Modul 3

Analisis Kuantitatif Berdasarkan Metode MPN

1. Fungsi dari tabung durham dan gambarnya
Tabung Durham merupakan alat yang digunakan di dunia mikrobiologi
untuk mendeteksi produksi gas yang dihasilkan dari mikroorganisme.[1] Alat ini
berukuran sangat kecil, ditempatkan pada tabung reaksi yang telah berisi cairan
pertumbuhan mikroorganisme dan zat indikator yang dapat menandai terjadinya
perubahan warna karena adanya perubahan derajat keasaman dan gas yang
dihasilkan.[2] Produksi gas dicirikan dengan terdapatnya gas di ujung tabung
durham setelah mikroorganisme diinokulasi dan diinkubasi.[3] Penggunaan
tabung durham ini biasa dilakukan pada pengujian biokimia dalam identifikasi
bakteri.[4] Metode ini pertama kali ditemukan oleh seorang ahli mikrobiologi
pada tahun 1898 yang bernama Herbert Durham.[5]
Tabung durham berbentuk mirip dengan tabung reaksi namun ukurannya
lebih kecil dan berfungsi untuk menampung/menjebak gas yang terbentuk akibat
metabolisme pada bakteri yang diujikan. Penempatannya terbalik dalam tabung
reaksi dan harus terendam sempurna dalam media (jangan sampai ada sisa
udara). Pasang Tabung reaksi dan tabung durham ( posisi terbailk) digunakan
pada pengujian mikroba, fungsi tabung durham adalah sebagai indikator adanya
fermentasi. Jika tabung durham terdapat gelembung menandakan adanya
fermentasi. Alat ini biasa dipakai pada pengujian mikroba dengan metode
MPN( Most Probable Number) Pasang Tabung reaksi dan tabung durham ( posisi
terbailk) digunakan pada pengujian mikroba, fungsi tabung durham adalah
sebagai indikator adanya fermentasi. Jika tabung durham terdapat gelembung
menandakan adanya fermentasi. Alat ini biasa dipakai pada pengujian mikroba
dengan metode MPN( Most Probable Number).

2. Literatur MPN

Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan penting dilakukan

untuk mengetahui mutu bahan pangan, dan proses yang akan diterapkan pada
bahan pangan tersebut. Ada beberapa cara untuk mengukur atau menghitung
mikrobia yaitu dengan perhitungan jumlah sel, perhitungan massa sel secara
langsung, dan pendugaan massa sel secara tak langsung. Perhitungan jumlah sel
dapat dilakukan dengan 3 metode yaitu dengan hitungan mikroskopik, MPN
(Most Probable Number), dan hitungan cawan.

Berbeda dengan metode hitungan cawan di mana digunakan medium

padat, dalam metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, di
mana perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang
ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.
Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah jasad renik di dalam
contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh
berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh
tersebut. Grup jasad renik yang dapat dihitung dengan metode MPN juga
bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan (Fardiaz,
1992). Pengenceran bertujuan untuk mengurangi konsentrasi atau kekentalan
dari suatu bahan agar setelah masa inkubasi koloni mikroba yang tumbuh
jumlahnya dapat dihitung dengan mudah (Dwidjoseputro, 1993).

Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan. Umumnya
media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan bakteri
tertentu.Contohnya seperti.
1. BLBG (Briliant Green Lactosa Broth)
Mengandung laktosa dan garam empedu (bile salt) yang hanya membolehkan coliform untuk
tumbuh.
2. Media ECB (Esherichia Coli Broth)
Untuk menghitung E Coli
Menurut Fardiaz (1992), dalam metode MPN, pengenceran harus dilakukan lebih tinggi
daripada pengenceran dalam hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium
cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung satu sel
jasad renik, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari satu sel, sedangkan tabung
lainnya tidak mengandung sel. Dengan demikian, setelah inkubasi diharapkan terjadi
pertumbuhan pada beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positif, sedangkan
tabung lainnya negatif. Untuk setiap pengenceran pada umumnya digunakan tiga atau lima
seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi,
tetapi alat yang digunakan juga lebih banyak. Nilai MPN dapat dihitung sebagai berikut:
MPN contoh = Nilai MPN dari tabel x 1/pengenceran tabung tengah
MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan
data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung
yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau
diencerkan

menurut

tingkat

seri

tabungnya

sehingga

dihasilkan

kisaran

jumlah

mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel.
Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu
sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam
tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif kadang-kadang tetapi tidak

selalu. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang
dilakukan) maka semakin sering tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel
yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang
tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang
menghasilkan tabung positif kadang-kadang tetapi tidak selalu. Semua tabung positif yang
dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat
memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi
metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi
mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan.

Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah jasad renik tertentu yang
terdapat di antara campuran jasad renik lainnya. Sebagai contoh, jika digunakan Lactose
Broth maka adanya bakteri yang dapat memfermentasi laktosa ditunjukkan dengan
terbentuknya gas di dalam tabung durham. Cara ini biasa digunakan untuk menentukan MPN
koliform terhadap air atau minuman karena bakteri koliform termasuk bakteri yang dapat
memfermentasi laktosa (Fardiaz, 1992).
Pengamatan tabung positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan dan
terbentuknya gas di dalam tabung durham (untuk mikroorganisme pembentuk gas)
(Sukarminah dkk, 2010). Berdasarkan pengamatan, setiap sampel dalam setiap tabung ratarata memiliki kekeruhan.
Pengamatan yang dilakukan pada inkubasi adalah mengamati perubahan warna,
kekeruhan dan pembentukan gas yang ada di dalam tabung durham, dari perubahan tersebut
kita dapat menentukan nilai MPN-nya. Kita dapat melihat adanya bakteri koliform yang
dapat ditunjukan dengan adanya gas dalam tabung durham (Pelczar dkk, 1986). Berdasarkan
literatur, adanya gelembung pada salah satu tabung seri II menunjukkan adanya bakteri
koliform. Menurut Fardiaz (1992), gelembung udara yang dihasilkan pada tabung durham
disebabkan oleh adanya aktivitas yang respirasi mikroorganisme sehingga dapat dilihat hasil
dari respirasi mikroorganisme tersebut berupa gelembung gas.
Perhitungan jumlah mikroorganisme dengan metode MPN ini memiliki keuntungan
dan kerugian. Keuntungan dari metode MPN ini adalah (Buckle dkk,1987):
1. Dapat dibuat sangat peka dengan penggunaan volume inokulum contoh yang lebih
besar dari 1,0 ml/tabung
2. Bahan-bahan dapat dipersiapkan untuk tugas lapangan
3. Media pertumbuhan selektif dapat digunakan untuk menghitung jenis mikroorganisme
yang diharapkan di antara jenis-jenis lainnya yang ada dalam bahan pangan tersebut

Kerugiannya adalah dibutuhkannya banyak ulangan untuk diperoleh hasil yang teliti dan
sehubungan dengan hal tersebut banyak biaya dan waktu yang dibutuhkan untuk
persiapannya (Buckle dkk, 1987).

Modul 6

1. Pengertian Antimikrobial/Antimikroba
Antimikroba adalah suatu substansi (zat-zat) kimia yang diperoleh dari atau di
bentuk dan di hasilkan oleh mikroorganisme dan zat-zat itu dalam jumlah yang sedikit
pun mempunyai daya penghambat kegiatan mikroorganisme yang lain. Antibiotik tersebar di alam dan
memegang peran penting dalam mengatur populasi mikroba dalam tanah, air, limbah dan kompos.
Antibiotika berbeda dalam susunan kimia dan cara kerjanya.
Secara garis besar antimikroba dibagi menjadi dua jenis yaitu yang membunuh
kuman (bakterisid) dan yang hanya menghambat pertumbuhan kuman (bakteriostatik).
Antibiotik yang termasuk golongan bakterisid antara lain penisilin, sefalosporin,
aminoglikosida (dosis besar), kotrimoksazol, rifampisin, isoniazid dan lain-lain.
Sedangkan antibiotik yang memiliki sifat bakteriostatik, dimana penggunaanya
tergantung status imunologi pasien, antara lain sulfonamida, tetrasiklin, kloramfenikol,
eritromisin, trimetropim, linkomisin, klindamisin, asam paraaminosalisilat, dan lainlain (Bennet, 1987).
Antibiotika adalah senyawa kimia khas yang dihasilkan atau diturunkan oleh
organisme hidup, termasuk struktur analognya yang dibuat secara sintetik, yang dalam
kadar rendah mampu menghambat proses penting dalam kehidupan satu spesies atau
lebih mikroorganisme. Pada awalnya antibiotika diisolasi dari mikroorganisme, tetapi
sekarang beberapa antibiotika telah didapatkan dari tanaman tinggi atau binatang
(Soekardjo, 1995).
Mekanisme daya kerja antimikroba terhadap sel dapat dibedakan atas beberapa
kelompok sebagai berikut diantaranya merusak dinding sel, mengganggu permeabiitas
sel, merusak molekul protein dan asam nukleat, menghambat aktivitas enzim,
menghambat sintesa asam nukleat. Aktivitas antimikroba yang dapat diamati secara
langsung adalah perkembangbiakannya. Oleh karena itu antimikroba dibagi menjadi
dua macam yaitu antibiotic dan disinfektan. Antibiotik adalah senyawa yang dihasilkan
oleh microorganisme tertentu yang mempunyai kemapuan menghambat pertumbuhan
bakteri atau bahkan membunuh bakteri walaupun dalam konsentrasi yang rendah.

