Anda di halaman 1dari 8

Pendahuluan

Sulit untuk menjelaskan secara luas dampak dari PCR. PCR, metode cepat
dan mudah untuk mengenerasikan copy fragmen DNA yang tidak terbatas
jumlahnya, adalah salah satu ilmiah. PCR yang baru saja ditemukan dapat
mengubah kehidupan ilmu science secara nyata. Dari praktek-praktek sehari-hari
tentang diagnosis medis hingga teori, PCR mampu menganalisis sejumlah kecil
materi genetic, bahkan materi genetic yang rusak menjadi suatu level yang lebih
detail/teliti dan suatu realita. PCR adalah teknologi ilmiah yang paling penting yang
ada setelah sekian ratus tahun lamanya dan ilmu science telah mengakui nya
karena PCR jauh lebih simple dan lebih murah dari teknik-teknik sebelumnya yang
pernah ada dalam menduplikasikan DNA, PCR telah mendemotrasikan panelitian
genetic, digunakan semua ahli biologi dan tentunya di bidang biologi molekuler.
Fakta ilmiah mengatkan bahwa PCR sangat berguna karena materi genetic
tinggal disetiap sekuens-sekuens baik pada tumbuhan maupun pada hewan, bakteri
atau virus dalam bangunan nukleotidanya(umumnya DNA atau RNA) yang memang
unik dan spesifik di setiap individu yang berbeda. Variasi unik ini membuatnya
dapat kembali ke materi genetic asalnya, mengidentifikasi dengan presisi paling
tidak dari mana organisme spesies ini datang dan bagian partikuler dari spesies
tersebut.
Dalam melakukan Investigasi bagaimanapun juga dengan mempelajari DNA
yang ada semua bias untuk dianalisis. PCR mengeploitasi fungsi alami yang dapat
dikenali dari enzim yang dikenal dengan polymerase. Enzim-enzim ini berada di
semua makhluk hidup dan tugas mereka adalah mengkopy materi genetic dan juga
proffread, serta mengkoreksi copy-copy. Kadang-kadang dikenal juga fotocopy
molekuler, PCR dapat mengenal karakter atau karakteristik, menganalisis dan
mensintesis DNA/RNA spesifik. PCR berkerja atau melakukan mixtures yang sangat
sulit, mencari tahu, mengidentifikasikan, dan menduplikasikan materi genetic
particular dari darah rambut atau jaringan specimen dari mikroba,hewan,tumbuhan,
beberapa dari mereka ribuan atau jutaan tahun lamanya.
Polymerase Chain Reaction (PCR juga bias diartikan sebagai suatu metode
untuk memperbanyak suatu potongan sekuens secara in vitro. Proses PCR
ditemukan oleh Kary Mullis pada April 1983 yang saat itu bekerja pada Cetus
Corporation. Deskripsi mengenai prosedur pemeriksaan dari metode ini untuk
pertama kali di publikasikan pada tahun 1985 dan Mullis memperoleh penghargaan
Nobel pada tahun 1993 untuk karyanya ini.
Saat pertama kali diperkenalkan, enzim yang dipakai adalah Klenow. Suatu
enzim polymerase dari E. coli. enzim ini aktif pada suhu 37oC, tetapi segera dirusak
pada suhu tinggi. Ditemukannya enzim polymerase yang berasal dari Thermus
Aquaticus, yang tidak mudah rusak pada suhu tinggi serta alat otomatis yang dapat

menaikkan suhu (Thermocycler), membuat metode PCR ini menjadi mudah


dikerjakan.
Sejak saat itu, PCR telah menjadi metode pemeriksaan dasar dan penting
untuk laboratorium riset dan analitik.
Dasar-dasar PCR telah dimanfaatkan secara luas dan telah pula diaplikasikan
untuk berbagai macam spesialistik seperti karakterisasi gen, kloning dan
ekspresinya dan juga diagnostik DNA dimana PCR dimanfaatkan untuk deteksi
organisme patogen, mengidentifikasi mutasi-mutasi yang bertanggung jawab
terhadap berbagai penyakit keturunan. Selain itu DNA fingerprinting telah
dimanfaatkan untuk keperluan dunia kedokteran dan kedokteran forensik.

