Southern blotting

Dinamai setelah penemunya, biologi Edwin Selatan, Selatan Blot adalah metode untuk
menyelidiki keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel DNA. DNA sampel sebelum atau
setelah pencernaan enzim restriksi dipisahkan dengan elektroforesis gel dan kemudian ditransfer
ke membran dengan blotting melalui aksi kapiler. Membran tersebut kemudian terkena probe
DNA berlabel yang memiliki urutan basa pelengkap untuk urutan DNA pada bunga. Kebanyakan
protokol asli yang digunakan label radioaktif, namun non-radioaktif alternatif yang sekarang
tersedia. Southern blotting kurang umum digunakan dalam ilmu laboratorium karena kapasitas
teknik lain, seperti PCR, untuk mendeteksi urutan DNA spesifik dari sampel DNA. Bercak ini
masih digunakan untuk beberapa aplikasi, bagaimanapun, seperti mengukur jumlah salinan
transgen pada tikus transgenik, atau rekayasa gen sel induk garis KO embrio.
Southern blot adalah suatu teknik yang dikembangkan oleh Edwin. M. Southern pada
1975, seorang ahli biologi asal Inggris. Teknik ini digunakan untuk pendeteksian suatu DNA
sequence spesifik (gen atau lain) dalam sample kompleks DNA (selular DNA). Ini juga
digunakan untuk menentukan bobot molekular suatu restriksi fragmen dan untuk mengukur
sejumlah relatif dalam sample berbeda. Di bawah kondisi-kondisi optimal, Southern blot
mendeteksi ~ 0.1 pg DNA yang menarik. Blot teknik digunakan untuk memindahkan protein
DNA dan RNA ke suatu pengangkut sehingga dapat dipisahkan, dan sering juga diikuti
penggunaan suatu gel ectrophoresis. Southern blot digunakan untuk memindahkan DNA.
Digunakan biologi molekular untuk melihat kemungkinan kehadiran suatu urutan DNA dalam
suatu sample DNA. Southern blot Selatan berkombinasi gel agarose electrophoresis untuk
separasi ukuran DNA dengan metoda untuk memindahkan DNA ke suatu membran filter untuk
pemeriksaan hybridisasi. Metoda lain adalah Western blot dan Northern blot memiliki prinsip
kerja yang sama tetapi menggunakan RNA dan protein.
Setelah electrophoresis, gel tersebut diperlakukan dengan suatu alkali yang menyebabkan
DNA terdenaturasi dan terpisah menjadi rantai tunggal. Suatu membran seperti selaput
ditempatkan pada gel dan diberi tekanan melalui pengisapan atau metoda mundane dalam kertas
handuk (paper towels) dengan suatu berat. DNA berpindah tempat ke membran dan stick.
Membran DNA-impregnanted dibakar atau menyebar secara permanen dengan menyertakan
DNA tersebut. Molekul yang kemudian diperlakukan dengan suatu pemeriksaan hybridisasi yang
mana hanya suatu molekul DNA dengan urutan dikenali yang akan dipasangkan dengan urutan
DNA yang telah ditandai (diblot). Pemeriksaan DNA berlabel dengan fluorescents atau
chromogenic berpijar sehingga dapat teridentifikasi. Dengan pengujian pola dari hybridisasi
dengan sinar X atau Autoradiografi, peneliti dapat menentukan fragmen yang berisi DNA
sequence spesifik atau gen.
Southern blots digunakan penemuan gen dan pemetaan, evolusi dan studi pengembangan,
forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk memodifikasi pada organisme, Southern
blot digunakan sebagai test untuk memastikan bahwa bagian DNA tertentu mengenal urutan gen.
Southern blot analysis untuk menandai karakter transforman. Southern blot analysis bermanfaat
untuk mengidentifikasi bentuk berbeda, menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah
copy dan untuk mendeteksi gross DNA penyusunan kembali yang mungkin telah terjadi
perubahan. Jika kamu sedang menganalisis galactosidase dengan memasukkan atau
menyisipkan dan dipotong potong dengan EcoRV maka akan dihasilakn potongan sekitar 1kb

dari atas dan bawah dari urutan galactosidase persandian dimulai. Pemecahan oleh enzim
restriksi, Analisis Gel, dan bloting.
