Anda di halaman 1dari 15

PENDAHULUAN

1. Latar Belakang
Informasi mengenai diversitas genetik digunakan sebagai dasar untuk
meningkatkan kualitas dan kuantitas jenis melalui seleksi. Pengetahuan mengenai
pola variabilitas genetik dari masing masing jenis akan membantu pengembangan
program persilangan (Kidd et al, 1974).
Penggunaan penanda molekuler RAPD pada tanaman antara lain untuk
menentukan keragaman genetik tanaman, mendapatkan hubungan kekerabatan
genetik yang konsisten dengan keragaman taksonomi, dan dapat digunakan untuk
membedakan klon tanaman komersial yang tidak dapat dibedakan secara morfologi
ataupun fenotipik. Penanda molekuler sangat bermanfaat untuk membantu
mempercepat dan mempermudah perbaikan kualitas tanaman melalui seleksi
(Syam, 2012).
Pada bidang pemuliaan tanaman, pemanfaatan terhadap beberapa jenis
tanaman hingga saat ini masih terbatas pada seleksi dan uji lapangan dengan
menggunakan karakter morfologi dan mendiskripsikan tanaman. Karakter
morfologi telah banyak dipergunakan , namun karakter morfologi memiliki kendala
yaitu adanya faktor lingkungan sehingga perbedaan antar spesies berkerabat dekat
seringkali sulit dianalisis karena tidak memiliki sistem pengendalian genetik yang
sederhana (Syam, 2012).
Adanya kondisi geografis yang beragam memperkaya keragaman genetik
suatu tanaman. Keragaman ini merupakan sumber plasma nutfah yang besar
manfaatnya terhadap program pemuliaan yang diharapkan dapat menghasilkan
varietas yang unggul. Pertimbangan bahwa sifat morfologi dipengaruhi oleh
lingkungan menjadi pertimbangan utama dalam melakukan identifikasi tingkat gen
yang dianggap lebih stabil. Keragaman genetik merupakan variasi gen dalam satu
spesies baik diantara populasipopulasi yang terpisah secara geografis maupun
diantara individuindividu dalam satu populasi. Adanya keanekaragaman morfologi
erat kaitannya dengan keanekaragaman genetik (Sijapati et al 2008). Oleh karena
itu, perlu dilakukan praktikum mengenai isolasi DNA genom dan aplikasi teknik

RAPD untuk mengetahui kekerabatan dan keragaman genetik pada beberapa


sampel tanaman (dalam praktikum ini digunakan nanas (Ananas sp.).
DEPUTI (2001) menyatakan bahwa nanas (Ananas sp.) merupakan salah satu
kekayaan plasma nutfah nasional di Indonesia yang menyebar di berbagai daerah
dengan iklim yang berbeda dan terpisah dalam jangka waktu yang lama. Tanaman
ini berupa semak yang

tumbuh di daerah tropis, yang berasal dari Brasilia

(Amerika Selatan). Pada abad ke-16 orang Spanyol membawa nanas ini ke Filipina
dan Semenanjung Malaysia, masuk ke Indonesia pada abad ke-15.
Teknik RAPD mendeteksi polimorfisme ruas nukleotida pada DNA dengan
menggunakan sebuah primer tunggal yang memiliki rangkaian nukleotida acak.
Reaksi PCR-RAPD ini, sebuah primer menempel pada DNA genomik pada dua
tempat berbeda dari DNA komplementer. Jika tempat penempelan primer ini berada
pada daerah yang dapat diamplifikasi, maka hasil DNA tertentu dapat dihasilkan
melalui amplifikasi siklus termal. Umumnya masing-masing primer menyebabkan
amplifikasi beberapa lokus (Welsh dan McClelland, 1990, Williams et al., 1990).
Pada praktikum ini digunakan 10 sampel DNA nanas yang diisolasi dari daun
tanamannya. Untuk mengetahui keragaman diantara nanas-nanas tersebut maka
diperlukan analisis secara molekuler menggunakan DNA dari sampel tersebut.
Sehingga pada praktikum ini dilakukan percobaan mengenai teknik RAPD untuk
mengetahui keragaman pada nanas tersebut. Informasi keragaman genetik dapat
digunakan untuk melihat kemiripan genetiknya.
2. Tujuan
Tujuan melakukan praktikum ini adalah mempelajari analisis kekerabatan
berdasarkan pohon filogenetik dengan metode RAPD menggunakan primer OPA 2,
3 dan 4 pada tanaman nanas.

