Anda di halaman 1dari 21

RESUME BIOTEKNOLOGI

Rekayasa Genetika

Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Bioteknologi


Dosen Pengampu
Prof. Dr. agr. Muh. Amin, MSi

Oleh:
Kelompok 3
Henrika Jempormase

(130341614778)

Melania Primasta

(130341614846)

Tania Puspa Chandra

(130341614839)

Yoananda Ramadhina

(130341614826)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG


FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
Februari 2016

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DAN GENOM


Memperkenalkan Teknologi DNA Rekombinan dan Kloning DNA
Ketika ilmuwan James Watsondan Francis Crick menemukan bahwa struktur DNA
merupakan molekul dobel helix, mereka menunjukkan potensi dan pengaruh dari
penemuannya. Pada tahun sebelum dan sesudah penemuan Watson dan Crick, banyak
ilmuwan yang berkontribusi pada pemahaman tentang DA sebagai materi genetic dari sel
hidup. Beberapa ilmuwan mempelajari struktur dan replikasi DNA pada bakteriofag (fag)
dimana merupakan virus yang menginfeksi sel bakteri. Salah satu enzim yang penting dalam
teknologi DNA rekombinan adalah DNA ligase.
Pada akhir tahun 1960, banyak ilmuwan yang tertarik pada cloning gen. Mereka
berspekulasi bahwa memungkinkan untuk mengkloning DNA dengan memotong dan
melekatkan DNA dari sumber yang berbeda (teknologi DNA rekombinan). Tampaknya hal
tersebut merupakan masa dari cloning gen, teknologi DNA rekombinan, dan teknik genetik
yang memiliki kesamaan proses. Teknik genetic pada teknologi DNA rekombinan sering
digunakan untuk memodifikasi gen organisme. Definisi biologi modern dari cloning adalah
molekul sel atau organisme yang diproduksi dari individu yang berbeda.
Enzim Retriksi dan Vektor Plasmid DNA
Pada awal 1970, cloning gen menjadi suatu kenyataan. Beberapa penelitian ilmuwan dari
berbagai kolaborasi yang dilakukan menghasilkan penemuan dua komponen esensial (enzim
retriksi dan plasmid DNA) yang membuat cloning gen dan teknik DNA rekombinan menjadi
nyata. Enzim retriksi merupakan enzim pemotong DNA, sedangkan plasmid DNA berbentuk
bundar yang berasal dari replikasi DNA mandiri yang dapat dimanipulasi oleh ilmuwan untuk
membawa dan mengklon potongan DNA lain.
Penemuan tentang mikrobiologi tahun 1960 yaitu bahwa beberapa bakteri telah terlindung
dari kehancuran oleh bakteriofag karena mereka dapat membatasi replikasi dari fag tersebut.
Werner Aber mengemukakan bahwa pertumbuhan yang terbatas dari fag terjadi karena
beberapa bakteri mengandung enzim yang dapat menghentikan replikasi virus. Karena
kemampuan itu enzim ini disebut enzim retriksi. Pada tahun 1970, Hamilton Smith
mempelajari bakteri Haemophilus influenza dan mengisolasi HindIII, enzim retriksi pertama
yang digunakan untuk cloning DNA. Enzim retriksi juga dikenal sebagai retriksi
endonuclease karena kemampuannya memotong permulaan rantai DNA dimana fungsinya
dari enzim tersebut berkebalikan dengan eksonuklease yang memotong akhir dari rantai
DNA. Smith mendemonstrasikan bahwa HindIII dapat digunakan untuk meotong atau
mencerna DNA menjadi fragmen yang kecil.
Enzim retriksi ditemukan pada bakteri mereka diberi nama sesuai dengan nama genus dan
spesies darimana mereka diisolasi. Contohnya yaitu EcoRI yang merupakan enzim retriksi
pertama yang ditemukan pada strain E. coli RY3. Enzim retriksi memotong DNA dengan
membelah ikatan fosfodiester pada punggung gula fosfat yang berdekatan dengan unting
DNA. Enzim retriksi tidak acak dalam memotong DNA, tetapi memotong DNA pada lokasi
yang sama dimana juga menunjukkan kespesifikan untuk substrat tertentu.
Enzim retriksi mengikat, mengenali dan memotong permulaan rantai spesifik DNA (sisi
retriksi). Bakteri dapat melindungi DNA mereka dari pencernaan oleh enzim retriksi karena
beberapa nukleotida DNAnya mengandung grup metil yang meghalangi pencernaan dari

enzim retriksi. Beberapa enzim retriksi seperti EciRI memotong DNA untuk membentuk
fragmen DNA dengan satu unting akhir yang menjalar disebut sticky atau kohesif ends.
Enzim yang lain mengatur fragmen dengan unting ganda akhir yag disebut blunt ends.
Pada awal 1970, beberapa ilmuwan menggunakan cloning gen untuk mengubah biologi
molecular selamanya. Berg menemukan teknologi DNA rekombinan ketika menciptakan
sebuah potongan dari DNA rekombinan dengan menyambung DNA dari kromosom E. coli
dan DNA dari virus primate yang disebut SV40, pertama dilakukan isolasi DNA kromosomal
dari E. coli dan DNA dari SV40. Kemudian memotong kedua sampel DNA dengan EcoRI,
memasukkan DNA E. coli dan fragmen DNA virus ke dalam pipa reaksi dengan DNA enzim
ligase dan berhasil pada pembuatan persilangan molekul SV40 dan DNA E. coli.
Cohen tertarik dengan potongan kecil berbentuk bundar dari DNA yang dikenal sebagai
plasmid. Plasmid DNA ditemukan pada bakteri. Plasmid termasuk DNA ekstrakromosomal
karena mereka ada pada sitoplasma bakteri. Plasmid berukuran kecil dengan rata-rata 10004000 pasangan utama. Cohen mempelajari replikasi plasmid untuk mentransfer plasmid
diantara bakteri dan mekanisme resistensi bakteri terhadap antibiotic.
Cohen menyebutkan bahwa plasmid dapat digunakan sebagai vector yang dapat
menerima, membawa, dan mengklon bagian lain dari DNA. Dengan menggunakan EcoRI
mereka memotong kedua plasmid dan menggabungkan fragmen dari masing-masing plasmid
menggunakan DNA ligase untuk menghasilkan persilangan (rekombinan) plasmid baru.
Sebagai hasil dari percobaan, Cohen dan Boyer memproduksi vector plasmid pertama untuk
kepentingan cloning, yang disebut pSC101. pSC101 mengandung gen resistensi tetrasilin dan
sisi retriksi untuk beberapa enzim termasuk EcoRI dan HindIII. Berikutnya mereka
menggunakan percobaan yang sama untuk mengklon DNA dari katak claw-toed Afrika
Selatan, Xenopus laevis menjadi sisi EcoRI dari pSC101.
Cohen dan Boyer membuat cloning DNA vector pertama yang merupakan jalan untuk
insersi dan replikasi DNA.percobaan ini sebagai awal lahirnya bioteknologi modern karena
banyak teknik yang sekarang ini menggunakan cloning gen dan manipulasi gen berdasarkan
metode teknologi DNA rekombinan.
Transformasi Sel Bakteri Dan Seleksi Antibiotik Rekombinan Bakteri
Cohen juga membuat kontribusi penting lainnya untuk gen kloning, yang membuat
kloning pSC101. Transformasi adalah sebuah proses memasukkan DNA asing ke dalam
bakteri, bisa digunakan untuk membuktikan pengenalan DNA didalam bakteri. Cohen
menemukan bahwa perlakuan sel bakteri dengan larutan kalsium klorida, ditambahkan
plasmid untuk sel didinginkan di dalam es, dan kemudian sel dihangatkan secara singkat dan
DNA bercampur, plasmid masuk ke dalam sel bakteri. Di dalam sel bakteri, DNA bereplikasi
dan secara cepat. Teknik transformasi menjelaskan lebih banyak penjelasan. Lebih modern
metode transformasi disebut elektroforesi, termasuk penggunaan secara singkat tekanan
listrik tinggi untuk membuat celah kecil di dinding sel bakteri dan membiarkan DNA masuk.
Elektroferesi juga dapat digunakan untuk mengenal DNA di dalam sel mamalia dan
tranformasi sel tumbuhan.
Penyambungan fragmen DNA dan transformasi oleh beberapa metode yang tidak
efisien. Selama penyambungan beberapa pengolaan penyambungan plasmid kembali secara

