LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM FARMAKOTERAPI

PENYAKIT INFEKSI
(PEWARNAAN GRAM)

NAMA

: DESAK MADE DIAH DWI LESTARI

NPM

: 260110140003

HARI/TANGGAL PRAKTIKUM

: SENIN, 21 SEPTEMBER 2015

ASISTEN

: 1. ACHMAD JUNAIDI
2. INDAH UTAMI PUTRI

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2015

PEWARNAAN GRAM
I.

Tujuan
1.1. Mengamati dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif,
dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram
1.2. Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam
prosedur tersebut.

II.

Prinsip
2.1. Teknik Pewarnaan Diferensial
Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba
atau bagian-bagian sel mikroba
(Pelczar dan Chan, 1993).
2.2. Teknik Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar gram positif dan
gram negatif berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri
(Karman, 2008).
2.3. Zat Warna
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif , salah
satu diantaranya berwarna
(Volk & Wheeler,1993)

III.

Teori Dasar
Bakteri (bakterion = binatang kecil) merupakan organisme yang hidup di
tanah, air, udara, makanan, minuman, tubuh tumbuhan, hewan dan manusia.
Struktur tubuh bakteri terdiri atas bagian luar, yaitu kapsul, dinding sel, dan
membran plasma ; dan bagian dalam, yaitu DNA, mesosom, ribosom, dan
plasmid. Berdasarkan bentuknya, bakteri dapat dibagi menjadi 3 macam, yaitu
Bacilus, berbentuk batang ; Coccus, berbentuk bola ; dan Spirilum, berbentuk
bengkok atau seperti spiral sedangkan berdasarkan cara mendapatkan makanan,
bakteri dapat dibedakan menjadi bakteri heterotrof dan bakteri autotrof. Bakteri
heterotrof adalah bakteri yang bersifat parasit dan saprofit. Sedangkan bakteri
autotrof adalah bakteri yang dapat mensintesis makanannya sendiri dari zat-zat
anorganik. Adapun ciri-ciri bakteri secara umum adalah :

1. Merupakan mikroorganisme bersel satu (uniseluler)

2. Umumnya berukuran antara 1-5 mikron
3. Tergolong prokariotik
4. Bentuk sel tetap. Karena memiliki dinding sel
5. Umumnya berkembangbiak secara vegetatif dengan membelah diri
6. Umumnya tidak memiliki klorofil
(Saktiyono, 2006).
Sebagian besar mikroorganisme tidak berwarna, maka untuk dapat melakukan
pengamatan di bawah mikroskop cahaya diperlukan pewarnaan mikroorganisme
dengan menggunakan pewarna. Pewarna (stain) merupakan garam-garam yang
tersusun atas ion positif dan negatif, yang salah satunya berwarna dan disebut
kromofor. Bila kromofor berada pada ion positif disebut sebagai pewarna basa
(basic dye) dan bila kromofor berada pada ion negatif disebut sebagai pewarna
asam (acidic dye).
Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple
stain), pewarnaan diferensial (differential stain), dan pewarnaan khusus (special
stain). Pewarnaan sederhana hanya digunakan untuk satu macam pewarna dan
bertujuan mewarnai seluruh sel bakteri. Pewarnaan khusus digunakan untuk
mewarnai dan mengisolasi bagian spesifik dari mikroorganisme, misalnya
endospora, kapsul dan flagela. Sedangkan pewarnaan diferensial menggunakan
lebih dari satu pewarna dan memilik reaksi yang berbeda untuk setiap bakteri.
Pewarna diferensial yang sering digunakan adalah pewarnaan Gram, yang
diciptakan oleh Hans Christian Gram. Pewarnan gram ini mampu membedakan
dua kelompok besar bakteri, yaitu Gram Positif dan Gram negatif. Dinding sel
bakteri Gram positif mengandung banyak lapisan peptidoglikan (murein) yang
membentuk struktur yang tebal dan kaku, dan asam teikoat yang mengandung
alkohol. Ada dua macam asam teikoat, yaitu asam lipoteikoat yang merentang di
lapisan peptidoglikan dan terikat pada membran plasma, dan asam teikoat dinding
yang terikat pada lapisan peptidoglikan. Dinding sel bakteri Gram negatif
mengandung satu atau beberapa lapisan peptidoglikan dan membran luar. Dinding
sel bakteri Gram negatif tidak mengandung asan teikoat

(Pratiwi, 2008).