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metode sintesis


enzimatis sekuens DNA spesifik menggunakan dua buah primer oligonukleotida
target yang menghibridisasi rantai yang berlawanan dari sisi DNA in vitro. Reaksi ini
terdiri atas tiga tahap yang merupakan suatu siklus berulang. PCR dimulai dengan
tahap denaturasi rantai ganda DNA target dengan pemanasan sehingga terbentuk
DNA rantai tunggal, kemudian annealing yaitu penempelan primer pada daerah
yang sesuai dan dilanjutkan dengan sintesis DNA komplementer baru oleh enzim
polymerase sehingga terbentuk kembali DNA rantai ganda. Pada setiap siklus kedua
rantai cetakan akan menghasilkan dua molekul baru, dan terus berganda sehingga
jumlah yang didapatkan akan bertambah secara deret ukur (2 n, n = jumlah siklus).
Reaksi ini memerlukan bahan DNA yang berperan sebagai cetakan DNA atau DNA
target, sepasang primer oligonukleotida sintetik, enzim DNA polimerase dengan
bufer reaksi yang sesuai, campuran deoksinukleotida-trifosfat (dNTPs) yang
diperlukan untuk pembentukan rantai DNA, dan suatu alat pemanas yang dapat
diatur kenaikan temperaturnya. Hasil akhir PCR adalah rantai ganda dengan ukuran
yang diketahui.
Reaksi tiga tahap berlangsung di dalam suatu alat yang dapat secara
otomatis mengubah-ubah suhu sesuai program PCR yang disebut Thermal Cycler
atau mesin PCR. Tahap 1 : panas mendenaturasi DNA rantai ganda dengan
kehadiran primer, empat dNTP, PCR-buffer dan Thermostable DNA polymerase.
Suhu denaturasi 93-100 oC. Tahap 2 : Penempelan primer oligonukleotida ke acuan
(template) yang telah didenaturasi dengan menurunkan suhu 37-65 oC. Tahap 3 :
Extention dari primer pada 72oC dengan Taq-Polimerase (apabila menggunakan
enzim yang lain maka suhunya pun akan lain).
Tahap ke 1 sampai 3 merupakan 1 siklus PCR. Proses ini diulangi sekurangkurangnya 20 siklus. Pada siklus terakhir waktu extention diperpanjang sampai
beberapa menit untuk menyelesaikan sintesis seluruh rantai DNA.

Metode PCR saat ini banyak digunakan untuk mendeteksi berbagai sekuans
DNA yang ada dalam jumlah kecil. Bila materi genetik yang akan dideteksi adalah
suatu RNA, maka dapat juga dilakukan pemeriksaan PCR setelah proses
pembentukan cDNA dari RNA terlebih dahulu. Metode ini dikenal dengan nama
Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR).
Untuk visualisasi produk tersebut masih terus dikembangkan teknik
pewarnaan.
Diantaranya
dengan
menggunakan
etidium
bromida
akan
memperlihatkan pita DNA dengan ukuran tertentu yang diketahui dengan bantuan
petanda berat molekul. Deteksi atau konfirmasi terhadap identitas produk PCR
dapat dilakukan dengan teknik Sounthern blot hybridization, teknik ini lebih sensitif.
Langkah pertama dari proses PCR adalah sangat sederhana, yaitu : membuat
larutan PCR mix yang terdiri atas DNA template atau DNA sample, 2 set oligo
primer yang cocok, Taq DNA Polymerase, deoxyribonucleoside triphospate (dNTP)
dan bufer. Kemudian, PCR mix ini diamplifikai berulang-ulang (biasanya 30 kali atau
lebih sesuai kebutuhan) melalui suhu yang memungkinkan untuk denaturation,
annealing dan synthesis. Produk PCR kemudian dapat divisualisasi dengan
elektroforesis gel dan diperiksa hasil dan spesifisitasnya.
Bahan dan cara pembuatannya
Bahan yang akan digunakan adalah sebagai berikut :
DNA template/sample
DNA template adalah DNA dari sample yang hendak diamplifilkasi.
Kandungan DNA yang optimum dari suatu sample utuk analisis PCR tergantung dari
kemurnian dan tujuan dari pemeriksaan. Untuk analisi gen diperlukan suatu jumlah
standar dari DNA yaitu 100-500 ng. Bila memakai primer yang dilabel, jumlah DNA
yang dibutuhkan sebagai template/acuan jauh lebih sedikit.
Taq DNA polimerase dan Buffer
Taq DNA polimerase adalah enzim yang berfungsi utuk mengkatalisasi
pemanjangan rantai DNA template/sample. Taq DNA polimerase berasal dari
Thermus Aquaticus yang tidak mudah rusak pada suhu tinggi.
Konsentrasi enzim
Rentang konsentrasi enzim taq DNA polimerase (Perkin Elmer Cetus) yang
dianjurkan adalah antar 1-2,5 unit (SA = 20 units/pmol) per reaksi 100 l. Walaupun
demikian, kebutuhan enzim disesuaikan dengan target template secara individual
atau primers.

