Penyematan ligan pada matriks

Terdapat tiga komponen yang harus disatukan untuk membentuk fasa stasioner pada
kolom kromatografi afinitas, yaitu permukaan atau resin (matriks), pengikat (spacer), dan
ligan.
Salah satu faktor yang memengaruhi pengikatan ligan pada matriks adalah keberadaan
gugus fungsional pada ligan. Gugus fungsi yang umum terdapat pada ligan adalah gugus
amin primer, karboksil, dan thiol. Selain itu, ligan juga dapat dimodifikasi untuk
mendapatkan gugus yang reaktif pada ligan. Modifikasi tersebut dapat berupa oksidasi
karbohidrat atau penyematan secara kovalen gugus reaktif ortogonal.
Afinitas dari ligan dapat dipengaruhi oleh tiga hal, yaitu multi-site attachment, streric
hindrance, dan orientasi dari ligan. Multisite attachment terjadi saat satu molekul ligan
berikatan dengan matriks melalui lebih dari satu gugus fungsi (lebih dari satu ikatan).
Seringkali ikatan yang lebih dari satu ini menghasilkan tambatan ligan pada matriks yang
lebih kuat dan stabil. Namun, ikatan yang banyak ini juga berpotensi menimbulkan
deteriorasi atau denaturasi pada ligan yang berujung pada rendahnya afinitas ligan [9].
Salah satu cara untuk mengurangi kemungkinan terjadinya multi-site attchment adalah
dengan menggunakan matriks yang memiliki reactive site terbatas. Gambar 3

attachment dan single-site attachment

Orientasi ligan juga menjadi hal yang penting saat disematkan pada matriks. Jika
ligan memiliki afinitas yang tidak sesuai, potensi ligan untuk berinteraksi dengan komponen
target menjadi semakin berkurang. Gambar 4 meneunjukakan peristiwa tdak tepatnya
orientasi penyematan ligan pada matriks.

orientasi yang tepat dan tidak

Selain afinitas yang rendah, ikatan interaksi antara ligan dan komponen target dapat
terhalangi oleh steric hindrance yang disebabkan oleh matriks atau ligan lainnya. Oleh
karena itu, dalam penyematan ligan pada matriks seringkali digunakan spacer arm yang
menjaga agar situs aktif (active site) dari ligan tidak terhalangi untuk berinteraksi dengan
komponen target. Gambar 5 menunjukkan pengaruh steric hindrance pada ligan.

Gambar 5. Perbandingan ligan dengan dan tanpa spacer arm

Panjang dari spacer arm haruslah diatur sedemikian rupa agar tidak memberikan
steric hindrance yang baru terhadap ligan. Umumnya, spacer arm yang digunakan memiliki
panjang kurang dari 1000 Da. Fungsi dari spacer arm ditunjukkan pada gambar 6. Pada tabel
5 disajikan dasar pemilihan panjang spacer arm secara kualitatif.

Gambar 6. Perbandingan sistem kromatografi afinitas a) tanpa spacer arm dan b) dengan
spacer arm
Tabel 5. Pemilihan panjang spacer arm [8]
Ligan

Komponen

Panjang

Kecil
Kecil
Besar
Besar

Target
Kecil
Besar
Kecil
Besar

Spacer Arm
Pendek
Panjang
-

Terdapat beberapa teknik untuk menyematkan ligan pada matriks, antara lain dengan
ikatan kovalen, adorpsi pada permukaan dengan interakasi biospesifik dan nonspesifik,
diperangkap dalam pori (entrapment), dan berkoordinasi dengan ion logam.
Imobilisasi menggunakan ikatan kovalen merupakan teknik yang paling umum
digunakan. Imobilisasi dengan ikatan kovalen lebih selektif dibanding metode imobilisasi
lainnya. Namun, imobilisasi secara kovalen membutuhkan tahapan dan reagen kimia yang
lebih banyak. Oleh karena itu, biaya produksinya juga lebih besar. Namun, karena ligan hasil
imobilisasi secara kovalen lebih tahan lama dibanding imobilisasi dengan teknik lainnya,
imobilisasi secara kovalen lebih ekonomis untuk digunakan dalam waktu yang lama.
Imobilisasi dengan adsorpsi nonspesifik adalah dengan membuat ligan teradsorp pada
matriks melalui interaksi coulombic, ikatan hidrogen, dan interaksi hidrofobik. Imobilisasi
dengan adsoprsi nonspesifik dapat dilakukan dengan menggunakan aminereactive methods.
Teknik lain untuk mengimobilisasi ligan pada matriks adalah dengan entrapment,yaitu
memerangkap ligan dengan capping agent. Salah satu contoh metode ini adalah entrapment
albumin dari serum manusia (Human Serum Albumin) menggunakan matriks berupa
hydrazide-activated supports dan capping agent berupa glikogen teroksidasi. Pada