Salah satu contoh bakteri Gram positif adalah bakteri Staphylococcus aureus.
Staphylococcus aureus bersifat non-motil, nonspora, anaerob fakultatif, katalase
positif dan oksidase negatif. Staphylococcus aureus tumbuh pada suhu 6,5-46 C
dan pada pH 4,2-9,3. Koloni tumbuh dalam waktu 24 jam dengan diameter
mencapai 4 mm. Koloni pada perbenihan padat berbentuk bundar, halus,
menonjol dan berkilau. Staphylococcus aureus membentuk koloni berwarna abuabu sampai kuning emas tua. Staphylococcus mengandung polisakarida dan
protein yang bersifat antigenik dan merupakan substansi penting di dalam struktur
dinding sel. Peptidoglikan merupakan suatu polimer polisakarida yang
mengandung subunit-subunit yang tergabung, merupakan eksoskeleton yang kaku
pada dinding sel. Staphylococcus aureus menghasilkan tujuh tipe enterotoksin,
yaitu: A, B, C, C1, C2, D dan E

(Dewi, 2013).

Sedangkan salah satu contoh dari bakteri Gram negatif adalah bakteri
Escherichia coli. Escherichia coli termasuk kelompok bakteri berbentuk batang
aerob fakultatif gram negatif dengan tebal 0,5 m, panjang antara 1,0 - 3,0 m,
berbentuk seperti filamen yang panjang, tidak berbentuk spora, bersifat Gram
negatif. Escherichia coli merupakan salah satu kelompok bakteri yang dihindari
kehadirannya dalam manusia. Bakteri E.coli yang bersifat patogen yaitu Bakteri
Escherichia coli O157:H7. Manusia yang terpapar oleh kuman E.coli O157:H7
disebabkan oleh kontak langsung dengan hewan infektif atau akibat
mengkonsumsi makanan seperti ikan, udang, daging, buah, sayur, air yang telah
terkontaminasi serta susu yang belum dipasteurisasi. Escherichia coli O157: H7
adalah strain enterohemorrhagic (penyebab diare dan colitis/pendarahan pada
kolon) dari bakteri Escherichia coli EHEC) yang bersifat patogen pada manusia
dapat menimbulkan Haemorrhagic Colitis yang ditandai dengan diare berdarah
dan Haemolytic Uraemic Syndrome (HUS) yaitu infeksi pada saluran kencing.
MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) adalah salah satu tipe
bakteri Staphylococcus yang ditemukan pada kulit dan hidung yang kebal
terhadap antibiotik. Saat ini diketahui ada dua tipe dari MRSA seperti yang yaitu

Healthcare-Associated MRSA/HA-MRSA yang biasanya ditemukan di rumah

sakit dan tempat-tempat kesehatan lainnya serta Community-Associated
MRSA/CAMRSA yang baru-baru ini ditemukan penyebarannya pada tempattempat umum seperti tempat fitnes, tempat penyimpanan barang (loker), sekolah
dan perabotan rumah tangga

(Anggraini, 2013).

Pengecatan atau pewarnaan Gram dengan preparat olesan bakteri difiksasi

pada pembakar spirtus. Kemudian diteteskan larutan kristal violet sebanyak 2-3
tetes selama 2 menit. Dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengan tissu. Lalu
diteteskan larutan lugol dan dibiarkan selama 20-30 detik. Kemudian dicuci
dengan air mengalir, dikeringkan dengan tissu. Setelah itu ditetesi dengan larutan
alkohol 96% dan dibiarkan selama 30 detik. Dicuci dengan air mengalir dan
dikeringkan dengan tissu. Diteteskan dengan larutan safranin, dibiarkan selama 2
menit lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan tissu. Selanjutnya
diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x menggunakan minyak
imersi.
IV.