sendiri untuk menciptakan peredaran kembali plasmid yang kurang bagian DNA. Selama
transformasi, sel dewasa tidak bertindak DNA.
Sekarang kita belajar bahwa DNA bisa memasuki ke dalam vektor dan mengenali di
dalam sel bakteri, kita memikirkan bagaimana bakteri rekombinan ditransformasi dengan
rekombinan plasmid bisa dibedakan dari ukuran besar nontransformasi bakteri dan sel bakteri
yang berisi plasmid DNA tanpa DNA asing. Proses skrening ini disebut seleksi karena ini
dibuat untuk memfasilitasi identifikasi bakteri rekombinan yang mencegah perkembangan
tidak ada perubahan bakteri dan bakteri yang berisi plasmid tanpa DNA asing.
Cohen dan Boyer menggunakan seleksi antibiotik, teknik ini yang ditransfomasi sel
bakteri di dalam lapisan agar dengan antibiotik berbeda, sebagai cara untuk mengidentifikasi
bakteri rekombinan dan tidak ada perubahan sel. Selama bertahun seleksi antibiotik telah
banyak digunakan. Teknik modern kloning sering menjadi terkenal strategis seleksi, seperti
seleksi blue-white. Seleksi blue-white DNA adalah kloning pemotongan bagian di gen lac
Z.
Transformasi bakteri adalah penggambaran di dalam lapisan agar yang berisi antibiotik
ampicilin, contohnya tidak ada perubahan bakteri tidak tumbuh yang terdapat ampicilin
karena tidak ada plasmid berisi gen resiten ampicilin (ampR). Tetapi seleksi antibiotik sendiri
tidak bisa membedakan transformasi bakteri dengan plasmid tidak rekombinan yang memiliki
peredaran dari plasmid rekombinan. Untuk mengidentifikasi bakteri dengan plasmid
rekombinan, agar harus mengandung kormogenik (penghasil warna). Hasilnya, bakteri tidak
rekombinan berisi plasmid yang menyambung kembali tanpa memasukkan DNA yang
mengandung fungsi gen lac Z, penghasil -gal, dan perubahan biru.
Pengenalan Gen Kloning Manusia
Enzim retriksi, DNA ligase, dan plasmid merupakan alat secara molekul biologi untuk
memanipulasi dan kloning gen dari hakikat beberapa sumber. Dengan transformasi, ilmuwan
memiliki cara untuk mengenali DNA rekombinan didalam sel bakteri. Teknologi rekombinan
DNA membuat kemungkinan untuk memotong dan menggabungkan fragmen DNA bersamasama, memasukkan DNA kedalam plasmid, dan menghasilkan sejumlah besar pemasukan
DNA oleh bakteri untuk benar-benar bereplikasi DNA rekombinan
Fragmen DNA kloning adalah gen yang mengkode produksi protein, sel bakteri bisa
digunakan untuk sintesis protein dari gen kloning. Kita menyebutnya ekspresi protein.
Biologi molekul mengenali bahwa gen manusia bisa dikloning dan diekspresikan, teknologi
rekombinan DNA akan menjadi alat tidak terhingga dengan kekuatan dan aplikasi di
penelitian dan pengobatan.
Komersial yang pertama produksi gen manusia dari teknologi rekombinan DNA adalah
insulin manusia, hormon peptida diproduksi oleh sel di dalam pankreas yang disebut beta sel.
Ketika darah peningkatan glukosa, contohnya setelah makan makanan dengan kandungan
gula tinggi, dan insulin dalam darah rendah dengan stimulasi glukosa yang tinggi di dalam
hati dan sel otot sebagai suati rantai glukosa yang disebut glikogen. Individu dengan tipe I,
diabetus mellitus tidak bisa memproduksi insulin secara sendiri. Hasilnya kekurangan insulin,
diabetes tingginya gula darah, setelah itu bisa menyebabkan bahaya yang serius untuk organ
tubuh lainnya.
What Makes a Good Vector?

Fungsi vektor dan aplikasi telah ditingkatkan sejak Cohen membentuk pSC101.
Plasmid masih sering digunakan sebagai kloning vektor karena mereka kebiasaan digunakan
dalam kloning dan manipulasi bagian kecil DNA yang merupakan dasar untuk banyak teknik
yang digunakan sehari-hari di biologi molekular laboratorium. Salah satu yang digunakan
vektor plasmid disebut pBR322, yang dibuat termasuk resisten terhadap tetrasiklin dan
ampicilin dan berguna untuk pemotongan suatu bagian.
Keistimewaan Praktis Dari Vektor DNA Kloning
Vektor DNA kloning biasanya termasuk termasuk hal yang diinginkan
dan keistimewaan praktis
Ukuran, mereka cukup kecil untuk menjadi bagian yang mudah dari
kromosomal DNA di dalam sel inang bakteri
Sumber dari replikasi, bagian dari replikasi DNA membiarkan plasmid
untuk replikasi dari sel inang kromosom.
Bagian kelipatan kloning
Gen penanda seleksi

