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Objetivos:

Extraer ADN del Bazo de cerdo.


Fase Experimental:
- Picamos con la ayuda de un cuchillo los 50g de bazo de cerdo y luego lo mezclamos con
200 mL de amortiguador salino NaCl 0,15M, amortiguado con citrato de sodio 0,015M a
pH7durante un minuto.
- Centrifugamos la suspensin mxima en revolucin por 15 minutos.
- Homogenizamos el precipitado con 200 mL de amortiguador salino.
- Desechamos el sobrenadante; combinamos y suspendimos los sedimentos con NaCl 2
mol/L hasta obtener un volumen final de 200 mL, en la cual la mayora del material debe
disolverse.
- Removimos los sedimentos por centrifugacin durante 15 minutos.
- Agitamos la solucin continuamente con un policial aadiendo al mismo tiempo un
volumen de agua destilada.
- Envolvimos el precipitado fibroso en el extremo social y lo dejamos secar en un vaso
qumico por 30 minutos. Durante ese tiempo el grumo se deshidrat parcialmente y el
lquido remanente se sec con papel filtro.
-Disolvimos la desoxirribonucleoprotena en aproximadamente 100 mL de NaCl 2 mol/L.
Agregamos un volumen igual de la mezcla de cloroformo/alcohol amlico (6:1);
homogenizamos durante 30 minutos.
- Centrifugamos la emulsin a mxima revolucin durante 15 minutos y recogimos la capa
superior acuosa (opalescente).
- La recoleccin se hizo por succin cuidadosa de forma tal que no se agitara la protena
presente en la interfase de los dos lquidos.
- Repetimos dos veces ms el tratamiento con solvente orgnicos y recogimos el
sobrenadante en un vaso qumico.
Precipitamos el ADN agitando lentamente el sobrenadante con dos veces el volumen del
alcohol (enfriado en un bao de agua fra) y rotamos el policial hasta que las fibras se
enrollaran.
- Sacamos el policial y presionamos cuidadosamente el ADN fibras contra las paredes del
vaso qumico para exprimir el solvente.
- Lavamos finalmente el precipitado introduciendo el policial en una serie de solventes
exprimiendo el exceso en la forma descrita.
- Finalmente los cuatro solventes utilizados fueron etanol al 70%, etano al 80%, etano
absoluto y ter.
Resultados:
El ADN no flota libremente dentro del ncleo de una clula. Est asociado con una gran
variedad de protenas y est revestido en una membrana celular. En las clulas animales,
el ADN tambin est contenido en una membrana nuclear. Para poder extraer el ADN de
una clula, primero deben retirarse las membranas y protenas asociadas, y despus
separarse de manera fsica del ADN (Relovera, 1988).
El procedimiento se inici homogenizando, centrifugando la muestra mediante una
centrifugadora con una solucin de homogenizacin NaCl 0,15M con citrato de sodio
0,015M a pH7. La centrifugacin produce la rotura de las clulas de los tejidos u rganos
de la muestra escogida y la liberacin del contenido celular, donde se encuentran los
cidos nucleicos.