METODOLOGI

1. Waktu dan Tempat


Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Biorin Pusat Antar Universitas IPB,
pada tanggal 27 Oktober 2015.
2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum RAPD adalah mortar-pestle,
mikropipet, mikro tip, microtube sentrifuge, inkubator, sentrifuge, vacum dry,
spektrophotometer, elektroforesis gel agarosa, mesin thermocycler untuk PCR dan
UV transiluminator dilengkapi dengan gel doc.
Bahan yang digunakan adalah 10 sampel daun nanas, liquid nitrogen, buffer
CTAB, CI (Cloroform Isoamilalkohol), PCI (Phenol Chloroform Isoamilalkohol),
ethanol, NaOAc pH 5,2, ddH2O, RNAse, agarose, buffer TAE, loading buffer,
Etidhium bromide, master mix PCR, primer OPA (2, 3, 4 dan 13). Sequence primer
OPA2 (TGCCGAGCTG), OPA3 (AGTCAGCCAC) dan OPA4 (CAGCACCCAC).
3. Cara Kerja
3. 1. Isolasi Genom Tanaman
Daun tanaman nanas (Ananas sp.) sebanyak 2,2 cm dipotong kecil untuk
digerus sampai halus menggunakan pestle dan mortar dengan ditambah larutan
nitrogen cair. Serbuk daun nanas dimasukkan ke tabung eppendorf yang telah diisi
600

l larutan buffer CTAB (2 x 2% PVP) dan 1,2

-mercapto etanol.

Tabung di bolak balik agar homogen dan diinkubasi pada suhu 65

selama 30

menit. Pada saat inkubasi, tabung dibolak balik setiap 10 menit sekali. Sampel pada
tabung ditambahi dengan 600

larutan kloroform isoamil alkohol (C:I; 24:1),

kemudian disentrifugasi kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang.
Fase supernatan yang terbentuk diambil, dipindahkan ke tabung baru dan ditambahi
larutan fenol kloroform isoamil alkohol (P:C:I; 25:24:1) sebanyak 1 kali volume
supernatan. Tabung disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu
ruang. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke tabung baru dan ditambahi
NaOAc (2M; pH 5,2) sebanyak 1 kali volume dan EtOH absolut sebanyak 2-3 kali
volume. Campuran larutan di diinkubasi selama semalam pada suhu -20 .
Tahap selanjutnya, tabung disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 25
menit pada suhu 4 . Supernatan yang terbentuk dibuang, selanjutnya pellet
ditambah dengan 500

EtOH 70%. Tabung disentrifugasi pada kecepatan

10.000 rpm pada suhu 4

selama 10 menit. Supernatan dibuang dan tabung

yang berisi pelet dikeringkan dengan vakum. Pellet yang berada pada tabung
ditambahi dengan 20

ddH2O dan Rnase sebanyak 3 l

dan dihomogenkan

dengan spin down. Tabung diinkubasi pada suhu 37 selama 10 menit.


