Identifikasi turunan babi dalam produk makanan oleh spesies-spesifik

polymerase chain reaction (PCR) untuk sertifikasi halal

Abstrak
Identifikasi babi dalam empat jenis produk makanan, yang sosis dan casing, roti dan
biskuit, polimerase menggunakan spesies-spesifik reaksi berantai (PCR) deteksi
wilayah dilestarikan dalam mitokondria (mt) 12S RNA ribosom (rRNA) gen
dikembangkan. DNA genomik dari produk makanan yang berhasil diekstrak kecuali
untuk sampel casing, di mana tidak ada DNA genomik terdeteksi. Itu
DNA genomik diekstraksi kemudian mengalami amplifikasi PCR menargetkan
daerah-daerah tertentu dari gen 12S rRNA. genom yang DNA dari produk makanan
yang ditemukan berkualitas baik dan menghasilkan produk PCR yang jelas pada
amplifikasi gen 12S rRNA dari 387 pasangan basa (bp) dari spesies babi. Identifikasi
PCR spesies-spesifik menghasilkan hasil yang sangat baik untuk identifikasi babi
derivatif dalam produk makanan dan merupakan teknik berpotensi handal dan cocok
dalam analisis makanan rutin untuk sertifikasi halal.
1.Perkenalan
Banyak orang telah berusaha untuk mengembangkan teknik untuk mendeteksi dan
mengidentifikasi asal spesies terutama dalam produk makanan selama dekade
terakhir yang sangat penting karena ke ekonomi, kesehatan dan isu-isu agama.
Tantangan yang dihasilkan dari pemalsuan termasuk substitusi atau kelalaian
senyawa berharga dalam produk makanan kurang bahan mahal, penambahan
bahan untuk penampilan yang lebih baik produk dan label palsu atau menyesatkan
produk makanan. Daging dan produk roti adalah salah satu produk makanan penting
dikenakan ekstensi atau pemalsuan.
Baru-baru ini, ada beberapa isu yang terkait dengan pemalsuan produk makanan di
Malaysia. Diantara masalah adalah lemak babi pemalsuan dalam roti dan
penggunaan babi casing usus dalam sosis. Ini adalah beberapa contoh dari betapa
pentingnya adalah untuk mengembangkan teknik yang dapat diandalkan untuk
memastikan status halal dari produk makanan yang sangat penting bagi umat Islam
dan otentikas ihalal (Yahya-Ismail, 2005).
Metode saat ini tersedia untuk identifikasi spesies termasuk elektroforesis (Kim &
Shelef, 1986), kromatografi cair (Ashoor, Monte, & Stiles, 1988), dot blot hibridisasi
(Ebbehj & Thomsen, 1991), secara acak diperkuat DNA polimorfik PCR (Calvo,
Zaragoza, & Osta, 2001), analisis RFLP (Bellagamba, Moretti, Comincini, & Valfr,
2001) dan spesies-speciWc PCR (Herman, 2001). Namun, reaksi silang spesies
terkait erat tidak dapat dikesampingkan dengan metode berbasis protein meskipun
mereka spesifik dan sensitif tapi masalah ini dapat dipecahkan dengan metode
berbasis DNA terutama spesies-spesifik PCR yang memiliki potensi untuk mencapai
sensitivitas deteksi yang lebih tinggi dan spesifisitas.
Identifikasi PCR dari spesies menggunakan mt-DNA lebih dari satu serangkaian
keuntungan: gen Mt-DNA yang hadir dalam ribuan salinan per sel, variabilitas besar
mt-DNA memungkinkan identifikasi yang dapat diandalkan dari spesies yang tepat
dalam campuran dan variabilitas intraspesific overs mt-DNA kemungkinan keturunan
diskriminatif saat ini digunakan di industri produksi babi (Montiel-Sosa et al., 2000).
Penggunaan primer yang dirancang khusus di bawah kondisi membatasi PCR