Apabila konsentrasi enzim terlampau tinggi, maka akan terjadi produk PCR
dengan latar belakang nonspesifik (pita nonspesifik), apabila terlalu rendah, akan
diperoleh suatau jumlh produk PCR yang tidak memadahi.
Buffer
Komponen 10x buffer (stock) yang biasanya mengandung :
100 mM Tris-HCl, pH (suhu kamar)
500 mM KCl
15mM MgCl2 0,01% (w/v) gelatin
Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP)
dNTP adalah bahan dasar yang dibutuhkan untuk pemanjangan dari DNA
tersebut. dNTP yang cocok untuk PCR adalah suatu campuran yang terdiri atas
dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP dengan konsentrasi yang seimbang dari keempat NTP
tersebut. Hal ini perlu dilakukan untuk menghindari terjadinya kesalahan/kekeliruan
penempelan pada DNA template (misincorporation errors).
Penggunaan konsentrasi dNTP yang rendah dapat meningkatkan spesifikasi
dan kemurnian (fidelity) dari PCR dengan mengurangi mispriming pada non target
site dan kemiripan dari nukleotida yang salah cetak pada proses pemanjangan.
Konsetrasi dNTP antara 20-200 nM membuahkan hasil pemeriksaan dengan
spesifitas dan kemurniahn yang optimal.
Konsentrasi Magnesium
Salah satu hal yang sangat penting untuk diperhatikan adalah konsentrasi
magnesium. Konsentrasi Mg dapat mempengaruhi primer annealing, disosiasi ruang
DNA sample. Produk PCR dan spesifitas produk, formasi dari artefak dan aktivitas
enzim serta kemurniannya. Mg mempengaruhi aktivitas enzim Taq DNA polimerase.
Untuk mendapatkan hasil pemeriksaan yang optimal konsentrasi Mg yang
diperlukan adalah sekitar 0,5 mM - 5 mM.
Primers
Untuk keperluan PCR pada umumnya, primers didesain secra tepat dan
bersifat komplementer terhadap DNA template, desain dari oligonukleotida
dilakukan menggunakan auan yang sederhana meskipun banyak program komputer
telah banyak membantu desain primer. Secara umum primers yang digunkan untuk
PCR memilki panjang sekitar 20-30 nukleotida. Primer sepanjang ini memungkinkan
penggunaan suhu annealing yang tinggi.

Primers yang lebih panjang dari 30 nukleotida tidak meningkatkan spesifitas.