Alat, Bahan dan gambar Alat

4.1. Alat
Bak pewarna
Botol semprot
Kaca objek
Kapas
Kertas saring
Mikroskop majemuk
Ose
Pembakar spiritus
4.2. Bahan
Air suling
Air fuksin
Alkohol 95%, 70%
Lugol
Suspensi campuran bakteri E. coli dan S. aureus
Zat warna karbol gentian violet

(Sartika, 2011).

4.3. Gambar Alat

Bak pewarna

Kapas

Ose
VI.

Botol semprot
semprotsemprot

Kertas saring

Kaca objek

Mikroskop majemuk

Pembakar spiritus

Prosedur
Kaca obyek yang bersih disiapkan dan dibuat olesan dari masing-masing
campuran bakteri. Preparat olesan bakteri difiksasi pada pembakar spiritus
Pertama kaca-kaca obyek diletakkan di atas rak kawat di atas bak pewarna.
Olesan bakteri digenangi dengan pewarna karbol gentian violet selama 1 menit,
zat warna yang berlebih dibuang lalu dibilas dengan air suling. Kedua olesan
bakteri digenangi dengan lugol selama 2 menit, lugol yang berlebih dibuang dan
dibilas dengan air suling. Selanjutnya olesan dicuci dengan alkohol 95% tetes

demi tetes selama 30 detik atau sampai zat warna larut lalu dibilas dengan air
suling. Setelah itu olesan bakteri digenangi dengan pewarna tandlingan air fuksin
selama 30 detik, warna yang berlebih dibuang dan dibilas dengan air suling lalu
dikeringkan dengan kertas saring. Diteteskan dengan minyak emersi pada
preparat, lalu diperiksa dibawah mikroskop, dimulai dengan obyektif berkekuatan
terendah 10 X lalu diganti dengan lensa obyekif berkekuatan 100 X. diamati dan
gambar hasilnya. Bakteri Gram positif akan berwarna ungu dan bakteri Gram
negatif akan berwarna merah.
VII.

Data Pengamatan
Identifikasi Suspensi Bakteri Campuran
Escherichia coli dan Staphylococcus aureus
Perbesaran : 100 x / 1,25
Reagen :
Carbol gentian violet (CGV)
Lugol
Alkohol
Air fuksin
Minyak emersi

Bakteri Gram negatif (merah)

Escherichia coli. bentuk : batang

Bakteri Gram positif (ungu)

Staphylococcus aureus
Bentuk : coccus

VIII. Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan pengecatan atau pewarnaan pada campuran
bakteri untuk mengidentifikasi bakteri dengan menggunakan metode pewarnaan
Gram. Dimana pada pewarnaan gram ini bakteri dibedakan menjadi dua yaitu
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Tujuan dari pewarnaan gram ini
adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas
ukuran bakteri dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar bakteri seperti
dinding sel, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri
dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan
sekitarnya. Olesan campuran bakteri yang digunakan pada praktikum ini adalah
preparat suspensi bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Pada
pewarnaan gram digunakan lebih dari satu zat warna. Reagen yang digunakan
dalam pewarnaan gram antara lain carbol gentian violet, lugol, alkohol, air
fuksin dan minyak emersi. Dan untuk mengamatinya digunakan mikroskop
elektron, sehinga dapat terlihat orfologi dari bakteri
Hal yang pertama dilakukan adalah membersihkan kaca obyek dengan
menggunakan alkohol untk tujuan sterilisasi. Sterilisasi adalah suatu proses
membunuh segala bentuk kehidupan mikroorganisme yang terdapat dalam
sampel. Pada saat membersihkan kaca obyek digunakan kapas untuk
membersihkan debu dari permukaan kaca dan diusahakan agar tidak sampai
merusak lapisan kaca. Membersihkan kaca obyek dengan alkohol juga
bermanfaat untuk menghilangkan atau menghindari adanya lemak pada kaca
obyek, yang dapat mengganggu hasil dari praktikum
(Gabriel, 1988).
Setelah itu adalah pembuatan preparat olesan dari campuran bakteri yang
telah berbentuk suspensi. Namun sebelumnya, ose harus distrelisasi. Ose
digunakan untuk meletakkan olesan campuran bakteri pada kaca obyek. Dan
cara mensterilisasinya yaitu dengan cara memijarkan ose pada pembakar