3. 2. Deteksi DNA menggunakan Gel Agarosa
Ada tidaknya DNA genom tanaman nanas diketahui dengan elektroforesis,
yaitu menjalankan DNA genom hasil isolasi pada gel agarose 1%. Sebanyak 5l
DNA genom ditambahi 1l loading dye sampai tercampur. Campuran dimasukkan
ke dalam sumur agarosa 1% (0,3 gram agarose dalam 30 ml buffer TAE (Tris
Acetic EDTA) 1X. DNA lambda digunakan sebagai marker.
Elektroforesis dilakukan selama 30 menit pada 100 Volt dengan buffer TAE
1X sebagai running buffer. Gel direndam dalam larutan Ethidium Bromida (EtBr).
Gel dapat divisualisasi dengan meletakkan gel diatas UV transiluminator untuk
melihat ada tidaknya pita DNA genom. Agarose diambil dari alat elektroforesis
kemudian direndam dalam larutan Etidhium Bromida. Selanjutnya pergerakan
DNA diamati di bawah sinar UV.
3. 3. Kuantifikasi DNA dengan Spektrofotometer
Tahap ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA
dengan menggunakan spektrofotometer. Suspensi DNA diencerkan dengan
mengambil 5 l dalam 695 l ddH2O. Suspensi DNA yang telah diencerkan dibaca
absorbansinya pada 260 nm dan 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang
gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam konsentrasi, yaitu 1 OD 260 = 50 ug
DNA utas ganda tiap ml. Konsentrasi DNA dihitung dengan persamaan,
Konsentrasi DNA

g
=ml

FP x 50 g/ml x Abs. 260

Sedangkan untuk mengetahui kualitas DNA berhubungan dengan kemurnian


DNA terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan nilai absorbansi
260 nm terhadap nilai absorbansi 280 nm. DNA dikatakan murni apabila nilai
perbandingan berada pada rentang 1,8-2,0.
3. 4. Prosedur Kerja Random Amplified Polymerase DNA (RAPD)

Sampel yang digunakan adalah DNA genom tanaman nanas dari hasil Isolasi.
Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer OPA 2, 3 dan 4 (pada masingmasing sampel) menggunakan mesin thermocycler. Analisis PCR RAPD dilakukan
dengan total 1x reaksi

sebanyak 10 l. PCR mix dibuat dan campuran

dihomogenkan kemudian dimasukkan ke dalam mesin thermocycler.


Tabel 1. Komposisi PCR mix :
Komposisi PCR
Template
100 ng/ l
Master mix
Primer OPA 2, 3, 4
DdH2O

1x
1 l
5 l
0,5 l
3,5 l

11 x
11 l
55 l
5,5 l
38.5 l

Primer OPA 1, OPA 2, OPA 3


1 cuptube 9 l /primer OPA 1 + 1 l (total 10 cuptube)
1 cuptube 9 l /primer OPA 2 + 1 l (total 10 cuptube)
1 cuptube 9 l /primer OPA 3 + 1 l (total 10 cuptube)

Spin

Proses reaksi PCR dengan menggunakan alat Thermo cycler sebanyak 40 siklus.
Tabel 2. Proses amplifikasi DNA dengan teknik PCR
No

Tahap

Suhu

Waktu

Siklus

.
1
2
3
4
5
6

Pre denaturasi
Denaturasi
Annealing
Extension
Post extension
Cooling

94 0C
94 0C
32 0C
72 0C
720C
250C

5 menit
1 menit
3 menit
2 menit
7 menit
10 menit

1
40
40
40
1
1

Setelah proses amplifikasi DNA selesai dilanjutkan dengan proses


elektroforesis. Hasil amplifikasi divisualisasikan menggunakan elektroforesis
horizontal dengan gel agarose 1 % (w/v) dalam buffer 1x TAE. Gel agarose
kemudian direndam dalam larutan EtBr, sehingga pola pita dapat dilihat di bawah
sinar ultraviolet.

