Citometra de Flujo

La citometria de flujo (CMF) es una tcnica de anlisis celular multiparametrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una
suspensin de partculas (generalmente clulas) alineadas y de una en una por delante de un haz de lser focalizado. La citometra
de flujo es una tecnologa (proceso) que permite la medida simultnea de mltiples caractersticas fsicas de una sola clula. Estas
medidas son realizadas mientras las clulas (partculas) pasan en fila, a una velocidad de 500 a 4000 clulas por segundo, a travs
del aparato de medida en una corriente de fluido.
EL CITOMETRO NECESITA UN SISTEMA COMBINADO DE:
SISTEMA HIDRAULICO: Controles neumtico y fluidos para establecer un flujo laminar que permita a la suspensin celular
atravesar la cmara de flujo.
SISTEMA OPTICO: Lser (Argn con luz monocromtica de 488nm , filtros , lentes y
SISTEMA ELECTROINFORMATICO: Convierte la luz dispersa en seales elctricas y las procesa para su anlisis.

detectores.

Sistema optico

El impacto de cada clula con el rayo de luz produce seales que corresponden a diferentes parmetros de la clula y que son
recogidos por distintos detectores.
PARAMETROS
Caractersticas
Morfolgicas
de
la
clula
Caractersticas antignicas de la clula : Inmunofenotipo.
PARAMETROS FISICOS

: tamao

complejidad

del

citoplasma

Su tamao relativo (forward scatter-FSC)

Su granularidad relativa o complejidad interna (side scatter SSC).

FLUORESCENCIA RELATIVA

Determinacin cuantitativa de caractersticas antignicas, bioqumicas y biofsicas de clulas individuales.

OBJETIVOS PRINCIPALES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Identificar y enumerar subpoblaciones celulares nicas y definidas.

Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas

Seleccionar y separar fsicamente subpoblaciones de clulas deseadas (por deflexin electrosttica; esta tecnologa de
separacin se llama "electronic cell sorting")

FLUORESCENCIA
Un fluorocromo es una molcula qumica que absorbe la luz a una determinada longitud de onda (ENERGIA) energa de
excitacin
y
emite
a
una
longitud
superior
(MENOR
ENERGIA)

Interacciona con la luz de excitacin procedente de el lser. Se utiliza unido a anticuerpos especficos (monoclonales) para
antgenos de la clula. La cantidad de fluorescencia con la cual una clula se tie es proporcional a la cantidad de sitios de unin.
Cmo se obtiene la luz fluorescente.

Unin de sitios especficos con anticuerpos marcados con fluorocromos

El fluorocromo absorbe energa del lser
El fluorocromo libera energa absorbida por :
Vibracin y disipacin del calor.
Emisin de fotones a una mayor longitud de onda llamada fluorescencia.

REACTIVOS FLUORESCENTES
Marcadores fluorescentes de unin covalente: Isoticianato de Fluoresceina, Picoeritrina, rodamina, rojo texas, cianinas.
Marcadores fluorescentes de unin no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de acrimina, yoduro de propidio, rh12.
Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente .

Pequeas molculas orgnicas (FITC, biotina): unin covalente directa con grupos amino libres en anticuerpos
Protenas fluorescentes (ficoeritrina, aloficocianina): se unen a anticuerpos a travs de algunos reactivos.

APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Hematologa : tipificacin y conteo de clulas
Farmacologa :estudios de cintica celular
Inmunologa :subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular
Oncologa :Diagnostico y pronostico ,monitores de tratamientos

Determinacin del contenido celular de DNA

Apoptosis
Fagocitosis

VENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Anlisis de un nmero estadsticamente significativo de clulas (1000 a ms de 100.000 clulas).
Mltiples marcajes de una sola clula.
Anlisis de alto nmero de partculas en corto tiempo (5.000 eventos /seg.).
Alta sensibilidad y objetividad.
Medidas separadas de cada clula (no slo el promedio).
Medidas cuantitativas: discriminacin de las clulas segn la cantidad de marcador.
Mltiples parmetros: define subpoblaciones complejas.
Miles de clulas por segundo.
DESVENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Poca informacin morfolgica de la clula

No proporciona informacin de la localizacin celular en un tejido
Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones de clulas / hora)

Necesita suspensin de clulas individuales.

Costos de la tecnologa.

Mtodo destructivo.