bunsen. Setelah kawat ose mulai bersinar, ose ditarik dari pembakar bunsen
secara hati-hati dan dibiarkan dingin tanpa membiarkan bagian steril dari ose
menyentuh permukaan apapun. Setelah ose dingin, ose digunakan untuk
membuat olesan campuran bakteri pada kaca obyek
(Norris, 1971).
Kaca obyek yang telah diolesi dengan olesan campuran bakteri difiksasi.
Proses fiksasi secara relatif menjadi penting dalam bakteriologi semenjak
adanya metode pewarnaan pada bakteri. Prosedur fiksasi berfungsi untuk
melekatkan sel bakteri di permukaan kaca obyek dan sel bakteri akan dapat
mempertahankan struktur selnya. Fiksasi dilakukan dengan cara melewatkan
preparat di atas nyala api pada pembakar bunsen sebanyak 3-4 kali
(Estridge,2008).
Pada pewarnaan Gram ini, bakteri yang telah difiksasi dengan panas sampai
dan telah membentuk noda pada kaca obyek diwarnai dengan zat pewarna
pertama yaitu carbol gentian violet (CGV). Carbon gentian violet merupakan
pewarna basa dan warna ungunya mewarna seluruh sel bakteri, maka pewarna
ini disebut dengan pewarna primer (primary stain), didiamkan diatas bak
pewarna selama 1 menit. Zat pewarna yang berlebih dibuang dan dibilas dengan
air suling. Pembilasan dengan air tidak boleh terlalu besar atau kuat alirannya
supaya bakteri dan zat warna tidak terhapus pada kaca obyek. Selanjutnya
preparat olesan bakteri ditetesi dengan lugol yang merupakan mordant
(penajam) untuk melekatkan zat warna pada bakteri dan akan membentuk
kompleks lugol-violet. Baik bakteri Gram positif ataupun Gram negatif setelah
diwarnai dengan lugol akan berwarna ungu. Setelah lugol dibilas dengan air
suling, dilakukan pemucatan dengan menggunakan alkohol 95 % dan didiamkan
selama 30 detik. Alkohol merupakan decolorixing agent (senyawa peluntur
warna) yang pada spesies bakteri dapat menghilangkan warna ungu dari sel.
Setelah alkohol dicuci dengan air suling, preparat olesan bakteri ditetesi
kembali dengan zat warna yaitu air fuksin. Didiamkan selama 30 detik. Air
fuksin merupakan pewarna basa yang berwarna merah. Setelah itu pewarna air

fuksin yang berlebi dibuang dan dibilas dengan air suling. Lalu dikeringkan
dengan menggunakan kertas saring
Preparat olesan bakteri ditetesi dengan minyak emersi. Fungsi dari minyak
emersi yaitu untuk mengurangi sudut bias dan untuk menambah fokus pada
pembesaran maksimum pada mikroskop. Seelah itu dilaukan pengamatan pada
mikroskop mulai dari perbesaran terendah samapi perbesaran tertinggi.
Pengamatan pada praktikum ini sel bakteri dapat teramati pada perbesaran
100 x. bakteri yang tetap berwara ungu digolongkan ke dalam bakteri Gram
positif, sedangkan bakteri yang berwarna merah digolongkan ke dalam bakteri
Gram negatif. Bakteri yang berwarna ungu (Gram positif) adalah bakteri bakteri
Staphylococcus aureus berbentuk bulat atau coccus. Bakteri Staphylococcus
merupakan bakteri yang sering ditemui pada saluran pernapasan manusia dan
pada kulit. Sedangkan bakteri yang berwarna merah (Gram negatif) adalah
bakteri Escherichia coli yang berbentuk batang. Escherichia coli merupakan
bakteri yang hidup dalam jumlah besar pada usus manusia dan hewan untuk
membantu sistem pencernaan. Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan
Gram negatif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding sel
bakteri. Dinding sel pada bakteri Gram positif banyak mengandung
peptidoglikan sedangkan dinding sel bakteri Gram negatif banyak mengandung
lipopolisakarida. Kompleks violet-lugol yang masuk ke dalam sel bakteri Gram
positif tidak dapat tercuci oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan
yang kokoh pada dinding selnya. Sehingga dinding sel pada bakteri Gram
positif akan terdehidrasi pada saat pemucatan dengan alkohol dan daya rembes
dinding sel menurun, yang mengakibatkan zat pewarna air fuksin tidak dapat
masuk dan sel bakteri tetap berwarna ungu. Sedangkan pada bakteri Gram
negatif, alkohol akan merusak lapisan lipopolisakarida, kompleks violet-lugol
pada bakteri Gram negatif dapat tercuci dan menyebabkan sel nakteri tampak
transparan, yang kan berwarna merah setelah diberi zat warna yaitu air fuksin
(Pratiwi, 2008).