amplifikasi juga bisa membuat kemungkinan langsung dan Identifikasi specific

fragmen mt-DNA PCR-diperkuat, menghindari sequencing berikutnya atau
identifikasi RFLP (Matsunaga et al., 1999).
Tujuan dari pekerjaan ini terdiri dari pengembangan yang handal Metode untuk
mendeteksi daging babi derivatif di produk makanan oleh Identifikasi Band
sederhana produk PCR menggunakan fragmen dari mt-DNA 12S rRNA gen.
2.Bahan-bahan dan metode-metode
2.1. sampel
Empat jenis produk makanan yang sosis dan casing, roti dan biskuit yang
digunakan. Untuk sosis, tiga jenis sosis ayam, tiga jenis daging sapi sosis, dua jenis
sosis babi, dua jenis sosis yang tidak diketahui (Non-label produk) dan tiga jenis
casing tidak diketahui (Non-label produk) dipelajari. sosis babi yang digunakan
sebagai kontrol dalam penelitian ini. Roti (empat jenis) dan biskuit (lima jenis) yang
digunakan di mana tiga dari biskuit adalah buatan sendiri. Biskuit buatan sendiri
disiapkan dengan menambahkan 1%, 50% dan 100% lemak babi dalam perumusan
biskuit, masing-masing. Sampel dibeli dari supermarket dan hipermarket di Sri
Serdang dan Sri Petaling, Selangor, Malaysia, masing-masing. sosis
sampel disimpan pada 20 C sampai digunakan untuk ekstraksi DNA untuk
mencegah degradasi enzimatik DNA.
2.2. ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dari sosis dan casing, dan dari roti dan biskuit dilakukan sesuai
dengan instruksi produsen disediakan menggunakan DNeasy Tissue Kit dan
DNeasy Tanaman Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jerman), masing-masing.
Sekitar 25mg sosis dicampur dan casing sampel menggunakan blender (Braun AG,
Frankfurt, Jerman) dipindahkan ke dalam tabung microcentrifuge 1.5ml steril
mengandung 180 ml ATL penyangga dan 20 ml Proteinase K dan diinkubasi pada 55
C dalam bak air untuk membubarkan sampel semalam sampai jaringan benarbenar segaris. Campuran ditambahkan dengan 4 ml RNase A (100mg / ml) berikut
hari, diinkubasi selama 2 menit pada suhu kamar dan dicampur dengan vortexing
selama 15 s. Sebanyak 200 penyangga AL ml adalah ditambahkan ke sampel,
dicampur secara menyeluruh oleh vortexing dan diinkubasi pada 70 C selama 10
menit. Campuran itu kemudian ditambahkan dengan 200 etanol ml (96-100%) dan
dicampur dengan vortexing untuk menghasilkan solusi homogen. Solusi homogen itu
dipipet ke dalam DNeasy Mini kolom duduk di tabung koleksi 2ml dan di
sentrifugasi pada 12,000g untuk 1min. DNA terikat ke kolom dicuci dalam dua
sentrifugasi langkah menggunakan 500 ml AW1 penyangga dan penyangga AW2
untuk meningkatkan kemurnian DNA dielusi. DNA dimurnikan kemudian dielusi dari
kolom di 150 ml AE penyangga dan disimpan pada suhu 4 C sampai digunakan
lebih lanjut.
Di sisi lain, untuk ekstraksi DNA dari roti dan sampel biskuit, sekitar 20mg setiap
sampel ditambahkan dengan 400 ml AP1 penyangga dan 4 ml RNase A (100 mg /
ml) dan vortex penuh semangat. Campuran itu kemudian diinkubasi selama 10 menit
pada 65 C dan dicampur 2-3 kali selama inkubasi dengan membalik tabung.
Setelah inkubasi periode, lisat ditambahkan dengan 130 ml AP2 penyangga,
dicampur dan diinkubasi selama 5 menit pada es. Kemudian, lisat itu diterapkan
Spin Kolom QIAshredder Mini (lilac) ditempatkan dalam tabung koleksi 2ml dan
disentrifugasi selama 2 menit di 20,000g. Fraksi Xow-melalui kemudian dipindahkan
ke tabung baru tanpa mengganggu pelet sel-puing. Itu dibersihkan lisat ditambahkan
dengan 1,5 volume AP3 / E penyangga dan dicampur dengan pipetting. Sebuah

