43,417
9,088
26,997
43,902

Penurunan logam
(%)
99,96
99,913
99,468
84.42
86,903
86,834
90,88
89.99
87,804

Berdasarkan Tabel penurunan konsentrasi logam dapat disimpulkan bahwa

isolat bakteri Isolat 4 memiliki persentase konsentrasi logam paling tinggi
mencapai 99 % pada ketiga perlakuan yang diberikan. Isolat bakteri Isolat 6 juga
memiliki persentase penurunan logam 90 % pada perlakuan 1, 89% dan 87%
pada perlakuan 2 dan 3. Sedangkan Isolat 5 persentase penurunan logamnya
86% dan 84%. Berdasarkan hipotesa awal Isolat 6 merupakan isolat bakteri kuat
yang mampu menurunkan konsentrasi logam dengan maksimal. Akan tetapi
Isolat 4 pada hasil pengujian memiliki konsentrasi penurunan lebih besar
diantara keduanya. Hal tersebut berbeda dengan pengujian OD yang dilakukan.
Berdasarkan pengujian OD nilai kekeruhan Isolat 6 dan 5 tinggi dimana artinya
bakteri tersebut mampu memperbanyak sel pada kondisi yang sama. Sedangkan
pada Isolat 4 memiliki nilai OD yang relatif kecil. Berdasarkan literature, hal ini
bisa terjadi karena perbedaan metabolisme sel mikroba. Faktor lain yang
mempengaruhi adalah logam Pb yang diproses oleh bakteri dalam proses
metabolismenya. Pengujian logam pb hanya dilakukan pada cairan yang
merupakan media tumbuh sedangkan pengujian logam pb yang tertinggal dalam
tubuh bakteri tidak diuji sehingga berpengaruh pada nilai akhir penurunan logam.
Oleh karena itu dilakukan pengujian ulang untuk mengetahui tingkat penurunan
dari ketiga isolat.

4.5 Reduksi Logam Timbal

Pengujian reduksi logam dilakukan untuk mengetahui isolat yang memiliki
daya reduksi yang lebih baik. Pengujian reduksi dilakukan pada konsentrasi yang
sama saat proses skrining isolat bakteri. Akan tetapi, pada uji reduksi logam
volume media, logam, serta bakteri lebih besar. Perbandingan yang digunakan
47

1 : 20, volume media cair NB yang digunakan 100 ml, logam pb 50 ml, dan kultur
bakteri 10 ml. Kultur bakteri diperoleh dari penanaman isolat sebanyak satu ose
penuh dalam 50 ml NB. Inkubasi dilakukan menggunakan incubator shaker
dengan kecepatan 120 rpm, suhu 370C selama 24 jam. Besarnya daya reduksi
logam dapat diketahui berdasarkan rumus yang dijelaskan pada bab 3.
Pada tahap skrining, diperoleh 3 isolat bakteri yang mampu bertahan pada
konsentrasi 10, 30, dan 50 dengan nilai OD memiliki 2 kecenderungan. Nilai OD
yang naik tiap konsentrasi serta nilai OD yang turun seiring meningkatnya
konsentrasi logam yang diberikan. Selain itu, bakteri diuji tingkat reduksinya
terhadap Pb yaitu 10, 30, dan 50 ppm. Penentuan konsentrasi jauh diatas
konsentrasi Pb di tanah TPA Supit Urang yaitu 0,57 mg/l (ppm), agar
memungkinkan untuk mengurangi pencemaran Pb ditanah TPA serta wilayah
lainnya. Berikut merupakan hasil kultivasi dari ketiga isolat bakteri.