Rangkaian promotor RNA polimerase


Rangkaian DNA primer

Vektor Bakteriofag
DNA dari lambda bakteriofag adalah salah satu vektor fag pertama
yang digunakan untuk kloning. kromosom lamda adalah struktur linear
sekitar 49 kb DNA kloning dimasukkan ke situs restriksi di pusat
kromosom lamda. kromosom rekombinan yang kemudian dikemas
menjadi partikel virus in vitro, dan fag ini digunakan untuk menginfeksi E.
Coli tumbuh sebagai rumput. Pada setiap akhir kromosom lamda adalah
12 urutan nukleotida disebut situs kohesif (COS) yang dapat mendasarkan
pasangan satu sama lain. Ketika lamda menginfeksi E.coli sebagai tuan
rumah, kromosom lamda menggunakan situs COS untuk menegdarkan
dan kemudian meniru. lamda bakteriofag ulangan melalui proses dikenal
sebagai siklus litik. Sebagai lamda ulangan untuk membuat partikel lebih
virus, E. Coli yang terinfeksi segaris (untuk melisiskan atau untuk
membagi atau pecah) dengan lamda, menciptakan zona bakteri mati yang
disebut plak, yang muncul sebagai bintik-bintik dibersihkan di halaman
bakteri. Setiap plak mengandung jutaan partikel fag rekombinan. Sebuah
keuntungan dari vektor ini adalah bahwa mereka memungkinkan untuk
kloning fragmen DNA yang lebih besar (sampai kira-kira 25kb) dari
plasmid. vektor fag tidak lagi sangat banyak digunakan.
Kosmid Vektor
Kosmid vektor mengandung COS ujung DNA lamda, asal plasmid
replikasi, dan gen untuk resistensi antibiotik, tetapi sebagian besar gen

virus untuk resistensi antibiotik. tetapi sebagian besar gen virus telah
dihapus. DNA adalah kloning ke situs restriksi dan kosmid ini dikemas
menjadi partikel virus, seperti yang dilakukan dengan vektor
bacteriophage, dan digunakan untuk menginfeksi E. Coli, di mana di
kosmid meniru sebagai nomor plasmid copy rendah. Salah satu
keuntungan dari kosmid adalah bahwa mereka memungkinkan untuk
kloning fragmen DNA dalam kisaran 20 sampai 45 kb. Tapi seperti vektor
fag, karena perkembangan jenis lain vektor, vektor kosmid tidak lagi
sangat banyak digunakan dan telah membatasi aplikasi.
Vektor Ekspresi
Vektor ekspresi protein memungkinkan untuk sintesis tingkat tinggi
(ekspresi) protein eukariotik dalam sel bakteri karena mengandung
promotor urutan prokariotik berdekatan dengan lokasi di mana DNA
dimasukkan ke plasmid. Bakteri RNA polimerase dapat mengikat plasmid.
Bakteri RNA polimerase dapat mengikat untuk promotor dan mensintesis
sejumlah besar RNA. Yang kemudian diterjemahkan ke dalam protein.
Protein kemudian dapat diisolasi menggunakan teknik biokimia. Namun,
itu tidak selalu mungkin untuk mengekspresikan protein fungsional dalam
bakteri. Misalnya, ribosom bakteri kadang-kadang tidak dapat
menerjemahkan urutan mRNA eukariotik. Jika protein yang dihasilkan
mungkin tidak melipat dan diproses dengan benar, seperti terjadi dalam
sel eukariotik yang menggunakan organel melipat dan memodifikasi
protein. Juga, membuat beberapa produk rekombinasi di di poduk bakteri
dapat menjadi masalah karena E. Coli sering tidak protein rahasia; yang
ada untuk vector ekspresi sering digunakan dalam Bacillus subtilis,.
Dalam kasus rumah, bakteri host dapat mengenali protein
rekombinan yang asing dan menurunkan protein, sedangkan di lain
menyatakan protein lethal ke sel bakteri inang. virus tertentu seperti
SV40, dapat digunakan untuk menyampaikan ekspresi plasmid ke dalam
sel mamalia. vektor biasanya SV40 diturunkan mengandung (virus) urut
promotor kuat untuk level tinggi transkripsi dan poli Sebuah sinyal Selain
untuk menambahkan poli Atail ke ujung 3 'mRNA disintesis. variasi vektor
tersebut telah digunakan untuk terapi gen manusia.
Bacterial Artificial Chromosomes
Kromosom buatan bakteri besar plasmid copy - angka yang rendah
hadir sebagai salah satu untuk dua salinan dalam sel bakteri dan mereka
mengandung gen yang mengkodekan f - faktor ( unit gen mengendalikan
replikasi bakteri ) . BACs dapat menerima sisipan DNA di kisaran 100
sampai 300 kb . BACs secara luas digunakan di dalam manusia Genom
Project untuk mengkloning dan sekuens potongan besar kromosom
manusia

Yeast Artificial Chromosome (YACs)


Kromosom buatan ragi plasmid kecil tumbuh di E.Coli dan
diperkenalkan ke sel setahun . Sebuah YAC adalah versi miniatur dari
eukariotik kromosom . YACs mengandung asal replikasi , penanda dipilih ,
dua telomere , dan sentromer yang memungkinkan untuk replikasi dari
YAC dan segregasi ke sel anak selama pembelahan sel . fragmen DNA
asing dikloning ke situs pembatasan di pusat YAC . YACs sebagai sangat
berguna untuk kloning fregments besar DNA dari 200 kb menjadi sekitar 2
megabases dalam ukuran . Seperti BAC . YACs memainkan peran penting
dalam upaya kloning dari Proyek Genom Manusia
Ti Vector
Ti
Plasmid adalah vektor alamiah
yang
digunakan
untuk
mentransfer DNA ke dalam sel tanaman.Bakteri yang membawa plasmid
Ti
(contohnya Agrobacterium
tumefaciens)
dapat
menyebabkantumor pada tanaman yang disebut crown gall, terutama
tanaman dikotil. Pada sebagian besar plasmid Ti, terdapat lima kompleks
gen,
yaitu
T-DNA
(bagian
yang
ditransfer
dan
menyatu
dengangenom tanaman sehingga), gen virulen (vir) yang terdiri dari 50
kilo-basa untuk mengatur proses transfer T-DNA ke dalam DNA tanaman,
gen tra/trb yang mengatur perpindahan plasmid Ti antarbakteri, bagian
yang
mengatur
sistem replikasi plasmid,
dan
bagian gen yang
menyandikan molekul opin. Ketika R. radiobacters memasuki tanaman
inang, sepotong DNA (T-DNA) dari plamis (Ti berdiri untuk tumor-inducing)
memasukkan ke dalam kromosom inang. T-DNA mengkode untuk sintesis
chromone disebut auksin, yang melemahkan tumor sel inang (empedu).
genetika tanaman diakui bahwa jika mereka bisa menghapus auksin dan
gen merugikan lainnya dari plasmid Ti vektor yang dihasilkan dapat
digunakan untuk memberikan gen ke dalam sel tanaman. Ti vektor secara
luas digunakan untuk mentransfer gen ke tanaman .
Bagaimana Anda mengidentifikasi dan mengkloning gen yang
diinginkan ?
Pemotongan dan bagian yang berbeda paste dari DNA untuk
menghasilkan molekul DNA rekombinan telah menjadi teknik rutin dalam
biologi molekuler. Seorang ahli biologi molekuler sebut pendekatan
"shotgun" doning, karena banyak fragmen secara acak kloning sekaligus
dan tidak ada gen individu secara khusus ditargetkan untuk kloning. Jika
gen insulin (atau urutan yang berdekatan) tidak memiliki situs retriction
untuk enzim retriction Anda gunakan, Anda mungkin tidak memiliki
plasmid rekombinan yang mengandung gen insulin.