Ini adalah prosedur standar dari Southern blot analysis.
1. dipecah sedikitnya 1 ug gen Drosophila dengan enzim restriksi yang sesuai. Dipecah 1 5 ug
DNA dalam volume 20 ul dengan 10 unit enzim. Pemecahan dilalukan selama 4 12 jam.
2. Periksa kualitas pemecahan dengan analisis 100 ng dari tiap sample dalam minigel. meliputi
sample control yang belum dipecah sebagai perbandingan. Sample yang telah dipecah tampak
sebagai band band dari repetitif sequen (urutan berulang) yang dapat diperlihatkan.
3. Sisa DNA 1% pada gel agarose meliputi jalur dengan penanda lamda untuk gel yang diwarnai
dengan ethidium bromida dan difoto.
4. Gel diwarnai selama 20 menit dalam 1ug/ml ethidium bromida. Destain dalam air selama 10
menit dan difoto.
5. Serap gel selama 15 menit dalam 0.12 M HCL bromophenol blue hingga menguning.
6. Serap gel dalam 0.4 M NaOH selama 30 menit.
7. Potong 3 potongan dalam memblot kertas yang akan meluas sekitar 1 inci di luar gel pada
empat sisi. Rendam masing-masing dengan 0.4 M NaOH Dan tumpukan dalam suatu kaca.
8. Potong gel sampai pertengahan dan membuang bagian puncaknya. Dengan memotong jalur
pertengahan, identasi akan tertinggal di puncak gel dimana gel diratakan dengan prosedur
blotting, dan ini dapat digunakan untuk penyaringan baik telah ditempatkan dia tas gel.
Hempaskan gel yang tak teratur dan menempatkannya pada pertengahan tumpukan kertas hisap
untuk mendorong ke luar gelembung udara.
9. Gel dilemparkan disebabkan DNA pada umumnya semakin dekat kepada sisi bawah gel.
frame gel dengan potongan plastik. Plastik meluas di bawah tepi gel dari 1 2 milimeter. dengan
perlahan memaksa gelembung udara memberes bebas dari gel. Plastik mencegah penyangga
mengalir di sekitar gel.
10. Suatu potongan Genescreen yang lebih untuk memenuhi ukuran gel. Permukaan basah gel
dengan beberapa tetesan 0.4 M NaOH. perlahan lahan meletakkan gen menyaring ke
permukaan gel. Hindari menjerat gelembung udara di bawah saringan juga menghindari
bergesernya saringan yang berhubungan dengan gel seperti beberapa DNA mungkin telah mulai
untuk dipindahkan ke saringan.
11. Dua potongan kertas hisap untuk memenuhi Genescreen dan meletakkan hingga lembar
tersebut mengeringkan pada waktu yang sama di atas saringan. Kertas pertama basah, dan
melicinkannya sebelum menambahkan yang kedua. Potongan yang kedua basah sepenuhnya
mengumpulkan tumpukan paper towels.
12. Menumpuk 1 inchi lapisan dari paper towels di atas potongan puncak kertas hisap. Towels
harus memotong untuk memenuhi ukuran saringan.
13. Tempatkan potongan flat/plexiglass atau kaca yang diletakkan di paling atas. Menimbang
tumpukan yang hancur bersama suatu botol yang berisi 200 500 ml tentang segala bentuk.
Kemudian DNA dipindahkan selama 6 jam.
14. Setelah transfer, dipindahkan ke saringan dandiserap selama 15 menit dalam 200 ml 0.2 M
Tris-Cl pH 7.5, 2X SSC.
15. Blot filter dikeringkan dengan paper towels dan kemudian dibiarkan kering selama
sedikitnya 1 jam. Saringan dapat disimpan bila telah kering, keadaan ini cukup untuk

menentukan DNA ke dalam saringan. Tidak kebutuhan untuk membakar saringan genescreen
untuk menyertakan DNA.