Adapun hal-hal yang dapat mempengaruhi hasil dari pewarnaan gram antara
lain:
1. Umur dari bakteri
Semakin lama umur bakteri, maka sel bakteri akan semakin membelah
2. Fiksasi
Fiksasi yang dilakukan terlalu lama, dinding sel bakteri akan pecah dan
bakteri Gram positif akan melepaskan warna warna primer atau warna
pertama.
3. Penambahan alkohol
Alkohol yang digunakan untuk pemucatan harus relevan. Apabila
berlebihan akan mengganggu pengamatan
4. Pembilasan
Apabila pembilasan pada zat warna dengan menggunakan air suling
dilakukan terlalu keras, maka zat warna akan lepas dari sel bakteri
(Dwijoseputro, 1981).
IX. Simpulan
9.1. Dua kelompok bakteri yaitu Bakteri Gram positif dan Gram negatif dapat
diamati dengan menggunakan metode pewarnaan Gram dan diamati bentuk
selnya dengan menggunakan mikroskop. Bentuk dari bakteri Gram positif
yaitu berbentuk bulat atau coccus. Bakterinya adalah Staphylococcus aureus.
Sedangkan bentuk bakteri Gram negatif yaitu berbentuk batang. Bakterinya
adalah Escherichia coli
9.2. Prosedur di setiap langkah dapat dipahami dan reaksi yang terjadi setelah
dilakukan pewarnaan Gram dapat diidentifikasi. Dimana bakteri Gram positif
akan tetap berwarna ungu sedangkan bakteri Gram negatif akan berwarna
merah

Daftar Pustaka

Anggraini, Rina. 2013. Uji Bakteri Escherichia coli yang Resisten terhadap
Antibiotik. Unand. Volume 2, Edisi 2. http://jurnalsainunand.com/FilesJurnal/9634877914-Rina%20Anggraini.pdf
Dewi, Krishna. 2013. Isolasi, Identifikasi dan Uji Sensitivitas Staphylococcus
aureus. Universitas Gadjah Mada.
www.jurnaltlm.com/index.php/jtlm/article/download/32/19
Dwijoseputro. 1981. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan: Surabaya.
Estridge, Barbara H. 2008. Basic Clinical Labolatory Techniques. New York :
Cengage Learning
Gabriel, J.F. 1998. Fisika Kedokteran. Jakarta : Buku Kedokteran EGC
Karman, Oman. 2008. Biologi Untuk Kelas X Sekolah Menengah Atas.
Bandung : Grafindo Media Pratama
Norris, J.R. 1971. Methods in Microbiology. London : Academic Press
Pelczar, M.J, dan Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. New York :
Mc Graw Hill Book
Pratiwi, Sylvia. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga
Saktiyono. 2006. Seribu Pena. Jakarta : Erlangga
Sartika. 2011. Isolasi Staphylococcus aureus dari Mukosa Hidung Perokok
dan Bukan Perokok pada Buruh Makassar Seta Penentuan
Staphylococcus aureus Resisten Methicillin. Unhas.
http://repository.unhas.ac.id/bitstream/handle/123456789/4007/PUBLIK
ASI%20ARTIKEL%20%28SARTIKA%20G.P.%29.pdf?sequence=1
Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Erlangga