Membuat pustaka DNA: Membangun Koleksi gen klon


Banyak
strategi
kloning
mulai
dengan
mempersiapkan
perpustakaan DNA koleksi fragmen DNA kloning dari organisme tertentu
yang terkandung dalam bakteri atau virus pusat. Perpustakaan dapat
disimpan untuk jangka waktu yang relatif lama dan "disaring" untuk
memilih gen yang berbeda kepentingan. Dua jenis perpustakaan biasanya
digunakan untuk kloning. perpustakaan DNA genomik dan saling
melengkapi perpustakaan DNA (perpustakaan cDNA). Disebut juga bank
klon (clone bank) atau gen bank, atau pustaka klon. Sekumpulan klon
(bakteri) transformant yang mengandung set potongan DNA (cDNA) dari
sebagian atau keseluruhan set genom lengkap suatu organisme (bakteri,
virus, tumbuhan, hewan, manusia).
Genomic versus cDNA libraries
Pada perpustakaan genomic, DNA kromosom dari jaringan yang
diinginkan diisolasi dan dicerna dengan enzim restriksi. Proses ini
menghasilkan fragmen DNA yang mencakup seluruh genom organisme.
Vektor akan dicerna dengan enzim yang sama dan DNA ligase digunakan
untuk menyatukan fragmen DNA genomik dan DNA vektor. Vektor
rekombinan digunakan untuk mengubah bakteri, dan setiap klon sel
bakteri akan berisi vektor rekombinan dengan plasmid yang mengandung
fragmen DNA genomik.
Kekurangan perpustakaan genomic
Potongan DNA yang tidak mengkode protein (intron) yang
dikloning selain ekson; Mayoritas DNA genom adalah intron
pada eukariota sehingga sebagian dari perpustakaan akan
berisi potongan non-coding DNA
Banyak organisme memiliki genom yang sangat besar,
sehingga mencari gen yang diinginkan sulit.
Pada cDNA Perpustakaan, mRNA dari jaringan yang diingikan
diisolasi dan digunakan membuat perpustakaan. Dikonversi ke DNA untai
ganda dengan menggunakan enzim reverse transcriptase, enzim ini
dibuat oleh virus yang disebut retrovirus. mRNA yang dikonversi menjadi
DNA untai ganda disebut DNA komplementer (cDNA) karena merupakan
salinan dari mRNA. mRNA akan terdegradasi oleh pengobatan dengan
larutan alkali atau pencernaan enzimatis, DNA polimerase yang digunakan
untuk membuat untai kedua DNA. urutan linker pendek ditambahkan ke
akhir cDNA yang mengandung pembatasan situs pengenalan enzim.
Kemudian dipotong dengan enzim restriksi, vektor dipotong dengan enzim
yang sama, fragmen disatukan untuk menciptakan vektor rekombinan.
Vektor digunakan untuk mengubah bakteri.
Keuntungan cDNA Perpustakaan

Koleksi gen aktif dinyatakan dalam sel atau jaringan dari mana
mRNA diisolasi
Intron tidakdikloning
Dapat dibuat dan disaring untuk mengisolasi gen yang terutama
dinyatakan hanya dalam kondisi tertentu di jaringan
Kerugian cDNA Perpustakaan
Bisa sulit untuk membuat perpustakaan cDNA jika jaringan sumber
dengan jumlah yang berlimpah mRNA untuk gen tidak tersedia

Library Screening
Perpustakaan "disaring" untuk mengidentifikasi gen yang
diinginkan. salah satu teknik penyaringan perpustakaan yang paling
umum disebut Colony hibridisasi. Pada Colony hibridisasi, koloni bakteri
yang mengandung DNA rekombinan ditumbuhkan pada plate agar.
Sebuah Nylon atau filter nitroselulosa ditempatkan di atas piring dan
beberapa koloni bakteri menempel filter di lokasi yang tepat mereka di
piring. Perlakukan filter dengan larutan alkali untuk melisiskan sel dan
denaturasi DNA, DNA terdenaturasi mengikat untuk menyaring sebagai
DNA untai tunggal
Filter diinkubasi dengan probe, fragmen DNA yang merupakan
pelengkap dari gen yang diinginkan. Probe mengikat dengan ikatan
hidrogen ke urutan komplementer pada filter.Filter dicuci untuk
menghilangkan kelebihan penyelidikan terikat.
Filter terkena film autoradiografi
Di mana saja penyelidikan telah terikat, cahaya akan dipancarkan
dan mengekspos butir perak dalam film
Film dikembangkan untuk membuat catatan permanen dari
hibridisasi koloni
Film ini kemudian dibandingkan dengan plate agar asli untuk
mengidentifikasi koloni terdapat plasmid rekombinan dengan gen
dari bunga
Polymerase Chain Reaction (PCR) / Reaksi Polimerasi Berantai
Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase
adalah metode enzimatis untuk melipatgandakan (amplification) secara
eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini
ditemukan oleh Kary B. Mullis pada tahun 1985, seorang saintis dari
perusahaan CETUS Corporation. Metode PCR ini pada awalnya hanya
digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, akan tetapi dalam
perkembangannya dapat digunakan untuk melipatgandakan molekul
mRNA.

Metode PCR dapat melipatgandakan (amplification) suatu fragmen


molekul DNA menjadi molekul DNA (110 bp/5x10-19) sebesar 200.000 kali
setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit. Kelebihan dari
metode PCR adalah DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu
dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan untuk
melipatgandakan suatu sekuen DNA dalam genom bakteri hanya dengan
mencampurkan kultur bakteri di dalam tabung PCR.
Penggunaan metode PCR diperlukan empat komponen utama, yakni
(1) DNA cetakan, (2) oligonukleotida primer, (3) deosiribonukleotida
trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan (4) enzim
polimerase yang digunakan untuk mengkatalis reaksi sintesis rantai DNA.
Proses PCR terdiri dari tiga tahap, yakni :
Denaturasi: suatu fragmen DNA (duoble strand) dipanaskan pada
suhu 95 C selama 1-2 menit sehingga akan terpisah menjadi rantai
tunggal (single strand).
Penempelan (annealing): dilakukan penempelan (annealing) pada
suhu 55C selama 1-2 menit, yakni oligonukleotida primer
menempel pada DNA cetakan yang komplementer dengan sekuen
primer.
Amplifikasi: suhu dinaikkan menjadi 72 C selama 1,5 menit. Pada
suhu ini, enzim DNA polimerase akan melakukan poses polimerasi,
yakni rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen
dengan DNA cetakan.
Reaksi-reaksi seperti diatas dapat diulangi sampai 25-30 kali (siklus)
sehingga akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru.
Banyaknya amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target yang akan
digunakan. Setelah diperoleh molekul-molekul DNA dalam jumlah yang
sesuai, maka DNA tersebut dapat diamati dengan menggunakan cara
elektroforesis gel, analisis fragmen restriksi, atau metode Sanger.
Produk Kloning PCR
Sejak ditemukannya metode PCR, perkembangan dunia biologi
molekular dan bioteknologi semakin pesat. Beberapa contoh penerapan
PCR antara lain: studi arkeologi gen purba, seperti fragmen DNA kuno
dari gajah purba (mammoth) yang telah membeku selama 400.000 tahun,
analisis tindakan kriminal dengan sedikit sampel darah, sperma, sidik jari
atau jaringan, deteksi virus papilloma pada kelamin manusia , deteksi
DNA atau RNA virus yang sulit terdeteksi, seperti HIV, diagnosa kelainan
genetic sebelum kelairan, peramalan hemophilia, isolasi DNA dari
miselium jamur dan spora, pengujian kualitas air minum, analisis
filogenetik dalam taksonomi, identifikasi polimorfisme DNA, identifikasi
jenis kelamin, skrining pustaka gen gt11, penentuan urutan nukleotida,
pemetaan genom manusia, dan lain-lain.