Primer hendaknya didesain secara seimbang dalam jumlah dari keempat basa
tersebut. Dalam hal ini terutama harus diperhatikan kandungan GC (40-60%),
karena semakin bnyak persentase kandungan Gcnya maka semakin stabil primer
yang didesain. Selain itu perlu pula diperhatikan status homologinya serta
kesesuaian suhu annealing dari sepasang primer tersebut.
Secara umum, konsentarsi primer antara 0,1-0,5 M adalah optimal.
Konsentrasi primer yang tinggi dapat menyebabkan mispriming dan akumulasi dari
produk yang nonspesifik dan dapat meningkatkan kemungkinan pembentukn suatu
artefak yang template-independent yaitu suatu primer-dimer.
Produk PCR yang nonspesifik dan artefak prime-dimer pada diriya merupakan
substrat untuk PCR dan berkompetisi dengan produk yang dinginkan untuk enzim,
dNTP, dan primer, hal ini mengakibatkan produk PCR sedikit.
Bagaimana PCR digunakan
Human health and genom project
PCR secar cepat menjadi alat yang esensial untuk meningkatkan kesehatan
manusia dan nyawa manusia. Peneliti medis dan obat klinis banyak mendapat
keuntungan dari PCR di dua area : deteksi infeksi penyakit akibat organism,
mendeteksi variasi dan deteksi gen ,khususnya pada gen manusia. Karena PCR
dapat mengamplifikasi jumalah DNA yang tidak terbayangkan kecil ukurannya,
bahkan yang hanya dari sel, ahli fisika dan peneliti dapat memeriksa sebuah
sperma atau menyelesaikan persoalan sumber elusive dari infeksi yang masih
dipertanyakan. PCR yang berbasis analisis berkembang menjadi semakin dipercaya
sebagai metode umum atau kadang-kadang lebih cepat atau lebih murah. Metode
ini berguna khususnya untuk mencari tahu organisme penyakit yang sulit atau
bahkan tidak mungkin untuk dikultur, seperti pada kebanyakan bakteri, jamur dan
virus karena metode ini dapat menghasilkan kuantitas yang dapat dianalisis dari
materi genetik organism digunakan untuk mengidentifikasi. Berguna untuk
mendeteksi virus AIDS sesegera mungkin selama minggu pertama. Sesudah infeksi,
dibandingkan tes standard ELISA. PCR memperlihatkan DNA unik dari virus,
dikarenakan dari metode yg dikerjakan oleh tes standard, yg memperlihatkan
evidensi secara tak langsung bahwa virus yg ada sekarang, mencari antibody yg
dibuat tubuh untuk melawan dirinya.
PCR memberikan hasil yg lebih akurat dari tes standard. Yang terlihat dari
perbedaan keakuratannya, seperti contohnya dalam infeksi kuping tengah yang
dikenal dengan otitis media. Teknik ini dapat mendeteksi bahwa DNA bakteri yang
ada dicairan kuping tengah member sinyal berupa infeksi aktif, lalu metode kultur
gagal untuk mendeteksi hal ini. Penyakit Lyme berupa peradangan sendi yang
menyakitkan yang disebabkan oleh bakteri yang ditramisikan menuju /menjadi
giigitan per detik, yang biasanya berupa diagnose dasar dari motif gejala. Tapi PCR

dapat menghilangkan dari penyakit DNA organisme yang terkandung dalam cairan
sendi , dengan menghasilkan pengobatan yang cepat dan yang dapat mencegah
komplikasi serius.PCR adalah tes yang paling spesifik dan sensitive untuk
helicobacter pylori, jadi organisme penyebab penyakit sekarang diketahui dapat
menyebabkan ulkus dilambung. Tak seperti pada tes sebelumnya, PCR dapat
mendeteksi 3 organisme transmisi penyebab penyakit kelamin dalam satu
proses(herpes,papiloma virus,clamydia) dan dapat menghilangkan rantai partikel
dari papiloma virus yang berpotensi untuk menjadi kanker, dimana tes lain belum
dapat melakukannya (hanya PCR yang bisa)
Terdapat lebih dari 60 PCR protocol untuk identifikasi pathogen yg telah
dijelaskan dalam peta dan sekurang kurangnya 10 produk klinik telah berguna
untuk deteksi organisme yg menyebabkan penyakit TBC, AIDS, clamydia, dll .
karena PCR dapat dengan mudah menghilangkan variasi kecil diantara DNA yg
sebagian dan unik. Metode ini juga memimpin menuju ke model baru dari tes.
Diagnose tes ini tak hanya orang dengan kelainan yang tak diturunkan tetapi juga
orang yg membawa variasi yang dapat dihapus, diketahui sebagai mutasi. Proses ini
juga berupa solusi dari kejanggalan diantara mutasi yg berbeda dalam sel tunggal,
yang dapat menyebabkan kelainan berupa duschenne distrofi otot. Cara ini
membantu dokter untuk memberikan diagnose.
PCR bahkan dapat mendiagnosa penyakit yang telah lalu. Hubert H Humprey
menjalani tes untuk kanker pencernaan (tahun 1967). Sedangkan hasil tes
menghasilkan hasil negative, namun dia mati karena penyakit ini. Tahun 1994
penelitain digabungkan 1976 sampel jaringan dari jaringan kankernya dan dengan
sampel urinnya sebanyak 1967. Dengan bantuan amplifikasi PCR dari jumlah kecil
dari DNA urin yang berumur 27 urin yang berumur 27 tahun, ditemukan mutasi
identik di gen p53.
Banyak dari tes genetik baru berasal dari Human Genome Project, yang
adalah usaha besar untuk identifikasi dan mempelajari semua gen manusia.
Sekuensi DNA mengungkapkan variasi dalam nukleotida yang gen utama.
Perubahan mutasi ini menghasilkan penyakit dan bahkan kematian dengan
memaksa gen untuk prosuksi protein abnormal atau terkadang bukan protein sama
sekali. Sekuens DNA terdiri dari isolasi dan duplikasi segamen DNA untuk analisis
nukleotida. Dengan demikian PCR adalah alat essensial untuk Human Genome
Project karena PCR dapat dengan cepat dan mudah untuk menghasilkan jumlah tak
terbatas dari potongan potongan DNA.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------PCR membantu dalam menemukan seseorang yang hilang dari kelompoknya.
Dari penelitian 8 tahun di florida ditemukan indikasi bahwa orang orang yang
tinggal disana ada perbedaan gentik dari orang Amerika asli