Antibiotik digunakan untuk menghentikan aktivitas mikroba pada jaringan tubuh

makhluk hidup.

Anti mikroba mempunyai mekanisme kerja utama ada lima cara antara lain
sebagai berikut:
1. Penginaktifan enzim tertentu
Penginaktifan enzim tertentu adalah mekanisme umum dari senyawa
antiseptika dan desinfektansia, seperti turunan aldehida, amida, karbanilida,
etilen-oksida, halogen, senyawa-senyawa merkuri dan senyawa ammonium
kuarterner.
2. Denaturasi protein
Turunan alcohol, halogen, dan halogenator, senyawa merkuri, per-oksida,
turunan fenol dan senyawa ammonium kuarterner bekerja sebbagai antiseptika
dan desinfekstan dengan cara denaturasi dan konjugasi protein sel bakteri.
3. Mengubah permebilitas memmbran sitoplasma bakteri.
Cara ini adalah model kerja dari turunan amin dan guanidin, turunan fenol dan
senyawa-senyawa tersebut dapat menyebabkan bocornya konstituen sel yang
essensial, sehingga bakteri mengalami kematian.
4. Intekalasi ke dalam DNA
Beberapa zat warna seperti turunan trifenilmetan dan turunan akridin, bekerja
sebagai antibakteri dengan mengikat secara kuat asam nukleat, menghambat
sintesa DNA dan menyebabkan perubahan kerangka mutasi pada sintesis
protein.
5. Pembentukan khelat
beberapa turunan fenol, seperti heksokloroform dan oksikuinolin dapat
membentuk khelat dengan ion Fe dan Cu, kemudian bentuk khelat tersebut
masuk ke dalam sel bakteri. Kadar yang tinggi dari ion-ion logam di dalam sel
menyebabkan gangguan fungsi enzim-enzim, sehingga mikroorganismenya
mengalami kematian.
6. Bersifat sebagai antimetabolit
AM bekerja memblok tahap metabolik spesifik mikroba, seperti pada
sulfonamida dan trimetropin. Sulfonamida menghambat pertumbuhan sel
dengan menghambat sintesis asam folat oleh bakteri. Sulfonamide secara
struktur mirip dengan asam folat, para amino benzoic acid (PABA), dan bekerja

secara kompetitif untuk enzim-enzim yang langsung mempersatuakan PABA

dan sebagian pteridin menjadi asam dihidropteorat.
Trimetropin secara struktur analog pteridin yang dibagi oleh enzim dihidrofolat
reduktase dan bekerja sebagai penghambat kompetitif enzim tersebut yang
dapat mengurangi dihidrofolat menjadi tetra-hidrofolat.
7. Penghambatan terhadap sintesa dinding sel.
Antiemetika golongan ini dapat menghambat sintesis atau menghambat
aktivitas enzim yang dapat merusak dinding sel mikroorganisme. Yang
termasuk kelompok ini antara lain: penisilin, sefa losporin, vankomisin,
sikloserin, basitrain. Penisilin yang bekerja sebagai analog struktur D-alanil-Dalanin yang menempati tempat dari enzim transpeptidase yang menimbulkan
crosslink antara bagian dinding sel mikroorganisme (bakteri). Penisilin dapat
menghambat pembentukan cross-link tsb
8. Penghambatan fungsi permeabilitas membran sel.
Disini anti mikroba bekerja secara langsung pada membran sel yang
mempengaruhi permeabilitas dan menyebabkan keluarnya senyawa intraseluler
mikroorganisme (bakteri). Dalam ini antimikroba dapat: (1) berinteraksi
dengan sterol membran sitoplasma pada sel jamur seperti Amfoterisin B dan
Nistatin, (2) merusak membran sel bakteri gram negativ, misalnya polimiksin,
dan kolistin.

Modul 4
Analisis Kuantitatif Berdasarkan Standar Plate Count (Metode Hitung Cawan).