TEKNIK
LABORATORIUM
DAN
APLIKASI
TEKNOLOGI
DNA
REKOMBINAN
Elektroforesis Gel Agarosa
Metoda elektroforesis gel agarosa didasarkan pada pergerakan
molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah
pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa
atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk
memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan
dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat
memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis
poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA
(sekuensing). Molekul organik yang dapat dielektroforesis antara lain DNA,
RNA, dan protein. Molekul-molekul yang bermuatan positif akan bergerak
menuju elektroda negatif, sedangkan molekul bermuatan negatif akan
bergerak ke elektroda positif melalui gel elektroforesis. Lokasi fragmen
DNA yang terbentuk seperti pita-pita pada elektroforesis dapat diamati
secara spesifik dengan menggunakan pewarna. Pewarna yang digunakan
adalah etidium bromida yang dapat menyisip di antara basa-basa pada
DNA. Gel yang diberi etidium bromida dan disinari dengan UV akan
memperlihatkan lokasi DNA sebagai untai berwarna merah-jingga. Etidium
bromida merupakan senyawa karsinogenik sehingga dalam melaksanakan
percobaan yang menggunakan etidium bromida harus menggunakan
sarung tangan.
Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Gel agarosa dapat
melakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus
hingga
20.000
pasang
basa
(pb). Molekul
DNA
bermuatan
negatif sehingga nanti di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui
matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya,
makin rendah laju migrasinya.
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran
fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti
yang berbeda ukuran, kemudian di-sequencing, dan juga untuk pemurnian
atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai
macam kegiatan, yaitu membandingkan gen homolog dari sspesies yang
berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA
fingerprinting, mendeteksi kelainan genetic, mendeteksi lokasi dan jumlah
mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama
perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan perlakuan
gen, mempelajari evolusi tingkat molecular, mengetahui variasi genetik

yang ada di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA,


RNA, dan protein tertentu, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan
genetik antar individu, mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon
dalam rekombinan DNA plasmid, menganalisa fragmen DNA yang
diamplifikasi lewat PCR, dll.
Struktur Gen Pemetaan Pembatasan
Setelah gen dikloning, jenis peta fisik gen akan dibuat untuk
menentukan enzim restriksi yang memotong gen kloning dan menentukan
lokasi dari situs-situs pemotongan. Peta pembatasan gen sangat berguna
untuk membuat klon dari potongan-potongan kecil gen (disebut
subcloning) dan memanipulasi banyak potongan-potongan yang relatif
kecil dari DNA (misalnya, 100 sampai 1000 bp) untuk urutan DNA dan
mempersiapkan probe DNA untuk belajar gen ekspresi. Untuk membuat
peta pembatasan, DNA kloning dikenakan serangkaian tunggal dengan
enzim restriksi serta mencerna ganda dengan menggabungkan enzim;
DNA dicerna kemudian dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa.
Setelah sampel DNA telah dicerna dipisahkan, dan divisualisasikan
dengan elektroforesis gel, menciptakan peta pembatasan yang
sebenarnya adalah seperti merakit sebuah teka-teki.
Karena potongan sekuensing DNA relatif kecil, pemetaan
pembatasan sekarang biasanya dilakukan dengan menggunakan software
bioinformation, mengidentifikasi pembatasan pemotongan situs di urutan
DNA tanpa harus benar-benar mencerna DNA dan membuat peta
eksperimental. Namun, karena pentingnya sejarah pembatasan pemetaan
dan penggunaannya sesekali saat ini, masih nilai untuk menyadari teknik
ini
Sekuensing DNA
Penting untuk menentukan urutan gen nukleotida, urutan yang
tepat dari As, Gs, Ts, dan Cs. Mengetahui urutan DNA dari gen dapat
membantu (1) untuk menyimpulkan urutan asam amino dari protein yang
dikode oleh gen kloning, (2) untuk menentukan struktur yang tepat dari
gen, (3) untuk mengidentifikasi unsur-unsur peraturan seperti urutan
promotor , (4) untuk mengidentifikasi perbedaan dalam gen diciptakan
oleh splicing gen, dan (5) untuk mengidentifikasi mutasi genetic.
Pendekatan sekuencing yang paling banyak digunakan adalah
rantai-terminasi sekuencing, metode manual dikembangkan pada tahun
1977 oleh Frederick Sanger dan sering disebut sebagai metode Sanger.
Dalam teknik ini, sebuah primer DNA hibridisasi DNA template yang
terdenaturasi, seperti plasmid rekombinan yang akan diurutkan, dalam
tabung reaksi yang mengandung deoksiribonukleotida dan DNA

polimerase. Karena banyak plasmid modern dirancang dengan sekuencing


primer.
Dalam pendekatan Sanger, empat tabung reaksi yang terpisah
didirikan. Setiap tabung berisi vektor, primer, dan semua empat dNTP,
tetapi masing-masing tabung juga mengandung sejumlah kecil dari satu
ddNTP. Sebagai sintesis dari DNA untai baru primer dimulai, DNA
polimerase secara acak menyisipkan ddNTP ke urutan dNTP normal, untuk
mencegah sintesis lebih lanjut dari untai komplementer. Sebuah ddNTP
akan dimasukkan di semua posisi di alur yang baru disintesis,
menciptakan serangkaian fragmen dari berbagai panjang yang berakhir
pada residu dideoksi. Untuk teknik Sanger, untai DNA dipisahkan pada gel
poliakrilamida tipis, yang dapat memisahkan urutan yang berbeda dalam
panjang oleh nukleotida tunggal. Autoradiografi digunakan untuk
mendeteksi fragmen sekuencing radioaktif. Urutan ditentukan dari
autoradiogram adalah "membaca" dari bawah ke atas sebagai nukleotida
individu. Urutan ditentukan dari autoradiogram adalah melengkapi urutan
pada untai cetakan dalam vektor.
Throughput Tinggi Sequencing Komputer-Otomatis Menggantikan
Teknik Sanger Sequencing Asli
Karena keterbatasan dalam menjalankan gel sequencing, metode
Sanger asli dapat digunakan hanya untuk urutan sekitar 200 hingga 400
nukleotida dalam reaksi tunggal; Oleh karena itu, dalam sequencing
sepotong lagi dari DNA - misalnya, 1.000 pasang basa - itu wqas
diperlukan untuk menjalankan beberapa reaksi untuk membuat urutan
tumpang tindih yang dapat disatukan untuk menentukan seluruh, urutan
continous
dari
1.000
pasangan
basa.
Karena keterbatasan ini, pendekatan sequencing Sanger adalah metode
praktis untuk upaya sequencing skala besar seperti yang digunakan untuk
proyek genom manusia. Proyek ini selesai lebih cepat dari jadwal
sebagian karena pengembangan metode sekuensing DNA komputerotomatis mampu sequencing membentang panjang DNA (lebih dari 500
bp di rection tunggal). Awalnya komputer-otomatis sequencing rection
digunakan baik ddNTP, masing-masing diberi label dengan pewarna
berwarna berbeda nonradioactive fluorescent, atau primer sequencing
berlabel di 5 nya 'berakhir dengan pewarna (Figyre 3.12). Sebuah tabung
reaksi tunggal digunakan, dan pendekatan manual-gaya menggunakan
polyacry; gel amida diikuti oleh autoradiografi telah digantikan dengan
memisahkan reaksi sekuensing pada satu jalur dari ube gel diameter
ultrathin disebut kapiler gel. Sebagai fragmen DNA bergerak melalui gel,
mereka dipindai dengan sinar laser. Laser merangsang pewarna
fluorescent pada setiap frgament DNA, yang memancarkan panjang
gelombang cahaya yang berbeda untuk setiap ddNTP. Cahaya yang