3. 5. Analisis data RAPD


Ukuran fragmen ditentukan dengan membandingkan terhadap standar 1 Kb
Ladder. Analisis RAPD dengan menggunakan program NTSYSpc (Numeral
Taxonomy and Multivariate Analysis System) versi 2.02. Analisis similaritas

dilakukan dengan melihat profil pita DNA hasil elektroforesis pada gel agarose.
Hasil analisis RAPD yang diskoring dengn cara nilai 0 (jika tidak ada pita) dan nilai
1 (jika ada pita) pada tingkat migrasi yang sama. Untuk melihat koefisen kesamaan
genetik antar sampel nenas berdasarkan RAPD diolah dengan menggunakan
prosedur SIMQUAL dan plot tree dengan prosedur Clustering menggunakan
SAHN_UPGMA.
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Isolasi DNA Tanaman Nanas, Uji Kuantifikasi DNA, dan Analisa dengan
Gel Agarosa
Pada praktikum ini, dilakukan isolasi DNA genom terhadap tanaman nanas.
Isolasi DNA nanas diambil dari bagian daun tanaman tersebut selanjutnya isolasi
dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu pelisisan sel dengan metode CTAB,
presipitasi, pencucian, pemurnian, dan resuspensi. Secara tahapan tersebut
dilakukan dengan penambahan senyawa kimia. Hasil isolasi DNA nanas disebut
isolat yang digunakan untuk analisa keragaman.
DNA tanaman nanas yang telah diisolasi, kemudian di cek kuantitasnya
dengan metode spektrofotometri untuk mengetahui kemurnian dan konsentrasinya.
Prinsip metode spektrofotometri adalah menghitung nilai absorbansi pada A260 dan
A280. Kemurnian DNA didapat dari perbandingan antara nilai absorbansi A260/ A280,
dan konsentrasi DNA didapatkan dengan mengalikan nilai absorbansi A260 dengan
faktor pengenceran serta mengonversikannya kedalam nanogram (ng) dengan
mengalikan nilai OD A260 yaitu 50 ng.

Tabel 3. Hasil kuantifikasi DNA genom tanaman nanas dengan metode


spektrofotometri
Sample
1
2
3
4
5
6
7

260
0.127
0.101
0.159
0.090
0.108
0.142
0.127

280
0.093
0.073
0.110
0.073
0.081
0.111
0.091

Kemurnian
1.365
1.383
1.445
1.232
1.333
1.279
1.395

Konsentrasi (ng/l)
889
707
1113
630
756
994
889

8
9
10

0.146
0.128
0.052

0.099
0.101
0.043

1.474
1.267
1.209

1022
896
364

Berdasarkan data dari tabel 2, semua hasil perhitungan kemurnian DNA


menunjukkan nilai yang rendah karena berada dibawah 1,8. Menurut Fatchiyah
(2011), DNA dapat dikatakan murni apabila rasio absorbansi DNA yang diukur
pada (A260/A280) menunjukkan nilai 1,8- 2,0. Ketidakmurnian hasil isolasi
dikarenakan terdapat kontaminasi khususnya protein (nilai kemurnian DNA < 1,8).
Adanya kontaminan protein hasil isolasi DNA praktikum ini dimungkinkan karena
saat pengambilan supernatan hasil purifikasi dengan PCI, protein yang mengendap
ikut terbawa. Hal lainnya dimungkinkan pada praktikum ini tidak dilakukan
penambahan enzim proteinase K (enzim pendenaturasi protein).
Analisis dengan gel agarose bertujuan mengetahui kualitas dan mengecek ada
tidaknya DNA dalam gel. Gambar 1 menunjukkan hasil migrasi DNA pada gel
agarosa dimana terlihat pita DNA menandakan keberadaan genom.