Desechamos el sobrenadante; combinamos y suspendimos los sedimentos con NaCl 2


mol/L hasta obtener un volumen final de 200 mL, en la cual la mayora del material se
disolvi, removimos los sedimentos por centrifugacin durante 15 minutos y agitamos la
solucin continuamente con un policial aadiendo al mismo tiempo un volumen de agua
destilada.
Segn Fernndez (1996) el ADN cromosmico precipitado y los restos celulares se
pueden retirar del ADN plsmido soluble en una solucin por medio de la centrifugacin,
un proceso donde gira a alta velocidad que causa que los slidos entren en el fondo de un
tubo como un perdign, lo que permite que se separe el lquido arriba con el ADN
plsmido.
Al envolver el precipitado fibroso en el extremo social y lo dejamos secar en un vaso
qumico por 30 minutos. Durante ese tiempo el grumo se deshidrat parcialmente y el
lquido remanente se sec con papel filtro. Segn Fernndez (1996) cuando se realiza
una filtracin es para separar y eliminar las estructuras celulares de mayor tamao.
La solucin filtrada contiene los cidos nucleicos, pero todava confinados en los ncleos.
El objetivo de un proceso de aislamiento y purificacin de DNA es conseguir separar esta
molcula del resto de las macromolculas (protenas, lpidos y polisacridos) presentes en
el interior de las clulas.
Se aadieron 100 mL de NaCl 2 mol/L que solubiliz las membranas nucleares y facilit la
liberacin de los cidos nucleicos. Segn Fonseca (1994) el sodio es un ion cargado
positivamente. En una solucin de cloruro de sodio, la mesa de sal, por ejemplo, la
molcula de cloruro de sodio se separa en iones de sodio y iones de cloro. El ADN, por
otro lado, tiene altas cargas negativas. La carga altamente negativa de la molcula de
ADN es neutralizada por los iones de sodio positivos en la solucin. En otras palabras se
dispersan las lipoprotenas de las membranas y desnaturalizan complejos protenicos. Las
sales de la solucin de lisis, neutralizan las cargas negativas que inician la precipitacin
de los cidos nucleicos.
Agregamos un volumen igual de la mezcla de cloroformo/alcohol amlico (6:1);
homogenizamos durante 30 minutos. Centrifugamos la emulsin a mxima revolucin
durante 15 minutos y recogimos la capa superior acuosa (opalescente).
La neutralizacin de cargas negativas de ADN que ocurre al agregar una solucin de NaCl
2M permite que se precipite en alcohol. Sin la sal, el ADN permanece cargado
negativamente y estar en la parte acuosa de la solucin. Si esta mezcla se centrifuga, el
ADN plsmido precipitado se volver un perdign en el fondo del tubo. La porcin de agua
puede retirarse y el ADN puede regresar a la solucin, o resuspenderse, en una solucin
diferente en la concentracin deseada. Cuando se centrifuga la muestra obtenida, as se
consigue separar una fase slida, pellet (restos de clulas, protenas, lpidos) de una fase
acuosa, sobrenadante, que contiene cidos nucleicos, hidrfilos y solubles en agua
debido a sus grupos fosfato. (Serrano, 1900).
La recoleccin se hizo por succin cuidadosa de forma tal que no se agitara la protena
presente en la interfase de los dos lquidos, repetimos dos veces ms el tratamiento con
solvente orgnicos y recogimos el sobrenadante en un vaso qumico y precipitamos el
ADN agitando lentamente el sobrenadante con dos veces el volumen del alcohol
(enfriado en un bao de agua fra) y rotamos el policial hasta que las fibras se enrollaran.
Al aadir isopropanol o etanol muy fro se produce una deshidratacin y total
precipitacin de los cidos nucleicos insolubles en alcohol. Los cidos nucleicos se sitan
y visualizan en la interfase agua-alcohol. El alcohol en la solucin de precipitacin se
utiliza para remover la concentracin residual de sales y promover la precipitacin del

cido nucleico. Cuando se trata de muestras con baja concentracin de cidos nucleicos,
comnmente se utiliza un volumen de muestra de isopropanol, en lugar de dos volmenes
de muestra cuando se trabaja con etanol. La precipitacin del ADN es casi inmediata en
presencia de la sal y el alcohol (Villarreal, 1992).
Finalmente sacamos el policial y presionamos cuidadosamente el ADN fibras contra las
paredes del vaso qumico para exprimir el solvente y lavamos el precipitado introduciendo
el policial en una serie de solventes exprimiendo el exceso en la forma descrita, los
solventes utilizados fueron etanol al 70%, etano al 80%, etano absoluto y ter.
El producto filamentoso que obtuvimos no es ADN puro ya que est mezclado con
fragmentos de ARN y protenas. Una extraccin profesional se realiza aadiendo enzimas
que fragmentan las molculas de ARN e impiden que se unan al ADN. En este caso las
protenas y las grasas quedaban en la parte acuosa de la mezcla y el ADN asciende hasta
llegar al alcohol. El ADN es una molcula larga y tiende agruparse, de all la facilidad para
retirarla.
Una extraccin "profesional" se realiza aadiendo enzimas que fragmentan las molculas
de
ARN
e
impiden
que
se
unan
al
ADN.
Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN: cantidad de material de
partida,
nmero
de
copias
de
las
molculas
de
AN
o Cantidad de tejido o condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco,
congelado, fijado) o contaminantes e interferentes en el material biolgico.