Persiapan DNA radiolabeled untuk menyelidiki Southern blot. Beberapa kotak persediaan
berbeda untuk pemeriksaan radiolabeling. Kotak berdasarkan pada cat dasar acak menghasilkan
radioaktif memeriksa dengan aktivirtas kira-kira 109 cpm/ul. Suatu fragmen DNA gel-purified
akan disediakan untuk reaksi dasar yang acak. Sejak reaksi dasar paling acak terutama yang
sama, prosedur yang berikut dapat digunakan untuk memindahkan unincorporated radioactive
nucleotide
1. Stop reaksi dengan menambahkan 0.5 M EDTA dengan konsentrasi akhir kira-kira 20 mM.
2. Tambahkan Nambahkan 400 ul TE, 1 ul 5 mg/ml DNA salmon dan 20 ul 100 mM spermine.
Campuran dengan baik.
3. Inkubasi di atas es selama 15 menit, sentrifugasi mesin selama 15 menit dan buangan
supernatant.
4. Pecahkan butir pada 37o C dalam 50 ul 0.5 M NaCl/TE selama 10 menit untuk memecahkan.
5. Tambahkan 200 ul TE dan menghitung jumlah kecil untuk menentukan efisiensi label DNA.
Simpan pemeriksaan di dalam lemari es.
Analisis Southern blot dengan pemeriksaan radiolabeled. Saringan pertama direndam untuk
periode yang singkat dalam pemeriksaan campuran hybridisasi. Kemudian pemeriksaan
ditambahkan secara langsung hybridisasi solusi. Tidak ada prehybridisasi campuran khusus.
1. Gulung blot ke dalam silinder sehingga sisi DNA sisi ke arah pusat silinder dan menempatkan
blot dalam tabung 50 ml.
2. Siapkan kira-kira 10 ml hybridisasi campuran (minus probe) dalam 200 ul 5 mg/ml DNA
salem sonicated selama 5 menit dan vampurkan secara menyeluruh 10 ml 6X SSC, 50%
Formamide, 1% SDS, 10% Dextran Sulfate. (30 ml solusi yang kekurangan DNA salmon dapat
dibuat dengan meletakkan 9 ml 20X SSC, 15 ml Formamide, 3 ml 10% SDS, 3 g Sodium
Dextran Sulfate ke dalam suatu tabung 50 ml dan putar campuran itu dalam tungku hybridisasi
tungku pada suhu 42o C selama beberapa jam. Simpan campuran pada 20o C dan suhu panas
42o C sebelum penggunaan)
3. tambahakan campuran hybridisasi ke dalam tabung yang berisi blot, cap tabung, dan berputar
tabung dalam tungku hybridisasi pada suhu 42o C selama minimal 15 menit.
4. Didihkan 5 10 juta cpms dalam volume 200 ul TE selama 5 menit dan kemudian
menempatkan pemeriksaan di atas es.
5. Mindahkan tabung yang berisi blot dari tungku hybridisasi dan menambahkan pemeriksaan
dengan hybridisasi solusi. Mengikhtisarkan tabung, campurkan dan kembali tabung ke tungku
hybridisasi. Putar tabung dengan suhu 42oC.
6. Hari berikut, menuangkanhybridisasi radioaktif dan mencampurkan ke dalam tabung untuk
dipergunakan kembali jika diperlukan. Menyimpan campuran hybridisasi dalam lemari es.
(untuk digunakan pemeriksaan kembali, didihkan campuran selama 15 menit)
7. Siapkan total 200 ml 2X SSC, 0.5% SDS untuk mencuci blot. Tambahkan kira-kira 30 ml dari
solusi ini ke dalam tabung yang berisi blot itu, rekap dan berputar tabung pada suhu 25C selama
15 menit. Buang dengan mencuci limbah radioaktif dan mengulangi memeriksa prosedur dua
kali.

8. Pindahkan blot dari tabung 50 ml dan cuci blot selama 15 menit pada suhu-kamar dalam baki
dengan 2X SSC, 0.5% SDS (~ 100 ml). buang tabung radioaktif.