Gambar 1. Elektroforegram DNA genom nanas hasil isolasi sampel 1-10


Pita tunggal DNA terlihat pada sampel 2, 4, 5, 6, 7, 8, dan 9. Pada sampel 1,
3, dan 10 tdak terlihat adanya band DNA. Pada sebagian pita migrasinya belum
seutuhnya bersih dari smear yang mungkin dikarenakan kualitas DNA kurang baik
karena mengalami kepatahan. Smear terbentuk akibat degradasi DNA menjadi
polinukleotida-polinukleotida yang pendek. Hal ini disebabkan perlakuan DNA
selama isolasi, yaitu sentrifugasi, perlakuan suhu, atau perlakuan dengan larutanlarutan yang digunakan.
2. PCR dengan Primer OPA 2, 3 dan 4

Marka RAPD dapat dilakukan dengan mengamplifikasi DNA secara random


primer. Primer yang digunakan pada teknik RAPD ini menggunakan sekuen acak
primer dengan 10 pasangan basa untuk menemukan segmen DNA genom untuk
mengungkapkan Polimorfisme. Kunci metode RAPD bahwa primer yang
digunakan adalah primer dengan urutan acak, primer tidak spesifik untuk gen
tertentu atau dengan urutan tertentu dan mengikat DNA komplemennya dari
bermacam-macam specimen DNA. Primer yang digunakan tunggal dan
menganealing tempat pelekatan primer (priming site) dengan arah yang berlawanan
untuk terjadinya amplifikasi. (Kumar and Gurusubramanian, 2011).
Variasi genetik menggambarkan keragaman fenotipe di alam. Variasi genetik
di alam dapat terjadi karena adanya mutasi atau rekombinasi. Variasi genetik dapat
diketahui dengan melihat perbedaan urutan basa-basa. Perbedaan urutan basa
tersebut mengakibatkan adanya polimorfisme pada DNA. Polimorfisme adalah
banyaknya fragmen DNA yang berbeda berdasarkan ukuran, karena adanya markamarka yang tersebar pada seluruh genom (Sijapati, 2008).
Sampel DNA nanas diamplifikasi PCR menggunakan primer OPA 2, 3, dan 4.
Adanya polimorfisme DNA dapat dideteksi di bawah cahaya ultraviolet setelah
sebelumnya gel elektroforesis diberi Etidhium Bromida (EtBr) sehingga dapat
menimbulkan pendaran. Semakin banyak jenis primer yang digunakan akan
menambah besar kemampuan mendeteksi perubahan yang kecil dan pasangan basa
DNA genom (Ishak, 1998). Namun, penanda RAPD bersifat dominan sehingga
fragmen DNA yang dihasilkan tidak dapat membedakan individu yang memiliki
genotipe homozigot (AA) dengan heterozigot (Aa), sedangkan yang tidak ada pita
secara jelas menunjukkan genotipe resesif (aa).

Gambar 2. Elektroforegram hasil amplifikasi primer OPA 2, 3 dan 4 pada DNA nanas.
M: marker 1 kb ladder, 1-10 sampel nanas.
Berdasarkan hasil elektroforegram, didapatkan 12 total fragmen DNA. Pitapita DNA yang teramplifikasi terletak pada posisi antara 250 bp dan 3000 pb.
Jumlah fragmen DNA yang diproduksi untuk setiap primer berkisar antara 1 hingga
8 (Gambar 2). Pada primer OPA 3 dan 4 menghasilkan masing-masing 8 fragmen
DNA. Jumlah pita polimorfis terbanyak terdapat pada primer OPA 3 dan 4 yaitu
masing-masing sebanyak 8. Sedangkan untuk primer OPA 2 hanya memiliki 6
fragmen/ lokus, dan terdapat 2 pita monomorfik.
Gambar 2 merupakan hasil visualisasi pita DNA dengan metode RAPD.
Polimorfisme RAPD merupakan hasil dari beberapa peristiwa, yaitu i) insersi
fragmen DNA yang besar diantara tempat penempelan primer yang melebihi
kemampuan PCR sehingga tidak ada fragmen yang terdeteksi, ii) insersi atau delesi
kecil utas DNA yang menyebabkan perubahan ukuran fragmen amplifikasi, (iii)
delesi salah satu tempat penempelan primer sehingga mengakibatkan hilangnya
fragmen atau meningkatnya ukuran fragmen, (iv) substitusi satu nukleotida pada
satu atau dua tempat sasaran primer yang mempengaruhi proses annealing, yang
berakibat pada ada atau tidaknya polimorfisme atau merubah ukuran fragmen.
Selanjutnya ukuran pita yang terbentuk dihitung ukuran fragmennya
menggunakan rumus regresi dan dibuat grafik logaritmiknya. Dari tabel terlihat

