Anda di halaman 1dari 19

BIOTEKNOLOGI dalam

DIAGNOSIS
PENYAKIT TROPIS

Pendahuluan
Dikenal beberapa pemeriksaan untuk
diagnosis penyakit tropis yang saat ini
sudah dikembangkan
Berpotensi untuk dapat dimanfaatkan
dalam diagnosis komunitas, hanya saja
harganya masih mahal
Belum banyak laboratorium pemerintah
maupun swasta yang menyediakan

PCR
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal
sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris
polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau
metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik
tanpa menggunakan organisme.
Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah
besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan
berbagai teknik lain yang menggunakan DNA.
Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia
memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat
temuannya tersebut.
Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan
biologi molekular karena relatif murah dan hanya
memerlukan jumlah sampel yang kecil.

Prinsip kerja
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara
2030 kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut
adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:
Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini
(berlangsung pada suhu tinggi, 9496 C) ikatan hidrogen DNA
terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal.
Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama
(sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah.
Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi
templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 12 menit.
Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian
DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan
pada suhu antara 4560 C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu
yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau
primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 12
menit.

Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu


untuk proses ini tergantung dari jenis
DNA polimerase (ditunjukkan oleh P pada
gambar) yang dipakai. Dengan Taqpolimerase, proses ini biasanya dilakukan
pada suhu 76 C. Durasi tahap ini
biasanya 1 menit.

Lepas tahap 3, siklus diulang kembali


mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan
renaturasi, beberapa berkas baru
(berwarna hijau) menjadi templat bagi
primer lain. Akhirnya terdapat berkas
DNA yang panjangnya dibatasi oleh
primer yang dipakai. Jumlah DNA yang
dihasilkan berlimpah karena
penambahan terjadi secara eksponensial

Aplikasi PCR
Isolasi gen : mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome
manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli)
agar bakteri dapat memproduksi misalnya insulin sehingga
Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam
tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri,
lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara
konvensional yang harus mengambil insulin dari sapi atau babi.
DNA sequencing : polimorphism vektor
Forensik :
Diagnosis Penyakit

Blotting
adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau DNA dari
gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut mengalami
imobilisasi. Keuntungan teknik adalah ;
a. Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan lembaran
dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau matriks
b.

Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan

c.
Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll dapat lebih
singkat
d.

Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum dianalisis

e. Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak metode
analisis yang dipakai Matriks
Matriks yang biasa dipakai dapat berupa nitroselulosa (NC). Namun NC juga memiliki
kekurangan, yaitu beberapa komponen yang memiliki afinitas lemah dapat hilang selama
pemrosesan. Matriks lain yang dapat digunakan untuk menutupi kekurangannya yaitu kertas
diazobenzyloxymethyl (DBM). Ada pula kertas lain, yaitu diazophenylthioeter (DPT)

Western Blot
Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai western blot
sebagai olok-olokan terhadap teknik southern blot yang pertama kali ditemukan.

Western blot merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada sampel
jaringan yang homogenat ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan
protein tersebut berikatan dengan antibodi. Teknik ini menggunakan gel
elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida atau
berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian ditransfer ke sebuah
membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian akan
dilacak dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target.

Western blot dapat mendeteksi suatu protein dalam kombinasinya dengan sangat
banyak protein lain, dapat memberikan informasi mengenai ukuran dan ekspresi
protein tersebut.

Sekuensing DNA
Sekuensing asam nukleat atau pengurutan
asam nukleat adalah proses penentuan
urutan nukleotida pada suatu fragmen DNA
atau RNA.