9. Siapkan 200 ml 0.1X SSC, 0.1% SDS dan dalam keadaan hangat atau pada suhu 55o C.
10. Gulungkan tblot ke dalam suatu silinder dengan sisi DNA ke arah pusat dan menaruhnya ke
dalam tabung baru 50 ml. Tambahkan 30 ml 0.1X SSC, 0.1% SDS pada blot dan putar tabung
dalam tungku hybridisasi selama 15 menit pada suhu 55o C. Buang dengan mencuci dan
mengulangi memeriksa prosedur sampai solusi habis tercuci.
11. Pindahkan blot dari tabung dan tempatkan pada flat potongan plastik. Blot cairan kelebihan
dibuang tetapi tidak dengan saringan untuk dikeringkan sepenuhnya.
12. Singkapkan saringan ke film sinar x Penyinaran memfilmkan dalam intensif screen.
Ini adalah suatu ringkas dari Southern blot dilakukan dan seperti apa data yang dapat diperoleh.
Southern blots memberikan penyelidikan atau analisis untuk menentukan bobot molekular suatu
restriksi fragmen-fragmen dan untuk mengukur sejumlah relatif dalam contoh berbeda.
1. DNA (genomic atau sumber lain) dipecah dengan enzim restriksi Enzim restriksi endonuclease
digunakan untuk memotong high-molecular-weight DNA strands ke dalam fragmen yang lebih
kecil. DNA fragmen kemudian adalah di electroforisis pada suatu agarose gel untuk dipisahkan
berdasarkan ukurannya pada umumnya nampak sebagai band. DNA terdenaturasi menjadi rantai
tunggal denganinkubasi dengan NaOH.
2. Jika sebagian dari fragmen DNA lebih besar dari 15 kb, kemudian sebelum di blot, gel
mungkin diperlakukan dengan suatu asam, seperti HCL encer, yang depurinates fragmen DNA,
memotong DNA ke dalam potongan lebih kecil, dengan begitu membiarkan perpindahan yang
lebih efisien dari gel ke membran. DNA ditransfer ke membran seperti lembaran dari kertas
hisap khusus. DNA fragementsw mempertahankan pola separasi yang sama dalam gel. Blot di
inkubasi dengan banyak copy dalam pemeriksaan yang merupakan DNA single-stranded.
3. Jika metoda perpindahan alkali digunakan, gel yang mengandung DNA ditempatkan ke dalam
suatu solusi bersifat alkali (Secara khas berisi Sodium hydroxide) untuk mengubah sifat DNA
yang double-stranded. Denaturation dalam lingkungan bersifat alkali menyediakan untuk ikatan
DNA yang bermuatan negatif ke dalam membran bermuatan positif, memisahkannya ke dalam
rantai DNA tunggal untuk pemeriksaan hybridisasi dan menghancurkan RNA residu yang masih
hadir dalam DNA.
4. Pemeriksaan ini akan membentuk base pairs dengan DNA sequence yan komplit dan band
dalam bentuk molekul DNA double-stranded. Pemeriksaan tidak bisa dilihat tetapi selain dengan
radioaktif atau enzim dapat di lihat (phosphatase bersifat alkali atau horseradish peroxidase).
5. Penempatan lokasi pemeriksaan diungkapkan dengan inkubasi substrate tanpa terwarnai itu
mengikat enzim mengkonversi produk diwarnai yang dapat dilihat atau menyemburkan cahaya
yang akan disingkap dengan sunar X. Jika pemeriksaan telah diberi label dengan radioaktifitas,
dapat menyingkapkan film sinar X secara langsung. Misalnya pada Southern Blot analysis of
DNA Panel yang kiri adalah suatu gel electrophoretic yang diwarnai dengan ethidium bromida.
Total DNA telah diekstrak dari 9 clon plasmid (lanes ## 1-9), yang didigesti dengan pembatasan
endonuclease restriksi tertentu dan yang dipisahkan menurut ukuran oleh electrophoresis. DNA
yang terlihat dinodai nampak dengan tidak ada ikatan terpisah, tidak satupun urutan DNA hadir
lebih dari satu copy. Molekular dengan berat standar Standard mempunyai satu rangkaian

fragmen DNA dari ukuran dikenal. Suatu clon fragemen DNA telah terisi muatan lane # 10:
beban standar menandai adanya ukuran sekitar 400bp.