bahwa pita-pita pada RAPD berdasarkan posisi lokusnya mengahsilkan fragmen


DNA dengan ukuran yang berbeda-beda sehingga mengakibatkan polimorfisme.
3. Analisis Kekerabatan Antar Individu dengan Marka RAPD
Pohon filogenik (dendogram) kemudian dibuat berdasarkan metode UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Aritmetic means) dengan cara menurunkan
dari matriks kemiripan genetiknya. Pada mulanya metode UPGMA digunakan
untuk tujuan taksonomi, akan tetapi sering pula digunakan untuk pembentukan
pohon filogenik dengan asumsi bahwa kecepatan mutasi nukleotida atau subsitusi
asam amino mempunyai laju evolusi yang sama pada setiap garis keturunannya
(Kumar et. al. 1993). Sehingga pohon filogenik berdasarkan metode UPGMA
menghasilkan akar pohon. Selain itu mudah dalam interpretasi dan aplikasinya serta
mengurangi kesalahan-kesalahan stokastik akibat estimasi jarak genetik.
Berdasarkan hasil amplifikasi PCR selanjutnya dilakukan skoring (tabel 4)
terhadap pita DNA yang muncul angka 1 (jika ada pita); angka 0 (jika tidak muncul
pita), dan dilanjutkan dengan analisis terhadap kekerabatan melalui program
NTSYS. Hasil analisis sebagaimana yang ditampilkan dalam bentuk pohon
kekerabatan pada Gambar 3.
Tabel 4. Data biner berdasarkan skoring pita hasil amplifikasi sampel nanas
Kelompok
Kel 1
Kel 2
Kel 3
Kel 4
Kel 5
Kel 6
Kel 7
Kel 8
Kel 9
Kel 10

A
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

B
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

OPA-2
C
E
1
0
1
0
0
0
1
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
0
1
0

F
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

G
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

D
1
1
0
0
0
1
1
0
0
1

E
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1

H
1
1
0
0
0
1
1
1
1
1

OPA-3
I
1
0
0
0
0
0
0
1
1
1

Pembuatan pohon filogenik membutuhkan data berupa hasil skoring


elektroforegram hasil amplifikasi DNA. Setiap pita DNA yang terbentuk
berdasarkan marka RAPD menunjukan lokus. Lokus tersebut kemudian
diterjemahkan secara manual menjadi data biner. Setiap lokus dianggap mewakili
satu karakter dan diberi nilai berdasarkan ada tidaknya suatu lokus.

J
1
1
0
0
0
1
1
1
1
0

K
1
1
0
0
0
1
1
0
1
1

Hubungan kekerabatan genetik antara satu individu dengan individu yang lain
dapat diukur berdasarkan kesamaan dari sejumlah karakter. Kemiripan genetik antar
individu dalam suatu populasi dapat dianalisis berdasarkan nilai koefisien
kemiripan dan jarak genetik antara satu individu dengan individu yang lain.
Semakin besar nilai derajat kemiripan genetik antar dua individu berarti semakin
besar kemiripan genetiknya. Selain itu juga dapat dibuat pohon filogenetik untuk
mengetahui hubungan satu individu dengan individu yang lain dalam bentuk
dendogram