Gambar 4.7 Isolat 4

Gambar 4.8 Isolat 5

Gambar 4.9 Isolat 6

Uji kemampuan isolat bakteri dalam menurunkan logam berat di medium

tumbuh dilakukan dengan menginokulasikan 1 ose penuh koloni bakteri ke dalam
50 mL medium NB dan diinkubasi Selama 24 jam. Volume media yang
diperbesar dari sebelumnya menunjukkan warna dan karakteristik masingmasing isolat yang semakin jelas (Lampiran 13). Setelah menumbuhkan bakteri
kemudian menginokulasikan 10% (v/v) isolat bakteri ke dalam 100 ml NB yang
diperkaya Pb(NO3)2 pada masing-masing konsentrasi 50 ppm selama 24 jam.
Berdasarkan gambar diatas, perbedaan isolat 4, 5, dan 6 terlihat sangat berbeda.
Isolat 4 memiliki warna kuning pucat setelah inkubasi 24 jam. Hal tersebut
diakibatkan tingginya tingkat kekeruhan karena pertumbuhan yang cepat. Pada
isolat 5, memiliki warna kuning bening, dimana hal tersebut dipengaruhi
karakteristik isolat 5 pada tahap pertumbuhan pada media padat. Bakteri isolat 5
pada pertumbuhan dimedia padat sangat transparan. Berbeda dengan isolat 6

48

yang mengalami perubahan warna menjadi hijau. Perubahan warna tersebut

dipengaruhi oleh perbedaan metabolisme bakteri dalam menurunkan logam
timbal. Perhitungan jumlah reduksi bakteri terhadap Pb dilakukan menggunakan
spektrofotometerr serapan atom (SSA). Penurunan konsentrasi logam dilakukan
dengan pengujian di Perum Jasa Tirta Malang (PJT) pada ke-9 sampel. Sebelum
pengujian, isolat bakteri pada masing masing perlakuan di sentrifugasi
menggunakan refrigerated sentrifuse. Gambar dibawah ini menunjukkan
suspensi sebelum sentrifuse dan setelah sentrifuse.

Gambar 4.10 Isolat Sebelum sentrifuse

Gambar 4.11 Hasil Sentrifugasi

Sentrifuse dilakukan untuk memperoleh supernatan cairan Pb dan

memisahkan cairan dan padatan (bakteri). Sentifugasi dilakukan pada ke-9
sampel dengan kecepatan 10.000 rpm dengan suhu 250C selama 5 menit.
Hasilnya akan diperoleh cairan media yang mengandung Pb setelah proses
inkubasi dan pada bagian bawah tube merupakan endapan dari bakteri
(Lampiran 14). Berdasarkan gambar 4.10 larutan uji sebelum proses sentrifugasi
memiliki warna yang sangat keruh dan terdapat bakteri pada larutan. Akan tetapi,
setelah proses sentrifuse larutan uji menjadi sangat bening dan tampak bakteri
dibagian bawah tube berwarna coklat kehitaman. Larutan uji hasil sentrifuse
kemudian dipindahkan ke botol sampel uji untuk dilakukan proses pengujian.
Pemindahan larutan harus dipastikan bakteri yang tertinggal tidak ikut tertuang
Botol sampel kemudian diberi keterangan berdasarkan konsentrasi logam dan
jenis isolatnya.
Pengujian dilakukan pada ketiga isolat dengan konsentrasi 50 ppm.
Konsentrasi tersebut dipilih karena merupakan konsentrasi tertinggi. Dimana
konsentrasi tersebut dapat mewakili konsentrasi lainnya. Konsentrasi logam yang
diberikan sebagai perlakuan juga diujikan untuk memastikan konsentrasi

49

awalnya. Hasil pengujian konsentrasi logam hanya 0.204 ppm. Hal ini
disebabkan karena adanya perubahan logam akibat kesalahan pada
penyimpanan larutan induk Pb(NO3)2. Logam yang diperoleh dari larutan induk
yang dibuat bulan November 2015. Perbandingan volume media tumbuh, logam
dan suspensi bakteri menggunakan perbandingan yang sama berdasarkan
pengujian awal. Gambar berikut adalah penurunan logam pb oleh logam.

0.4
0.35
0.3

0.14
0.07

0.12

0.25
Penurunan logam

0.2
0.15

Konsentrasi awal
0.24

0.24

0.24

Isolat 4

Isolat 5

Isolat 6

0.1
0.05
0

Gambar 4.12 Rata-Rata Penurunan Logam Timbal

Gambar diatas merupakan diagram batang yang menunjukkan adanya

perbedaan penurunan pada masing masing isolat. Warna biru merupakan
konsentrasi awal logam timbal sebelum diberikan perlakuan yaitu penambahan
suspensi bakteri. Sedangkan warna merah menunjukkan nilai hasil reduksi
logam timbal setelah perlakuan. Nilai penurunan diperoleh dengan mengurangi
data konsentrasi awal dengan konsentrasi akhir. Berikut dibawah ini Tabel yang
merupakan data hasil pengujian logam timbal.