imobilisasi dengan teknik ini, tidak ada ikatan yang terbentuk antara ligan dan matriks
sehingga masalah yang dapat ditimbulkan seperti pada gambar 5 tidak akan terjadi.

Metode pemurnian menggunakan kromatografi afinitas

Pemurnian dengan kromatografi afinitas dimulai dengan penanganan sampel dan
matriks. Selanjutnya adalah penangkapan komponen target oleh ligan yang kemudian di ikuti
dengan pencucian untuk memisahkan komponen lain. Tahap berikutnya dilakukan elusi
untuk melepaskan ikatan antara ligan dengan komponen target. Berikut adalah pembahasan
dari masing-masing tahap.
1. Penyiapan sampel
Pada penyiapan sampel, sampel diusahakan tetap berada pada konformasi yang
memungkinkan untuk terjadinya interaksi antara sampel target dengan ligan. Selain itu,
sampel juga dikurangi viskositasnya agar dapat mengurangi turun tekan, meningkatkan laju
alir, dan mencegah tertinggalnya sampel pada kolom.
Beberapa protein juga dapat mengalami agregasi atau saling berkumpul sehingga dapat
memperlambat laju difusi dan dapat mengurangi probabilitas untuk ditangkap oleh ligan.
Oleh karena itu, terkadang sampel harus diencerkan terlebih dahulu.
2. Pengikatan dan pencucian
Efisiensi pengikatan ligan dengan komponen target bergantung pada kinetika
pengikatan yang sangat ditentukan oleh berbagai faktor seperti afinitas dari komponen itu
sendiri dan konsentrasi dari ligan komponen target. Proses pemisahan menggunakan
kromatografi afinitas dapat dirumuskan pada persamaan dibawah ini.

Ka adalah konstanta kesetimbangan asosiasi, ka adalah konstanta laju reaksi asosiasi, dan kd
adalah konstanta laju reaksi disosiasi. Ka = ka/kd.
Ka = [LT]/[L].[T] dengan [LT] adalah kosentrasi produk interakasi antara ligan dan
komponen target, [L] adalah konsentrasi ligan dan [T] adalah konsentrasi komponen target.
Setelah

pengikatan

bukan target dilakukan

buffer.

dengan

(binding)

terjadi, pencucian komponen lain yang

menambahkan

reagen

sebagai

wash

3. Elusi
Elusi adalah proses yang berkebalikan dengan proses binding. Pada proses ini, nilai
Ka dibuat menjadi sekecil mungkin agar reaksi disosiasi terjadi. Terdapat dua metode elusi,
yaitu elusi spesifik dan elusi nonspesifik. Pada elusi spesifik, reagen baru ditambahkan untuk
berkompetisi dengan salah satu antara ligan dan komponen target sehingga kompleks antara
ligan dan komponen target dapat terlepas. Pada jenis elusi ini, jumlah dan afinitas dari reagen
pengganggu sangat penting.
Elusi jenis lain, yaitu elusi nonspesifik menggunakan manipulasi pada kondisi solven
agar nilai Ka bernilai sangat kecil bahkan sampai mencapai nol. Kondisi elusi dapat
dioptimasi sesuai dengan mekanisme interaksi antara ligan dan komponen target seperti
meningkatkan
mengubah

konsentrasi
pH

untu

garam untuk menurunkan interaksi ionik atau dengan

mengubah

keadaan ionisasi/protonisasi. Salah satu contoh

elusi dengan mengubah pH adalah elusi antibodi dari protein A atau protein G.