Gambar 3 Dendogram hasil RAPD menggunakan primer OPA 2, 3 dan 4 dari 3


jenis nanas (nanas 1, 2 dan 4).
Hasil dendogram RAPD menunjukkan bahwa dari 10 sampel nanas, terdapat
dua kelompok utama yaitu kelompok pertama terdiri atas nanas dari sampel 1 (A), 2
(B), 3 (C), 5 (E), 6 (F), 7 (G) dan 8 (H), 9 (I), dan 10 (J) dengan tingkat kemiripan
sekitar 0,66. Kelompok kedua terdiri atas sampel nanas 4 (D) yang berdiri sendiri
dimana tingkat kemiripan dengan kelompok pertama sebesar 0,60. Hal ini
menunjukan bahwa sampe DNA kelompok 4 (D) memiliki kekerabatan yang paling
jauh dibandingkan sampel lainnya (kelompok pertama) yaitu dengan tingkat
kemiripan 60%.
Informasi lain yang bisa diambil dari pohon filogenetik yang dihasilkan pada
AFLP adalah memperlihatkan kemiripan genetik yang paling tinggi (berkerabat
dekat) adalah pada sampel 6 (F) dan 7 (G) dengan tingkat kemiripan 1,00 yang
berarti 2 sampel nanas tersebut merupakan spesies yang sama. Urutan selanjutnya
sampel 1 (A) dan 9 (I) yaitu sekitar 0,94. Sampel yang tergolong dalam satu

kelompok memiliki pola pita yang mirip. Adapun sampel yang memiliki
kekerabatan terjauh adalah sampel nomor 4 (D) dengan tingkat kemiripan 0,60. .
Kisaran kekerabatan antara kedua kelompok nanas tersebut berkisar antara
0.60 - 1.00. Hal ini menunjukkan bahwa keragaman antara nanas 1-10 cukup
beragam. Menurut Olivier et al., (1995) nilai similaritas berkisar antara 0 sampai
1,0 dan hubungan kekerabatan dekat apabila nilai similaritas mendekati 1.
Menurut Hardiyanto et al (2008) kemiripan genetik merupakan kebalikan
dari jarak genetik. Makin kecil nilai tingkat kemiripan, memiliki indikasi makin
jauhnya kekerabatan genetik sampel yang diuji. Informasi ini sangat berarti dalam
kegiatan pemuliaan di mana semakin jauh jarak genetik yang dimiliki suatu sampel
dengan sampel yang lain akan meningkatkan peluang mendapatkan keragaman
genetik. Apabila diaplikasikan dalam budidaya pemuliaan nanas, hal ini
menunjukkan bahwa antara nanas yang diuji diatas tidak bisa digunakan dalam
persilangan karena memiliki tingkat keragaman yang rendah.
Pola konstruksi pohon filogenik tersebut merupakan informasi yang penting
untuk proses pemuliaan tanaman. Melalui pola konstruksi yang terlihat dapat
diketahui individu-individu yang kekerabatannya dekat dan yang jauh, serta
keragaman genetiknya. Sehingga hasil persilangan yang bagus nantinya akan
diperoleh dari persilangan antar individu yang mempunyai kemirpan genetik kecil
atau berjarak genetik besar sehingga dapat mempertahankan keragaman genetik
yang ada (Sukartini 2008).
Kelebihan dari analisis menggunakan RAPD ini adalah hanya memerlukan
sejumlah kecil dari genom DNA namun menghasilkan tingkat polimorfisme yang
tinggi selain itu juga memfasilitasi analisis keragaman yang lebih efektif pada
tanaman. RAPD menyediakan informasi yang dapat membantu menentukan
kekhasan spesies dan filogenetik hubungan pada tingkat molekuler (Williams et al.
1990). Menurut Demeke dan Adams (1994), prosedur RAPD lebih murah, lebih
cepat, membutuhkan sampel DNA lebih rendah (0,5-50 ng), tidak memerlukan
radioisotop, dan tidak terlalu membutuhkan keahlian untuk pelaksanaannya.
KESIMPULAN
Hasil analisis keragaman metode RAPD dengan menggunakan primer OPA 2,
3, 4 pada 10 jenis nanas memberikan hasil bahwa antara nanas 1-10 memiliki