volume 650 ml campuran diaplikasikan pada DNeasy Mini spin Kolom duduk di
tabung koleksi 2ml dan disentrifugasi selama 1 menit di 6000G. Kemudian, Spin
Kolom DNeasy Mini ditempatkan di baru 2ml tabung koleksi, ditambah dengan 500
ml AW penyangga dan disentrifugasi untuk 1min di 6000G. The DNeasy Mini spin
Kolom kemudian ditambahkan dengan 500 ml AW penyangga dan disentrifugasi
selama 2menit di 20,000g kering membran. Itu DNeasy Mini spin Kolom dipindahkan
ke 1,5 ml tabung microcentrifuge. Sebanyak 100 ml AE buffer dipipet langsung ke
membran DNeasy, diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar dan kemudian
disentrifugasi selama 1 menit di 6000G untuk mengelusi.
2.3. primer oligonukleotida
Set primer digunakan untuk speciWc PCR amplifikasi yang 12SFW (5'-CCA CCT
AGA GGA GCC TGT TCT ATA AT-3 ') dan 12SR (5'-GTT ACG ACT TGT CTC TTC
GTG CA-3 '). primer ini diterbitkan oleh Rodrguez et al. (2003).
2.4. polymerase chain reaction (PCR) amplifikasi gen 12S rRNA
Mt 12S rRNA amplifikasi gen dilakukan dalam total volume 25 ml mengandung 1
reaksi PCR buVer
(50mm KCl, 10mm Tris-HCl, pH 8,3), 25mm MgCl2, 10mm dNTP, 10 pmol primer
masing-masing, 5 unit / ml Taq DNA polimerase (Finnzymes, Espoo, Finlandia) dan
30 ng DNA diekstraksi yang diukur dengan spektrofotometer (A 260 nm) (Beckman
Coulter, California, USA). PCR amplifikasi di Perkin-Elmer (Gene Amp PCR Sistem
2400) pengendara sepeda termal berjalan di bawah berikut
Kondisi: sebuah denaturasi langkah awal dari 93 C selama 2 menit untuk benarbenar mengubah sifat template DNA, diikuti oleh 35 siklus denaturasi pada 93 C
selama 30 s, anil pada 68 C selama 30 s, dan ekstensi pada 72 C selama 45 s.
Siklus akhir untuk sintesis lengkap molekul DNA perpanjangan diikuti dengan
ekstensi akhir pada 72 C selama 5 menit. Elektroforesis pemisahan 10 ml produk
PCR dilakukan pada 2% gel agarosa (Promega, Madison, USA) dalam 1 TAE
penyangga,
pH 8,0. Elektroforesis dilakukan pada tegangan konstan (74V) selama sekitar satu
jam. gel agarosa kemudian ternoda oleh ethidium bromide. Sebuah 100 bp DNA
ladder (Promega, Madison, USA) digunakan sebagai acuan ukuran. Foto gel diambil
menggunakan Syngene sistem dokumentasi gel.
2.5. pemurnian produk PCR dan sequencing
Produk PCR dimurnikan sesuai dengan protokol menyediakan dalam QIAquick PCR
pemurnian kit
(Qiagen). Sebuah volume 125 ml PB penyangga ditambahkan ke 25 ml PCR sampel
dan dicampur dengan vortexing. Kemudian, sampel itu tunduk pada kolom QIAquick
dan disentrifugasi pada
17,900g selama 60 s. Tujuh ratus lima puluh microlitres PE penyangga ditambahkan
dan disentrifugasi pada 17,900g selama 60 s. Kemudian, kolom ditempatkan di
microcentrifuge 1.5ml baru tabung. Sebanyak 30 ml EB penyangga ditambahkan ke
dalam kolom untuk mengelusi DNA dan disentrifugasi kolom di 17,900g untuk 1min.
Produk PCR dimurnikan, satu sampel per setiap
sampel positif dikirim ke First Basis Laboratories Sdn. Bhd. Untuk layanan
sequencing dengan menggunakan Applied Biosystems 377 DNA Sequencer (GMI
Inc, Minnesota, USA) yang secara otomatis analisis molekul DNA berlabel dengan
beberapa pewarna fluorescent. primer PCR digunakan untuk langsung sekuensing
produk PCR yang dimurnikan. Hasilnya sequencing diperoleh dan kemudian ledakan
ke bank gen di NCBI untuk memeriksa untuk identifikasi.