dipancarkan dikumpulkan oleh detektor yang menguatkan dan dari feed


informasi ini ke komputer untuk memproses dan mengkonversi pola
lampu dan mengungkapkan sequece DNA (Gambar 3.13).
Next-Generation Sequencing (NGS)
Genomics telah mendorong permintaan untuk sequencer yang lebih
cepat dan mampu menghasilkan jutaan basa urutan DNA dalam waktu
yang relatif singkat, mengarah ke pengembangan dari generasi
sequencing (NGS) teknologi yang dirancang untuk menghasilkan
peregangan sangat akurat dan panjang urutan DNA, lebih besar dari 1
gigabse DNA per reksi, dengan biaya rendah. Pendekatan sequencing
generasi membuang teknik Sanger dan metode elektroforesis kapiler
canggih mendukung format paralel yang menggunakan state-of-teknik
pencitraan seni fluoresensi. Teknologi NGS menyediakan kapasitas
unprecendented untuk menghasilkan sejumlah besar data sekuens DNA
dengan cepat dan pada dramaticlly mengurangi biaya per dasar.
Keinginan untuk sequencing generasi mong komunitas riset dan
tantangan seperti $ 1,000 genom telah menyebabkan perlombaan
etechnology intens di antara banyak perusahaan ingin menghasilkan
metode NGS. Pada tahun 2005, Roche 454 Hidup Sistem adalah
perusahaan pertama untuk mengkomersilkan teknologi sequencing
generasi. sequencing pendekatan ini genomeusing metode fase padat
disebut yang manik-manik areattached untuk DNA genom terfragmentasi,
yang kemudian PCR-diperkuat terpisah .... Tetesan minyak untuk setiap
manik, dimuat ke .... Piring, dan dicampur dengan polymerae DNA. ... ..
Piring sering mengandung lebih dari satu juta sumur dengan satu manikmanik per sumur, masing-masing melayani sebagai tabung reaksi ....
pengurutan. Sebuah pyrosequencing reaksi yang disebut kemudian
digunakan untuk sequene DNA dari manik-manik di setiap sumur.
Dalam pyrosequencing, nukleotida berlabel tunggal mengalir di atas
sumur. Setiap manik tunggal juga containsa bersama dengan primer anil
dengan DNA pada manik-manik. Ketika nukleotida komplementer
melintasi template strand berdekatan dengan primer, itu ditambahkan ke
ujung 3 'dari primer oleh polimerase DNA. penggabungan hasil nukleotida
dalam rilis pirofosfat, yang memulai serangkaian .... Reaksi yang pada
akhirnya menghasilkan cahaya dengan menggunakan enzim luciferase
kunang-kunang. Dipancarkan cahaya dari reaksi ditangkap dan perekam
untuk menentukan kapan suatu nukleotida tunggal telah dimasukkan ke
dalam untai a. Dengan cepat mengulangi langkah nukleotida-aliran
dengan masing-masing empat nukleotida untuk menentukan dasar adalah
berikutnya dalam suquences pendekatan cann ini menghasilkan panjang
membaca sekitar 40 basis dan pada urutan 400 juta basis data per 10 jam
run. NGS sequencing technologie yang aslso menciptakan tantangan Data
-mnagement utama untuk menyimpan dan menyimpan seperti besar file

data
gambar.
Perusahaan
Diterapkan
Biosystems
(ABI)
telah
mengembangkan pendekatan yang
disebut solid
yang
dapat
menghasilkan 6 gigabase urutan DTA per run! Metode padat
menggabungkan berbagai pendekatan untuk urutan fragmen DNA yang
terkait dengan manik-manik dan aplified, mirip dengan 454 pendekatan,
tetapi berbeda teknologi sequencing digunakan yang ... memberikan
output yang lebih besar dari data yang sequencing per instrumen jangka.
Roche 454 Next-Generation Sequencing Teknologi
Roche 454 teknologi sequencing mengikat fragmen DNA ke manikmanik. fragmen DNA diperkuat dengan PCR dan kemudian addedto sumur
(langkah 1) dan dikenakan pyrosequencing, di dijelaskan dalam teks.
(Langkah 2) Selama pyrosequencing, sebuah nukleotida neon individu,
biru G ditunjukkan dalam hal ini, adalah flowedover sumur. Sebagai
nukleotida ditambahkan ke primer dengan DNA polimerase, di pirofosfat
organik (PPi) dilepaskan yang bereaksi dengan adenosine 5'phosphosulfate (APS) dan enzim sulfurylase untuk menghasilkan ATP
(panah biru). Enzim luciferase kunang-kunang menggunakan ATP untuk
menghasilkan cahaya, yang dapat dideteksi dan diukur. (Langkah 3)
Cahaya ditangkap oleh sistem deteksi dianalisis untuk melacak pola
nukleotida ditambahkan ke masing-masing dengan baik. Siklus aliran
selanjutnya diulang dengan masing-masing tiga nukleotida lainnya. Terusmenerus ... dari proses ini menghasilkan sequencing membaca sekitar
400 basis.
Fluoresensi in situ Hibridisasi
Teknik yang disebut Fluorescence In Situ Hibridisasi (FISH) dapat
digunakan untuk mengidentifikasi kromosom mengandung gen yang
diinginkan. Misalnya, jika Anda hanya kloning gen manusia diyakini
sebagai gen yang diinginkan. Misalnya, jika Anda hanya kloning gen
manusia diyakini terlibat dalam kecerdasan, Anda bisa menggunakan
IKAN untuk menentukan di mana kromosom berada gen ini. Dalam IKAN,
kromosom terisolasi sel bentuk seperti cellls darah putih dan tersebar di
kaca mikroskop slide. Sebuah DNA atau RNA Probe untuk gen yang
diinginkan dilabeli dengan nukleotida fluoresensi dan kemudian diinkubasi
dalam larutan dengan slide. probe hybridizes dengan urutan
komplementer pada kromosom pada slide. slide dicuci dan kemudian
terkena cahaya fluoresensi. Dimanapun probe telah terikat chrmosome,
maka flourescentl berlabel probe diterangi untuk menunjukkan adanya
probe yang mengikat.
Menentukan mana dari 23 kromosom manusia menunjukkan
fluoresensi, mereka selaras sesuai dengan panjang dan pewarnaan pola
kromatid mereka untuk membuat kariotipe. Fluoresensi pada lebih dari
satu kromosom menunjukkan baik beberapa salinan dari gen atau urutan