Panel tenggah adalah suatu southern blot autoradiogram gel yang sama. DNA dalam gel
telah ditransfer (yang dinodai) ke suatu filter, kemudian filter diunjukkan ke suatu DNA
radioactively-labelled yang dibuat dari DNA memuat jalur # 10. Saringan kemudian adalah
diunjukkan dengan fil sinar X. Di mana pemeriksaan DNA ditemukan suatu urutan homolog
sepancaran yang di nodai, base-pairs (hybridizes) untuk DNA. Radioaktifitas kemudian
menyingkapkan film itu dan menghasilkan suatu band gelap di atas film sinar X.
Panel kanan adalah suatu bagan untuk southern autoradiogram, isi informasi adalah kehadiran
atau ketidakhadiran suatu band serta ukurannya. Kehadiran suatu band menunjukkan bahwa
urutan DNA homolog dalam pemeriksaan itu DNA hadir dalam clone ## 3, 4,& 8, dengan ukuran
yang sama ketika pemeriksaan, dan ketidakhadiran clone ## 1 , 2, 5,& 9. Di jalur # 6 urutan
homolog yang hadir tetapi dengan suatu lokasi pembatasan tambahan yang memotong fragmen
itu menjadi dua fragmen lebih kecil. Analisa ini menunjukkan bahwa gen menarik menjadi clon
sukses dengan satuan tertentu dalam plasmid, dan ada variasi genetik dalam clone #6. Gen ini
sekarang dapat dianalisa lebih lanjut.
A. Pria normal : ikatan tunggal yang ukurannya normal serta tidak mengandung metil
B. Wanita normal : dua ikatan yang ukurannya normal, satu tidak mengandung metil (kromosom
X aktif) dan satu mengandung metil (kromosom X yang tidak aktif)
C. Pria premutasi : ikatan tunggal yang ukurannya ditingkatkan serta tidak mengandung metil.
Premutation ini mempunyai 75 pengulangan (diukuran oleh analisis PCR).
D. Wanita premutation : empat ikatan dengan pola tidak mengandung metil (X aktif)) dan
mengandung metil (X tidak aktif) bentuk kedua-duanya premutasi dan ikatan normal.
Premutation ini mempunyai 92 pengulangan (diukuran oleh analisis PCR)
E. Pria mutasi penuh : ikatan > 200 pengulangan yang ikatannya mengandung metil.
Ketidakhadiran suatu ikatan tidak mengandung metil normal. Dalam hal ini ada tiga ukuran
mutasi penuh berbeda, 280, 430 dan 920 pengulangan (diukur dengan Southern blot analysis)
F. Wanita, mutasi penuh : ikatan > 200 pengulangan yang ikatannya mengandung metil. Dua
ikatan normal dari allel yang normal adalah juga tersedia. Mutasi penuh ini mempunyai 355
pengulangan (diukur dengan Southern blot analysis)
G. Pria mosaik : Mutasi penuh dan premutation. Dalam hal ini mutasi yang penuh mempunyai
510 pengulangan (diukur dengan Southern blot analysis) dan premutation mempunyai 84
pengulangan (diukur dengan analisis PCR)
Metode ini mengkombinasikan elektroforesis gel agarosa untuk memisahkan DNA
berdasarkan ukurannya dan kemudian ditransfer ke membran filter untuk selanjutnya dilakukan
hibridisasi dengan probe. Untuk mengidentifikasi ataupun melacak suatu fragmen DNA spesifik
diperlukan suatu pelacak (probe). DNA dipisahkan terlebih dahulu dengan elektroforesis. Probe
yang dilabel akan terhibridisasi pada pita-pita DNA untuk mengetahui apakah DNA
tersenonetheless mengandung gen yang diinginkan. Southern blot mendeteksi ssDNA dengan
menggunakan DNA sebagai pelacak. Selain Southern Blot metode lain yang mirip dan
dikembangkan dari Southern Blot adalah Western Blot Northern Blot dan Southwestern Blot
yang memiliki prinsip yang sama namun molekul yang akan dideteksi dan pelacak yang
digunakan berbeda. Kegunaan dari Southern Blot adalah untuk menganalisis keberadaan mutan

yang ada pada suatu organisme dan dapat diketahui ukuran dari gen yang menjadi mutan pada
organisme tersenonetheless.