Arkeolog dengan PCR dapat menemukan tentang kebudayaan manusia dan


kehidupan biologi manusia. Menganalisis pigmen dari batu berumur 4000 tahun,
dilakukan di Texas. Mereka menemukan salah satu komponen untuk membuat DNA,
yang kemungkinan dari bison. Hewan hewan itu tidak tinggal dekat Pecos River
waktu itu. PCR dapat berguna mengkopi DNA yang berusia ribuan tahun atau jutaan
tahun.
System modern, pembelajaran ekologi, perilaku hewan
Tetapi DNA tak dibutuhkan dahulu untuk menyediakan informasi tentang
hubungan evolusi. Dengan system PCR dapat mengukur perbedaan dalam sekuens
DNA diantara sepisies secara langsung dan jika mereka memilih sekuen itu telah
diubah sedikit selama evolusi, antara kelas mayor dari organisme. Kecepatan dan
kelangsungan dari proses ini berarti ilmuwan dapat dengan mudah membandingkan
sejumlah atau beratus - ratus dari individu dalam menempatkan kesimpulan mereka
kesebuah firmer basis. Dengan PCR ilmuwan dapat memperoleh informasi genetic
dari jejak, feses, dll yang susah dipahami. Selain itu juga membantu
mengklasifikasikan informasi. Seseorang dapat diidentifikasi untuk memperkirakan
besarnya populasi dilokasi tertentu atau membedakan ukuran geografi seekor
hewan tunggal dalam kelompoknya.
Tehnik itu dapat adaptasikan untuk pembelajaran sama dari tanaman, untuk
analisis pola penyebaran dan keberhasilan produksi dari tanaman tertentu. PCR
memiliki harga rendah dan merupakan suatu portable teknologi.
Masa depan PCR
Teknologi sekarang dalam melakukan PCR, yang mana berhubungan dengan
ukuran oven microwave dan menghabiskan dana ribuan dolar terlihat menjadi
sebuah improvisasi radikal yang lebih jauh. Dengan berjualan variable seperti
reagen kimia dan PH, peneliti telah mereportasikan kesuksesan mengkopi DNA
besar dan bahkan lebih besar lagi potongan DNA, termasuk seluruh genom HIV.
Hardware miniaturasi yang ekstra ordiner juga menjadi salah satu faktornya,
seperti eksperimenter squeeze PCR menjadi suatu alat (device) dengan ukuran
seperti chip.
PCR digunakan untuk materi genetic penemuan yang dimedia cetak tulis
tentang mempermudah pengkopian materi, tak mahal dan mudah diakses. Pada
prinsipnya PCR dapat memproduksi materi genetic organism dalam kuantitas
essensial yang tidak terbatas sehingga dapat digunakan untuk menganalisis sel
sel yang mengandung material. Meskipun mereka adalah germs, tumbuhan medis
langka atau manusia, atau malah justru dapat mengetahui apapun yang terekam
dalam DNA mereka. Dengan organisme simpel, untuk mengetahui DNA mereka
akan mengetahui hampir apapun tentang mereka. Dengan yang lebih rumit seperti
manusia, DNA hanya sebagian cerita saja tapi merupakan bagian yang sangat

besar. Berterima kasih atas PCR, kita dapat mempelajari genetic baik yang lampau
maupun genetic yang baru untuk tahun tahun kedepan.