Kegunaan
Sekuens DNA menyandikan informasi yang diperlukan bagi
makhluk hidup untuk melangsungkan hidup dan berkembang
biak. Dengan demikian, penentuan sekuens DNA berguna di
dalam ilmu pengetahuan 'murni' mengenai mengapa dan
bagaimana makhluk hidup dapat hidup, selain berguna dalam
penerapan praktis.
Karena DNA merupakan ciri kunci makhluk hidup, pengetahuan
akan sekuens DNA dapat berguna dalam penelitian biologi
manapun. Sebagai contoh, dalam ilmu pengobatan sekuensing
DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis,
dan mengembangkan pengobatan penyakit genetik. Demikian
pula halnya, penelitian pada agen penyebab penyakit (patogen)
dapat membuka jalan bagi pengobatan penyakit menular.
Bioteknologi, yang dapat pula memanfaatkan sekuensing DNA,
merupakan bidang yang berkembang pesat dan berpotensi
menghasilkan banyak barang dan jasa berguna.
Karena RNA dibentuk dengan transkripsi dari DNA, informasi
yang dikandung RNA juga terdapat di dalam DNA cetakannya
sehingga sekuensing DNA cetakan tersebut sudah cukup untuk
membaca informasi pada RNA. Namun demikian, sekuensing
RNA dibutuhkan khususnya pada eukariota, karena molekul
RNA eukariota tidak selalu sebanding dengan DNA cetakannya
karena pemotongan intron setelah proses transkripsi.

Metode
Pada metode terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan atau
ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan
dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebut primer yang
komplementer terhadap DNA pada daerah situs tersebut.
Primer tersebut diperpanjang menggunakan DNA polimerase, enzim
yang me replikasi DNA. Bersama dengan primer dan DNA polimerase,
diikutsertakan pula empat jenis basa deoksinukleotida (satuan
pembentuk DNA), juga nukleotida pemutus atau penghenti rantai
( terminator rantai) dalam konsentrasi rendah (biasanya dideoksinukleotida).
Penggabungan nukleotida pemutus rantai tersebut secara terbatas
kepada rantai DNA oleh polimerase DNA menghasilkan fragmen-fragmen
DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat
nukleotida tertentu tersebut tergabungkan.
Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu dipisahkan menurut ukurannya
dengan elektroforesis gel poliakrilamida, atau sekarang semakin lazim
dengan elektroforesis menggunakan tabung gelas berjari-jari kecil (pipa
kapiler) yang diisi dengan polimer kental.

ELISA
ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked
immunosorbent assay) atau 'penetapan kadar
imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis
yang umum digunakan di berbagai laboratorium
imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan
seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana,
ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup
tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh
Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis
adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam
suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai
pelapor (reporter label).[1]

Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive


assay yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat
antobodi-enzim, dan non-competitive assay yang menggunakan
dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay, antibodi kedua
akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua
ini seringkali disebut sebagai "Sandwich" ELISA.

Uji ini memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah


kemungkinan yang besar terjadinya hasil false positive karena
adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan antigen
lain.[2] Hasil berupa false negative dapat terjadi apabila uji ini
dilakukan pada window period, yaitu waktu pembentukan antibodi
terhadap suatu virus baru dimulai sehingga jumlah antibodi
tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi

Langkah
Uji ini dilakukan pada plate 96-well berbahan polistirena. Untuk melakukan
teknik "Sandwich" ELISA ini, diperlukan beberapa tahap yang meliputi:
Well dilapisi atau ditempeli antigen.
Sampel (antibodi) yang ingin diuji ditambahkan.
Ditambahkan antibodi kedua yang dikonjugasikan dengan enzim tertentu
seperti peroksidase alkali. Antibodi kedua ini akan menempel pada
antibodi sampel sebelumnya.
Dimasukkan substrat enzim yang dapat menimbulkan warna tertentu saat
bereaksi.
Intensitas warna campuran diukur dengan spektrofotometer yang disebut
ELISA reader hingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (OD).
Dengan menghitung rata-rata kontrol negatif yang digunakan, didapatkan
nilai cut-off untuk menentukan hasil positif-negatif suatu sampel. Hasil OD
yang berada di bawah nilai cut-off merupakan hasil negatif, dan demikian
juga sebaliknya

TERIMA KASIH