terkait yang mungkin menjadi bagian dari keluarga gen. IKAN juga
digunakan untuk menganalisis kelainan genetik.
Ketika gen diekspresikan dalam organ dengan banyak sel yang
berbeda jenis-misalnya, ginjal atau otak jaringan-FISH juga dapat
digunakan untuk menentukan jenis sel yang mengekspresikan mRNA
tertentu. Dalam pendekatan ini, jaringan bunga yang diawetkan dalam
larutan fiksatif dan kemudian tertanam dalam bahan seperti lilin atau
resin.
Blotting selatan teknik lain, yang disebut analisis Southern blot, sering
digunakan untuk menentukan jumlah salinan gen antara aplikasi lainnya.
Southern blotting dimulai dengan mencerna DNA kromosom menjadi
fragmen kecil dengan enzim restriksi fragmen DNA dipisahkan oleh
elechtrophoresis gel agarosa. Namun, jumlah fragmen restriksi yang
dihasilkan oleh mencerna DNA kromosom sering begitu besar sehingga
hanya berjalan gel dan pewarnaan DNA tidak menyelesaikan fragmen
diskrit. Sebaliknya, DNA dicerna muncul sebagai smear terus menerus
fragmen pada gel. Southern blotting digunakan untuk memvisualisasikan
hanya fragmen tertentu yang menarik. Berikut elektroforesis, gel
diperlakukan dengan soluton alkali untuk denaturasi DNA; maka fragmen
yang ditransfer ke membran nilon atau nitroselulosa menggunakan teknik
yang disebut blotting.
Blotting dapat dicapai dengan mendirikan gel sandwichin yang gel
ditempatkan di bawah membran nilon, kertas saring, kertas handuk, dan
berat untuk memungkinkan wicking dari larutan garam melalui gell, yang
akan mentransfer DNA ke nylon dengan aksi kapiler . Single-untai DNA
yang menempel pada blot, diposisikan di band persis seperti pada gel.
Atau, tekanan atau vakum blotters dapat usedto DNA mentransfer ke
nilon. Nilon blot kemudian dipanggang atau sebentar terkena sinar UV
untuk melampirkan DNA premanently. Berikutnya blot tersebut diinkubasi
dengan probe berlabel dalam banyak cara yang sama bahwa hibridisasi
koloni dilakukan. Semakin, probe nonradioactive yang digunakan untuk
Southern blotting dan banyak teknik hibridisasi lainnya.
Pengembangan analisis Southern blot adalah teknik penting, yang
membentuk prinsip-prinsip dasar untuk Nothern blotting (blotting
pemisahan ans molekul RNA, seperti yang dibahas pada bagian
berikutnya) dan Western blotting (pemisahan dan blotting protein.
Mempelajari Ekspresi Gen
Para ahli biologi molekuler di seluruh dunia yang terlibat dalam
penelitian mempelajari ekspresi gen dan regulasi ekspresi gen. Banyak
teknik molekuler yang berbeda avalabe untuk mempelajari ekspresi gen.
Kebanyakan methodes melibatkan menganalisis mRNA yang dihasilkan
oleh tisu. Hal ini sering ukuran yang baik dari ekspresi gen karena yhe

jumlah mRNA menghasilkan oleh tisu sering setara dengan jumlah protein
jaringan membuat.
Northern Blot
Metodologi dasar noda Northern mirip dengan analisis selatan blot .
Dalam blotthing utara. RNA diisolasi dari dipermasalahkan bunga dan
dipisahkan dengan elektroforesis gel ( RNA tidak dicerna dengan enzim ).
RNA dihapuskan ke sebuah membrase nilon dan kemudian hibridisasi
untuk probe, seperti yang dijelaskan untuk bercak selatan . terkena band
pada autoradiogram menunjukkan adanya mRNA untuk gen dari bunga
dan ukuran mRNA yang
Reverse transkripsi PCR
Kadang-kadang jumlah RNA yang diproduksi oleh jaringan adalah di
bawah tingkat deteksi dengan analisis utara blot PCR memungkinkan
untuk mendeteksi jumlah menit mRNA bahkan dari jumlah yang sangat
kecil dari jaringan strating . misalnya , PCR telah alat untuk ahli biologi
molekuler belajar ekspresi gen pada embrio dan mengembangkan
jaringan di mana jumlah jaringan untuk analisis sangat kecil. Karena RNA
tidak dapat langsung diperkuat oleh PCR , teknik yang disebut reverse
transkripsi PCR ( RT PCR ) dilakukan . di RT PCR mRNA diubah menjadi
cDNA beruntai ganda oleh enzim reverse transcriptase dalam proses mirip
dengan cara di mana cDNA untuk perpustakaan dibuat . cDNA kemudian
diperkuat dengan satu set primer spesifik untuk gen yang diinginkan .
diperkuat fragmen DNA yang pola ekspresi electromine di tisu . jumlah
cDNA yang dihasilkan dalam reaksi RT PCR untuk kepentingan gen
tertentu mencerminkan jumlah.
real time PCR
realtime atau kuantitatif PCR ( qPCR ) memungkinkan penelitian untuk
mengukur reaksi amplifikasi yang terjadi dalam " real time " . prosedur
bacis melibatkan penggunaan cyclers termal khusus yang menggunakan
laser untuk memindai seberkas cahaya pikir atas atau bawah dari masingmasing tabung PCR. masing-masing tabung reaksi berisi baik probe
pewarna yang mengandung atau DNA mengikat PEWARNA yang
memancarkan cahaya fluorescente ketika diterangi oleh laser . cahaya
yang dipancarkan oleh zat pewarna corelates dengan jumlah PCR roduce
diperkuat .diperkuat cahaya dari masing-masing tabung ditangkap oleh
detektor yang menyampaikan informasi ke komputer untuk memberikan
pembacaan ion jumlah flourescene setelah setiap siklus pembacaan ini
dapat diplot dan dianalisa untuk menentukan kuantitas jumlah produk
PCR yang dihasilkan setelah setiap siklus.

