Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1. Tujuan Percobaan
Setelah melakukan percobaan ini mahasiswa diharapkan
dapat :
a. Menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi
b. Mengoperasikan alat kromatogradi cair dengan baik
dan benar
c. Menganalisi salah satu senyawa kimia baik secara
kualitatif maupun kuantitatif dengan menggunakan alat
kromatografi cair kinerja tinggi

2. Dasar Teori
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah metode
pemisahan komponen dalam larutan berdasarkan ukuran
dan polaritas molekulnya. Bila ditinjau dari sistem
peralatannya maka KCKT termasuk kromatografi kolom
karena fase diam yang dipakai diisikan kedalam kolom,
sedangkan bila ditinjau dari proses pemisahannya KCKT
dapat digolongkan sebagai kromatografi adsorbsi /
kromatografi pratisi
Proses pemisahannya berdasarkan afinitas, filtrasi gel
dan ion yang berpasangan akan tetapi proses
pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai
pemakaian pelarut pengembang dengan tekanan tinggi.
Sistem KCKT memiliki dua kegunaan yaitu pemisahan dan
pendeteksian
Keuntungan KCKT :
Dapat diaplikasikan pada suhu kamar
Detektor dapat divariasi
Pelarut pengembang dapat dipakai berulang kali,
demikian juga dengan kolomnya
Ketepatan dan ketelitian relatif tinggi di jajaran
teknik analisis kimia fisika
Teknik pemisahan pada KCKT
Sistem Isokratik

Teknik pemisahan dengan komposisi fase gerak tidak

berubah selama analisis berlangsung. Hal ini berarti sistem
fase gerak tetap selama pemisahan berlangsung sehingga
pemisahan contoh yang mengandung komponen
komponen dengan polaritas bervarisasi adalah memberikan
hasil yang kurang memuaskan
Sistem Gradien
Teknik pemisahan dengan komponen pemisahan
fase gerak berubah secara periodik selama analisis
berlangsung. Hal ini berarti selama analisis, polaritas fase
gerak bervariasi / berubah-ubah. Sistem ini digunakan untuk
pemisahan contoh yang mengandung komponen
komponen dengan polaritas bervariasi sehingga akan
memberikan hasil pemisahan yang baik
Teori Tambahan :
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau bisa juga
disebut dengan high performance liquid chromatograph
(HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat
digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif, HPLC
secara mendasar merupakan sebuah perkembangan tingkat
tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang
menetes melalui kolom dibawah pengaruh gravitasi, HPLC
didukung oleh pompa yang dapat memberikan tekanan
tinggi sampai 400 atm. Hal ini membuat HPLC dapat
memisahkan komponen sample lebih cepat. Saat ini, HPLC
merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis pemurnian senyawa tertentu dalam suatu
sample dalam berbagai bidang, antara lain : farmasi,
lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri industri
makanan. Beberapa perkembangan HPLC antara lain :
miniaturisasi sistem HPLC, penggunaan HPLC untuk asam
asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat, dan
analisis senyawa senyawa kiral.
Jenis jenis HPLC :
1. Kromatografi adsorbsi

2.
3.
4.
5.
6.

Prinsip kerja kromatografi adsorbsi sama dengan

kromatografi lapis tipis
Kromatografi fase terikat ( Pratisi )
Fase diam kromatografi ini ialah silika dan fase geraknya
etanol
Kromatografi penukar ion
Kromatografi pasangann ion
Kromatografi eksklusi umum
Kromatografi afinitas

3. Alat & Bahan yang digunakan

Alat :
Seperangkat alat KCKT / HPLC yang dilengkapi
dengan injektor dan pencetak kromatogram
Kolom lichosphere C-18
Syringe
Penyaring milipore
Neraca analitik
Labu takar 100 & 1000 ml
Pipet volume 2, 5 dan 10 ml
Corong gelas
Gelas Kimia / gelas piala 100 & 250 ml

Bahan :
Caffein sintetis 30 ml ( 15 gr/ l)

4. Tugas
1. Apa perbedaan sistem isokratik dan sistem gradien
pada alat HPLC ?
Jawab :
Perbedaannya :
Sistem Isokratik -> fase geraknya diam, lebih sensitif
terhadap perubahan fase gerak,
temprature, kecepatan pompa, dan
komposisi sample.
Hasil pengamatan kurang akurat
Sistem gradien
-> fase geraknya bergerak secara
periodik, kurang sensitif terhadap
perubahan fase gerak, temperature,
kecepatan pompa dan komposisi
sample,
namun
sangat
sensitif
terhadap kolom, waktu kalibrasi dan
preparasi gradien

5. Analisa Percobaan
Dari percobaan dapat dianalisa bahwa pada
praktikum KCKT ini merupakan pemisahan dengan prinsip
adsorbsi, dianalisa menggunakan UHPLC unit dengan
basis komputerisasi yang bisa dikatakan lebih akurat.
Sample yang digunakan ialah caffein sintetis sebanyak 30
ml didalam kolom 20 ml, hal ini dikakukan agar tidak
mengalami kekurangan sample karena pada alat injektor
ukuran yang diminta adalah 20 ml sehingga lebihnya akan
otomatis terbuang karena dianggap impuritis
Proses
yang
dilakukan
pertama
kali
ialah
menghidupkan alat UHPLC dan juga komputer, setelah
semua hidup dilanjutkan dengan menjalankan aplikasi
pengontrol UHPLC yang bernama chromeleon, selanjutnya
membuat squence, membuat program dan membuat
method file HPLC
Setelah menyuntikkan sample ke kolom, alat UHPLC
akan otomatis menganalisis sample yang dapat dilihat di
komputer, sample yang dianalisis ialah sample yang
penaikan dan turunnya sama, atau bisa disebut
membentuk segitiga sama kaki, hal itu merupakan kurva
integrasi dan di buat garis lurus yang disebut kurva
gravitasi.
Pada kurva integrasi didapat hasil mAu Height =
132,044, mAu area minimum = 17,264 , Relative area =
100 % , ppm = 15,00 , type-nya BMB. Slope pada kurva
kalibrasi = 1,1509

6. Kesimpulan
Dari analisa dapat disimpulkan bahwa :
Analisis KCKT menggunakan prinsip adsorbsi
Caffein yang dilebihkan dimaksudkan agar tidak
terjadinya
kekurangan
sample
yang
akan
mengganggu analisis
Pada analisis, didapat 2 kurva yakni kurva integrasi
dan kurva kalibrasi
Kurva integrasi didapatkan hasil
a. mAu height
= 132,044
b. mAu Area/min = 17,264
c. ppm
= 15,00
d. type
= BMB
slope pada Kurva kalibrasi =1,1509
7.

Daftar Pustaka