==Aplikasi
Teknik Southern Blot telah digunakan dalam berbagai aplikasi di bidang kesehatan maupun pada
rekayasa genetika. Salah satunya digunakan untuk menganalisis sistem major histokompatibilitas
pada tikus dan menganalisis penyusunan klon dari gen T-cell receptor penyakit luka yang
diakibatkan oleh mikosis dari fungoides.Gunther E Wurst W Wonigeit K Epplen JT. Analysis of
the rat major histocompatibility system by Southern blot hybridization. J Immunol 143(2);12571261.Dosaka N Tanaka T Fujita M Miyachi Y Horio T Imamura S. 1989. Southern blot analysis
of clonal rearrangement of T-cell receptor gene in plaque lesion of mycosis fungoides. J Invest
Dermatology 93;626-629.
Tahapan Southern Blot
Tahap awal dari metode Southern Blot adalah pendigestian DNA dengan enzim restriksi
endonuklease sehingga terbentuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil. Kemudian DNA
dipisahkan sesuai ukuran dengan elektroforesis agarosa. Setelah DNA terpisah dilakukan
pemindahan DNA ke membran nitroselulosa tahap ini disenevertheless dengan tahap blotting.
Membran nitroselulosa diletakkan pada bagian atas dari gel agarosa. Pada teknik blotting dengan
menggunakan vakum membran diletakkan pada bagian bawah gel. Tekanan diberikan secara
merata pada gel untuk memastikan terjadi kontak antara gel dengan membran. Proses transfer
berlangsung dengan memanfaatkan daya kapilaritas. setalah DNA ditransfer ke gel membran
nitroselulosa dipanaskan dengan suhu tinggi (60oC-100oC) kemudian membran diberi radiasi
UV agar terbentuk ikatan kovalen dan permanen antara pita-pita DNA dengan membran. Lalu
membran dicampur dengan probe (pelacak) yang telah dilabel radioaktif tetapi dapat juga
digunakan tag nonradioaktif yang dapat berpendar. Probe yang digunakan adalah DNA utas
tunggal yang memiliki sekuen yang akan dideteksi. Probe diinkubasi dengan membran agar
dapat berhibridisasi dengan DNA yang ada pada membran. Setelah proses hibridisasi probe yang
tidak terikat dicuci dari membran sehingga yang tinggal hanya probe yang hibrid dengan DNA di
membran. Pola hibridisasi kemudian dideteksi dengan visualisasi pada film X-ray melalui
autoradiografi.
Pemisahan DNA dan RNA berdasarkan ukuran dengan elektroforesis pada berbagai sistem gel
merupakan teknik dasar yang penting dalam biologi molekuler. Pada pH netral, DNA dan RNA
bermuatan negatif dan akan bermigrasi ke arah anoda. Jika migrasi dilakukan pada matriks
polimer (gel), fragmen kecil akan bergerak lebih cepat daripada fragmen yang besar (Gambar 12). Dengan demikian, migrasi elektroforetik melalui gel akan memisahkan campuran fragmen
DNA sehingga nampak sebagai pita-pita yang berbeda ukurannya. Banyak matriks gel yang
dapat dignakan untuk pemisakhan asam nukleat, tapi yang paling banyak digunakan adalah gel
agarose dan poliakrilamid. Gel agarose sesuai untuk pemisahan fragmen DNA yang berukuran
0.1-20 kb, sedangkan poliakrilamid untuk fragmen Dna berukuran 0.025-2 kb. Denaturan seperti
urea dapat ditambahkan pada gel poliakrilamid untuk dapat memisahkan fragmen DNA sampai
pada tingkat resolusi 1 pb (misalnya untuk sekuensing DNA). Salah satu jenis elektroforesis el
agarose adalah pulsed field gel electrophoresis (PFGE) yang digunakan untuk memisahkan
fragmen DNA yang sangat besar (lebih dari 1000 kb). Untuk melihat fragmen DNA setelah