Genomik Dan Bioinformatika: Hot Disiplin Bioteknologi


Genomik - kloning, sekuensing, dan menganalisis seluruh genom
Seluruh genom senapan sequencing atau kloning senapan. analogi
adalah bahwa kloning gen individu menggunakan perpustakaan
setara dengan menggunakan senapan untuk memukul tempat
tertentu pada target, sedangkan pelet dari senapan secara acak
akan memukul banyak bintik-bintik pada target dengan sedikit
presisi.
Urutan genom lengkap dirakit dengan bantuan program perangkat
lunak
dan
kemudian
gen
individu
diidentifikasi
melalui
bioinformatika.
Pada senapan Sekuensing, seluruh genom intron dan ekson adalah
berurutan.
Menggunakan enzim restriksi untuk mencerna potongan seluruh
kromosom:
Menghasilkan ribuan tumpang tindih fragmen disebut contigs
yang masing-masing diurutkan.
Program komputer yang digunakan untuk menyelaraskan
fragmen sequencing berdasarkan tumpang tindih urutan
potongan
Bioinformatika:
Penggabungan
biologi
molekuler
dengan
teknologi komputer
Bidang interdisipliner yang berlaku ilmu komputer dan teknologi
informasi untuk mempromosikan pemahaman tentang proses
biologi.
manipulasi database data sekuens DNA di antara aplikasi pertama
dari bioinformatika, yang melibatkan penggunaan perangkat keras
komputer dan perangkat lunak untuk belajar mengatur, membagi
dan menganalisis data yang terkait dengan struktur dan fungsi gen.
GenBank = database publik urutan DNA dan berisi Institut Nasional
Kesehatan koleksi urutan DNA.
Setiap entri memiliki nomor aksesi yang menggunakan ilmuwan
untuk merujuk kembali ke urutan kloning.
Dikelola oleh Pusat Nasional untuk Biotechnology Information
(NCBI). NCBI adalah tambang emas untuk sumber daya
bioinformatika yang menciptakan database akses publik dan
mengembangkan alat komputasi untuk menganalisis dan berbagi
genom Data.
Mencari database DNA

Dasar Lokal Keselarasan Search Tool (BLAST) Digunakan untuk


mencari GenBank untuk urutan pertandingan antara gen kloning
dan untuk membuat DNA urutan keberpihakan.
Pergi ke website BLAST dan klik standard nucleotide-nucleotide
BLAST [blastn]. Pada kotak pencarian, tipe pada urutan
berikutnya : AATAAAGAAC CAGGAGTGGA. Bayangkan bahwa
urutan ini dari sepotong dari gen yang kamu kloningkan dan
urutkan dan kamu ingin tau seseorang yang kloning sebelum
kamu. Klik tombol Blast . Jawabanmu akan ada 2 menit
kemudian. Klik tombol Format untuk melihat jawaban
pencarianmu.

Genom Kloning Upaya Proporsi Epik : Proyek Genom Manusia


Dimulai pada tahun 1990 oleh AS Departemen Energi. Internasional
upaya kolaboratif untuk mengidentifikasi semua gen manusia dan urutan
semua pasangan basa dari 24 kromosom manusia. Banyak dilakukan oleh
20 pusat di 18 negara: Cina, Perancis, Jerman, Inggris, Jepang, dan
Amerika Serikat. Pesaing adalah perusahaan swasta, Celera Genomics,
disutradarai oleh Dr J. Craig Venter
The Human Genome Project dirancang untuk mencapai berikut:
Menganalisis variasi genetik antara manusia. Ini termasuk identifikasi
polimorfisme nukleotida tunggal. Peta dan urutan genom organisme
model, termasuk bakteri, ragi, cacing gelang, lalat buah, tikus, dan lainlain. Mengembangkan teknologi laboratorium baru seperti bertenaga
tinggi sequencer otomatis dan teknologi komputasi, serta database yang
tersedia secara luas informasi genom, yang dapat digunakan untuk
memajukan analisis dan pemahaman tentang struktur dan fungsi gen kita.
Menyebarkan informasi genom antara para ilmuwan dan masyarakat
umum. Mempertimbangkan isu-isu etika, hukum, dan sosial yang
menyertai HGP dan penelitian genetik.
April 14, 2003: peta genom manusia telah selesai. Terdiri dari
20.000 gen penyandi protein. Peta lengkap dengan hampir semua basis
diidentifikasi dan ditempatkan dalam rangka mereka dan gen potensial
ditugaskan untuk kromosom.
Apa Yang Telah Kita Pelajari Dari Genom Manusia ?
Hampir 50% gen belum memiliki fungsi. Ringkasan temuan: Genom
manusia terdiri dari sekitar 3,1 miliar pasangan basa. Genom adalah
sekitar 99,9% sama antara individu dari semua bangsa. Polimorfisme
nukleotida tunggal (SNP) dan nomor copy variasi (CNV) -seperti
penghapusan selama, sisipan dan duplikasi dalam genom-account untuk
banyak keanekaragaman genom diidentifikasi antara manusia. Kurang
dari 2% dari kode genom untuk gen.

Sebagian besar DNA kita adalah non-protein coding, dan akun


urutan DNA berulang untuk setidaknya 50% dari DNA noncoding. Genom
berisi sekitar 20.000 gen penyandi protein. Banyak gen manusia mampu
membuat lebih dari satu protein, yang memungkinkan sel-sel manusia
untuk membuat setidaknya 100.000 protein dari hanya sekitar 20.000
gen. Kromosom 1 berisi jumlah tertinggi gen. Kromosom Y mengandung
gen paling sedikit.
Banyak dari gen dalam genom manusia menunjukkan tingkat tinggi
kesamaan urutan gen dalam organisme lain. Ribuan gen penyakit
manusia telah diidentifikasi dan dipetakan ke lokasi kromosom mereka.
Proyek Genom Manusia Dimulai sebuah revolusi Omics
Proteomik-belajar semua protein dalam sel.
Metabolomik-mempelajari protein dan jalur enzimatik yang terlibat
dalam metabolisme sel.
Glycomics-mempelajari karbohidrat dari sel.
Transcriptomik-mempelajari semua gen ditranskripsikan dalam sel.
Metagenomics-analisis genom organisme di lingkungan.
Farmakogenomik-disesuaikan obat berdasarkan profil genetik
seseorang untuk kondisi tertentu.
Nutrigenomik-interaksi antara gen dan diet.
Genomik Perbandingan
Pemetaan dan sequencing genom dari sejumlah organisme model.
Memungkinkan peneliti untuk mempelajari struktur dan fungsi gen
pada organisme ini dengan cara-cara yang dirancang untuk
memahami struktur dan fungsi gen pada spesies lain termasuk
manusia.
Zaman Batu Genomics (paleogenomics) : Menganalisis DNA "kuno".
10 Tahun Setelah Selesai HGP-Apa Selanjutnya?
Manusia epigenome proyek-membuat peta perubahan epigenetik
dalam sel dan jaringan yang berbeda jenis.
HapMap Proyek-karakterisasi internasional SNP untuk peran mereka
dalam variasi genom, penyakit dan pharmacogenomics aplikasi.
Ensiklopedia elemen DNA (ENKODE) -Gunakan pendekatan
eksperimental dan bioinformatika untuk ID dan menganalisis
elemen fungsional yang mengatur ekspresi gen manusia.
Proyek genom pribadi: Kanker genom proyek-peta gen penting dan
perubahan genetik yang terlibat dalam kanker.
Proyek Genom Kanker

Kanker sebagai penyakit memiliki banyak komponen genetik. NIH


mulai bekerja proyek genom kanker yang disebut genom kanker atlas
proyek (TCGA) untuk memetakan gen penting dan perubahan genetik
yang terlibat dalam kanker. Proyek TCGA telah diurutkan lebih dari 100
genom parsial untuk berbagai jenis kanker sampai saat ini. Bersama-sama
dengan sekelompok peneliti di negara-negara, yang disebut Konsorsium
Cancer Genome internasional (JCGC), ada rencana untuk urutan genom
dari lebih dari 500 sampel tumor yang mewakili lebih dari 20 jenis kanker
yang berbeda.