keragaman yang cukup, dengan tingkat similaritas/ koefisien antara 0.60 - 1.00. Hasil
pohon filogenetik berdasarkan amplifikasi menggunakan primer OPA 2,3, dan 4
memperlihatkan 2 kelompok utama yaitu aksesi 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, dan 10 memiliki
tingkat kesamaan genetik sebesar 66%. Sedangkan jika dibandingkan kelompok kedua
hanya ditempati aksesi 4 memiliki kesamaan genetik sebesar 60% sehingga dapat
dikatakann aksesi 4 memiliki kekerabatan yang paling jauh dibandingkan dengan yang
lain. Untuk kekerabatan yang palin dekat adalah aksesi 6 dan 7 dengan tingkat
kemiripan 100%.
DAFTAR PUSTAKA
DEPUTI [Menegristek]. 2001. Nanas (Ananas comosus) Tentang Budidaya Pertanian.
Fatchiyah, 2011. Uji kuantitatif dan uji kualitatif hal. 33-41 dalam Aruminingtyas EI.,
Widyawati S. Biologi Molekuler Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.
Hardiyanto NF, Devy, dan Martasari C. 2008. Identifikasi Kekerabatan Genetik Klonklon Bawang Putih Indonesia Menggunakan Isozim dan RAPD. J. Hort. 18(4):
385-394.
Kidd, K. K., D. Osterhoff, L. Erhard and W. H. Stone. 1974. The Use of Genetic
Relationships Among Cattle Breeds in the Formulation of Rational Breeding
Policies: An Example with South Devon (South Africa) and Gelbvieh
(Germany). Anim. Blood Grps Biochem. Genet. 5 : 2128
Kumar S.,K. Tamura and M. Nei. 1993. MEGA, Moleculer Evolutionary Genetics
Analysis. Institute of Molecular Evolutionary Genetics. The Pennsylvania State
University, University Park, PA 16802, USA.
Olivier M, Meehl MA, Lust G. 1999. Random Amplified Polymorphic DNA Sequences
as Markers for Canine Genetic Studies. The journal of heredity.90(1).
Sijapati J, Rana N, Rana P and Shrestha S. 2008. Optimization of RAPD-PCR
Conditions for the Study of Genetic Diversity in Nepalese Isolates of Bacillus
thuringiensis Berliner. Nepal Journal of Science and Technology. 9: 91-97.
Sukartini. 2008. Analisis jarak genetik dan kekerabatan aksesi-aksesi pisang
berdasarkan primer random amplified polymorphic DNA. J Hort. 18 (3):261266.

Syam, R, Gusti RS, dan Muzuni. 2012. Genetic variation analysis of cashew trees
(Anacardium occidentale L) in Southeast Sulawesi using AFLP. Agronomi 1(2):
164-173.
Welsh J, McClelland M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary
primers. Nucleic Acid Res. 18: 7213-7218.
Williams, J.G.K., A.R.K. Kubelik, J.L. Livak, J.A. Rafalski, and S.V. Tingey.1990.
DNA polymorphisms

amplified

by random

primers

are

useful

as

geneticsmarkers. Nucl. Acids Res. 18. 6531-6535


Williams John GK, Kubelik Anne R, Livak J Kenneth, Rafalski J Antoni, Tingey Scott
V. 1990. DNA Polymorphisms Amplified By Arbitrary Primers Are Useful As
Genetic Markers. Nucleic Acids Research, 18, 6531-6535.

LAPORAN GENETIKA MOLEKULER


METODE AFLP (Amplified Fragment Length Polimorfism) UNTUK
MENGETAHUI KERAGAMAN PADA DNA TANAMAN NANAS

Oleh :
Hanni Tsaaqifah
P051150071

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI


SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2016