Tabel 4.7 Nilai Penurunan Konsentrasi Logam Timbal

Nama

Konsentrasi awal

Konsentrasi akhir

Penurunan logam

isolat
(mg/l)
(mg/l)
(%)
Isolat 4
0.132 a
35.294
Isolat 5
0.204
0.063 a
69.120
Isolat 6
0.08 a
60.784
Keterangan : nilai yang memiliki notasi berbeda adalah signifikan/berbeda nyata

50

Penurunan konsentrasi logam isolat bakteri Isolat 4, 5, dan 6 pada data

awal (Tabel 4.6) sudah memiliki persentase yang cukup tinggi. Berdasarkan hal
tersebut 3 isolat merupakan bakteri yang mampu mengurai logam Pb yang
berpotensi sebagai bioremoval. Pengujian ulang terhadap daya reduksi logam pb
pada konsentrasi tersebut juga menunjukkan persentase yang tinggi. Penurunan
logam ketiga isolat mencapai 60 %. Berdasarkan data awal, pada konsentrasi
yang sama isolat 4 memiliki nilai persentase lebih rendah yaitu 35 %. Sedangkan
pada isolat 5 dan 6 persentase penurunan dari persentase penurunan 69% dan
60 %. Perbedaan nilai persentase karena waktu pengujian berbeda. Data pada
Tabel 4.7 dilakukan 3 bulan setelah pengujian data awal. Faktor yang
mempengaruhi adalah logam timbal yang digunakan. Logam pb yang diperoleh
dari pelarutan senyawa timbal (II) Nitrat lebih baik langsung digunakan. Proses
penyimpanan akan mempengaruhi konsentrasi logam.
Akan tetapi, berdasarkan pengujian statistik uji t yang dilakukan
menunjukkan bahwa pemberian logam berpengaruh nyata terhadap penurunan
logam timbal. Uji t dilakukan untuk mengetahui adanya pengaruh pemberian
konsentrasi logam terhadap penurunan logam. Hasil dari T hit yang berdasarkan
data nilai konsentrasi awal dan konsentrasi akhir adalah 5.412, nilai tersebut
dibandingkan dengan taraf uji atau selang kepercayaan 95 % yaitu 2.92.
Berdasarkan data tersebut dapat ditarik kesimpulan, nilai t hitung lebih besar dari
nilai t Tabel sehingga pemberian konsentrasi logam terhadap isolate
berpengaruh nyata terhadap penurunan konsentrasi logam pada persentase 35
%. 69 %, dan 60 %. Sedangkan berdasarkan uji beda nyata terkecil (BNT) 5 %
sebesar 0.135. Pengujian BNT dilakukan untuk mengetahui adanya pengaruh
perbedaan penggunaan isolat bakteri sebagai agen bioremoval logam timbal
(pb). Nilai uji BNT dibandingkan dengan selisih nilai tengah dari niali rata-rata
penurunan logam. Hal ini menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan penggunaan
isolat untuk menguraikan logam pb. Berdasarkan notasi yang sama, baik isolat
4, 5, dan 6 memiliki kemampuan untuk mendegradasi atau menurunkan
konsentrasi logam timbal dengan kemampuan yang berbeda. perhitungan uji
statistik pada pengujian BNT dan uji t dapat dilihat pada lampiran. Gambar
berikut merupakan penurunan logam timbal oleh isolat 4, 5, dan 6
Kemampuan mikroba yang digunakan dalam proses detoksifikasi logam
yang dikenal dengan istilah bioremediasi. Menurut Suhendrayatna (2001),