Berbagai variasi kromatografi afinitas

a. Immobilized

metal ion

affinity chromatography (IMAC)

IMAC merupakan jenis kromatografi afinitas yang banyak digunakan dalam

pemurnian protein. IMAC berbeda dengan kromatografi afinitas yang lain karena IMAC
menggunakan sebuah penanda atau tag pada protein. IMAC banyak digunakan untuk
memurnikan komponen dalam suatu campuran yang sangat kompleks seperti memurnikan
protein dalam serum. IMAC memanfaatkan interaksi antara asam amino dari protein target
dengan ion logam yang terkelat (chelated metal ion) pada kolom. IMAC dapat mengikat
protein dengan konstanta disosiasi mencapai 10-5-10-7.
Prinsip dasar yang masih digunakan hingga saat ini adalah menngunakan ion logam
yang terimobilisasi seperti Cu2+, Ni2+, dan Zn2+ untuk memurnikan protein dengan basis
kandungan asam asmino histidin pada protein tersebut. Ion logam tersebut membentuk
kompleks dengan agen pengkelat (chelating agent) yang disebut immobilized metal chelat
complex (IMCC).
Sebagai contoh, interaksi antara histidin dengan IMCC adalah transfer elektron.
Karena histidin memiliki pKa 6, histidin menjadi mudah untuk melakukan transfer elektron
saat pH lebih besar dari 6,5. Jika histidin sudah mendonorkan elektron pada IMCC, IMCC

dan histidin akan membentuk kompleks. Untuk mengelusi histidin, dapat dilakukan dengan
menambahkan imidazol, yaitu gugus fungsi pada histidin yang dapat bersaing dengan histidin
yang sedang membentuk kompleks dengan IMCC. Cara lain adalah dengan menurunkan
pHmenjadi kurang dari 6,5 yang mencegah histidin

untuk mendonorkan elektronnya

sehingga kompleks IMCC dan ligan dapat terlepas.

b. Bioaffinity chromatography
Bioaffinity

chromatography

adalah

keomatogrfafi

afinitas

yang

menggunakan ligan biologis atau sering dikenal sebagai biospecific adsoption. Terdapat
beberapa jenis ligan biologis yang sering digunakna, yaitu protein pengikat immunoglobulin,
enzim, lektin, karbohidrat, protein serum, dan sistem avidin/biotin.
c. Immunoaffinity chromatography
Immunoaffinity chromatography adalah teknik yang sangat ampuh untuk memurnikan
protein.

Kromatografi

afinitas

jenis

ini

memurnikan

protein

khusunya

antibodi

(immunoglobulin) menggunakan ligan-ligan seperti protein A yang diproduksi oleh bakteri

Staphylococcus aureus dan protein G yang diperoleh dari grup C dan G Streptococci. Namun,
harga ligan-ligan untuk mengikat immunogobulin ini terbilang mahal.
d. Immobilized enzyme
Enzim yang terimobilisasi sering digunakan untuk memurnikan enzim inhibitor atau
sebaliknya, enzim inhibitor sering digunakan untuk memurnikan enzim. Masalah yang
menjadi penghalang bagi penggunaan immbolized enzyme adalah harganya yang cukup
mahal.
Proses imobilisasi enzim dilakukan melalui dua tahap, yaitu tahap pertama dengan
aktivasi media pendukung (support) dengan carrier. Jenis support yang paling banyak
digunakan adalah selulosa dan polisakarida. Selanjutnya, tahap kedua, yaitu enzim berikatan
kovalen dengan carrier. Umumnya, ikatan kovalen terjadi pada gugus amin dari lisin atau
arginin, gugus karboksil dari asam aspartat atau asam glutamat, gugus hidroksil pada serin
atau treonin, atau gugus imidazol pada histidin.
e. Lektin
Lektin adalah protein yang bukan berasal dari sistem imun tetapi memiliki
kemampuan untuk mengenali dan berikatan dengan residu karbohidrat spesifik. Dua jenis

lektin yang paling umum digunakan pada kromatografi afinitas adalah canavalin A dan wheat
germ agglutinin. Pada tabel 6 disajikan jenis-jenis lektin.
Tabel 6. Jenis-jenis lektin
Residu

Lektin

Karbohidrat
D-N-Asetil
Soybean lectin
galaktosamin Lektin 60

dari

Ricinus
communis
Fitohemagglutinin

E4

dan L4
-D-Galaktosa Jacalin
Peanut

and

soybean

lectin
-D-Galaktosa Lekton 60 dan 120 dari
-D-Glukosa

Ricinus communis
Pea and leentil lectin

-D-Manosa

Konkanavalin A
Pea lectin
Lentil lectin
Konkanavalin A