3. Hasil dan Pembahasan

identifikasi spesies dalam produk pangan dengan PCR amplifikasi gen tertentu telah
menerima perhatian khusus di tahun terakhir. Metode ini bisa memberikan
kesimpulan terpercaya dan juga bisa bekerja dengan sampel diproses mana DNA
masih akan setuju untuk PCR amplifikasi bahkan
setelah menundukkan panas selama pengolahan produk makanan (Rastogi et al.,
2004). Penelitian ini bisa membuktikan pernyataan tersebut disebutkan di atas
dengan hasil direproduksi diperoleh.
Pada tahap awal penelitian ini, ekstraksi DNA dari makanan sampel produk
dilakukan dan kualitas DNA diekstraksi diperiksa oleh elektroforesis analisis melalui
agarosa gel 1,2% (Promega) (Gambar. 1). Untuk semua sampel sosis, band
intensitas tinggi muncul. Hal ini menunjukkan bahwa DNA diekstraksi dari semua
sosis sampel langsung dapat digunakan sebagai template untuk PCR amplifikasi
gen 12S rRNA. Dalam sampel casing, tidak ada DNA genomik terdeteksi. Hal ini
mungkin karena casing terbuat dari bahan sintetis seperti casing berserat. hasil yang
rendah dari DNA genomik diekstraksi dari roti dan biskuit sampel. Hal ini mungkin
karena DNA degradasi selama suhu tinggi pengolahan makanan. Namun, DNA
diekstraksi cukup memadai untuk menjadi digunakan sebagai template untuk
amplifikasi PCR dari 12S rRNA gen.
PCR amplifikasi gen 12S rRNA menghasilkan band 387 bp (Gambar. 2) untuk sosis
daging babi. Ini mengakibatkan satu Band dari ukuran target dari satu spesies dan
tidak ada fragmen yang dihasilkan
oleh amplifikasi non-spesifik. Amplifikasi produk yang dihasilkan dari 387 bp fragmen
konsisten dengan hasil yang dilaporkan oleh Rodrguez et al. (2003). Hasil ini
menunjukkan bahwa sosis mengandung babi derivatif dengan Band diselesaikan
dari elektroforesis gel agarosa. Bagaimanapu, untuk roti dan biskuit sampel, tidak
ada amplifikasi khusus ditargetkan untuk gen 12S rRNA babi. Dalam studi ini, mtDNA diekstraksi dari biskuit lakukan tidak mengungkapkan amplifikasi PCR spesifik
dari target gen. Ini bisa menjadi hasil dari DNA yang rusak, tidak cukup Target DNA
atau DNA terkontaminasi oleh inhibitor seperti organik dan senyawa fenolik
(Cardarelli, Branquinho, Ferreira, da Cruz, & Gemal, 2005). Di sisi lain, penjelasan
yang mungkin akan menjadi tidak adanya daging babi derivatif dalam sampel
disebutkan. Hasilnya sesuai dengan temuan yang dilaporkan oleh Kuiper (1999)
yang umumnya menjelaskan bahwa tidak ada mt-DNA terdeteksi di sangat
heattreated produk makanan, protein nabati terhidrolisis, dimurnikan lesitin, turunan
tepung dan minyak olahan. PCR spesifik spesies ini sangat berguna untuk analisis
rutin identifikasi spesies, yang cepat dan sensitif. spesies- yang primer spesifik
diperkuat hanya satu ukuran fragmen dari spesies target dan dapat dideteksi sangat
sensitif dalam kolam urutan diVerent asal (Herman, 2001).
Produk PCR pemurnian mengungkapkan sebuah band tunggal dengan intensitas
tinggi pada ukuran diharapkan menyarankan bahwa Produk PCR berhasil
dimurnikan sequencing sebelumnya. Tidak ada kotoran lain seperti primer-dimer,
degradasi produk dan kontaminan yang diamati.
Dalam 12S rRNA PCR sequencing produk amplifikasi analisis, 100% identik
ditemukan ketika diperoleh Urutan dari sampel yang representatif sosis babi
dibandingkan dengan database di NCBI ledakan Database.