51

mekanisme pembersihan logam berat oleh mikroorganisme sebagian besar

merupakan proses pertukaran ion. Mekanisme ini dapat dibagi atas 3 cara yaitu
berdasarkan metabolisme sel yang dibagi atas; proses yang terkait pada
metabolisme dan proses yang tidak terkait pada metabolisme sel, sedangkan
berdasarkan posisi logam berat dapat dibagi atas; akumulasi ekstraseluler
(presipitasi), akumulasi intraseluler dan penyerapan logam oleh permukaan sel.
Pada proses metabolisme, logam berat terakumulasi pada membran sel
(ekstraseluler) dan pada sitoplasma (intraseluler) (Wulandari dkk., 2001).
Akumulasi logam Pb oleh bakteri berdasarkan posisi logam berat dibagi atas
akumulasi ekstraseluler, akumulasi intraseluler dan penyerapan oleh permukaan
sel. Akumulasi ekstraseluler dapat terjadi karena pengikatan ion- ion logam oleh
polimer atau polisakarida ekstraseluler yang dihasilkan oleh sel-sel mikroba dan
interaksi antara ion-ion logam bermuatan positif dengan sisi reaktif pada
permukaan sel yang bermuatan negatif, sedangkan akumulasi intraseluler terjadi
karena proses difusi yang tidak membutuhkan aktivitas mikroba secara langsung
dimana gen-gen di dalam plasmid yang mengendalikan proses metabolisme
tersebut (Wulandari dkk., 2001).
. Struktur komplek dalam mikroorganisme memiliki banyak cara untuk
membawa logam ke dalam sel mikroba. Oleh karena itu, mekanisme biosopsi
logam tergantung pada metabolisme sel, mekanisme biosorpsi dibagi 2 yaitu :
1. Metabolisme dependent
2. Non- metabolisme dependent
Ketergantungan dimana lokasi removal logam dari larutan yg ditemukan
1. Extra cellular accumulation
2. Cell surface sorption
3. Intracellular accumulation
Tranisolator logam yang melewati membrane sel akan menghasilkan akumulasi
intraselular, dimana tergantung pada metabolisme sel. Biosorpsi hanya
mengambil tempat sel hidup. hal tersebut berkaitan dengan sistem pertahanan
aktif mikroorganisme, dimana akan memberi reaksi adanya racun logam.
Disamping itu, non metabolisme dependent biosopsi, logam diserap dengan
interaksi physico-chemical antara logam dan fungsional grop pada permukaan
sel mikrobahal ini merupakan dasar pada penyerapan fisik, pertukaran ion dan
penyerapan kimia, dimana tidak tergantung pada metabolisme sel (Nanda et all,
2011).

52

Tingkat penurunan logam yang tinggi pada ketiga isolat, mengindikasikan

adanya bakteri indigenous (lokal) pada tanah tercemar lindi di TPA Supit Urang.
Selain data penurunan logam, data karakteristik mikroskopik juga bisa digunakan
sebagai parameter untuk mendekati spesies bakteri. Berdasarkan karakteristik
mikroskopik, isolat bakteri memiliki pewarnaan gram positif dengan bentuk sel
basil. Gambar berikut merupakan hasil pewarnaan gram pada isolat 4, 5, dan 6.

Gambar 4.13 Isolat 4

Gambar 4.14 Isolat 5

Gambar 4.15 Isolat 6

Pengamatan secara mikroskopik menunjukkan kesamaan bentuk dan

gram dari ketiga isolat. Isolat bakteri tergolong bakteri yang memiliki granm
positif dan berbentuk basil. Menurut Isa (2013), bakteri Bacillus sangat toleran
terhadap logam Pb bakteri tersebut memiliki karakteristik sel berbentuk batang
mempunyai ukuran 0,3-2,2 m x 1,27-7,0 m, dapat bergerak (motil),
membentuk endoisolatora, tidak lebih dari satu dalam satu sel isolatorangium,
gram positif, aerobik dan anaerobik fakultatif, dan umumnya dijumpai di tanah.
Sedangkan menurut Rani et all (2010), pada dasarnya, Bacillus isolat.,
Pseudosomonas isolat, dan Micrococcus isolat telah teridentifikasi resisten
terhadap Cu, Cd, dan Pb. Akan tetapi, pada penelitian ini tidak dilakukan uji lanjut
untuk mengetahui spesies dari ketiga isolat. Pengelompokan isolat diperlukan uji
lanjut seperti uji biokimia dan uji molekuler. Dari hasil penelitian ini, ketiga isolat
mampu mereduksi logam berat hingga mencapai persentase penurunan 99 %.

53