dipisahkan dengan elektroforesis gel digunakan teknik lain. Jika fragmen DNA cukup banyak,

gel dapat langsung diwarnai (staining) selama atas setelah elektroforesis sehingga DNA dapat
langsung dilihat. Ethidium bromide mengikat DNA dan akan berfluoresensi/berpendar merah
dibawah sinar UV. Jika jumlah DNA terlalu sedikit untuk divisualisasi langsung, radioaktif
digunakan untuk mendeteksi (lihat hibridisasi). Hibridisasi asam nukleat. Hibridisasi asam
nukleat adalah salah satu metode analisis yang paling sering digunakan. Teknik ini digunakan
untuk Southern blotting, Northern blotting dan untuk skrining library. Tujuan metode ini adalah
untuk melihat (visulisasi) sekuens asam nukleat tertentu (DNA atau RNA) dalam
lingkungan/latar belakang campuran sekuens lain yang kompleks. Teknik ini memanfaatkan sifat
DNA yaitu dua untai asam nukleat yang komplemen akan salaing mengikat (hibridisasi) dengan
tingkat spesifisitas yang tinggi. Sebaliknya, sekuens asam nukleat yang nonkomplemen tidak
berikatan secara spesifik, mismatch nukleotida menurunkan temperatur/titik leleh. Untuk
mendeteksi DNA atau RNA tertentu dalam suatu campuran yang kompleks, isi campuran harus
diimobilisasi pada membran dan diubah menjadi bentuk untai tunggal (lihat Southern dan
Northern blotting). Larutan hibridisasi yang mengandung probe untai tunggal yang dilabel
radioaktif ditambahkan agar terjadi hibridisasi pada kondisi tertentu. Temperatur dan konsentrasi
garam pada larutan hibridisasi menentukan kespesifikan pengikatan. Pada temperatur tinggi dan
konsentrasi garam rendah, probe hanya akan mengikat sekuens target yang benar-benar cocok.
Setelah hibridisasi, kelebihan probe yang tidak terikat dicuci, sinyal radioaktif akan terdeteksi
pada lokasi di mana sekuens target terletak. Sinyal radioaktif divisualisasi dengan
mengeksposkan pada fim X-ray menghasilkan titik atau pita hitam pada tempat radioaktif.
Southern blotting. Ketika DNA genom didigesti dengan endonuklease restriksi dan dipisahkan
dengan elektroforesis gel, fragmen individual tidak akan dapat dilihat, bahkan jika digunakan
DNA dalam jumlah besar. Karena kompleksnya DNA genom, digesti dengan enzim restriksi
yang divisualisasi dengan ethidium bromide akan menghasilkan pola smear yang tercipta dari
ribuan fragmen DNA. Untuk mendeteksi fragmen tertentu pada smear tersebut digunakan
teknik hibridisasi denganprobe radioaktif yang lazim dikenal sebagai Southern blotting (diambil
dari nama penemunya Ed Southern) (Gambar 1-9). Southern blotting dimulai dengan pemisahan
elektroforesis gel fragmen DNA yang telah didigesti dengan enzim pemotong. DNA kemudian
didenaturasi (dipisahkan menjadi 2 untai tunggal) dengan perlakuan alkali, selanjutnya untai
tunggal ditransfer ke membran melalui transfer kapilaritas. DNA akan terikat pada secara
kovalen pada membran dan diimobilisasi pada fase padat, menghasilkan replika fragmen pada
gel. Fagmen DNA spesifik pada membran dapat diidentifikasi dengan hibridisasi menggunakan
probe yang spesifik untuk fragmen gen yang dikehendaki.

Gambar 1-9 Southern blot. DNA genom diisolasi dan digesti dengan enzim restriksi. DNA
kemudian dirun pada gel agarose dan ditransfer ke membran di mana DNA kemudian diikatkan
secara kovalen. DNA selanjutnya dihibridisasi menggunakan probe yang dilabel 32P. Interaksi
antara DNA dan probe yang dilabel dideteksi dengan cara memajankan DNA-membran ke film
otoradiografi