Anda di halaman 1dari 160

MENGENAL LEBIH JAUH

TEKNIK ANALISA

KROMATOGRAFI & SPEKTROSKOPI

83.4

70
60
50
%T 40
30
20
10
0.0
4400.0

4000

3000

2000

1500

1000

450.0

CM-1

SANDRA HERMANTO, M.Si.

PROGRAM STUDI KIMIA


FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2009

Kata Pengantar
Salah satu faktor penting dalam meningkatkan kualitas pendidikan di perguruan tinggi
adalah tersedianya referensi pendukung kegiatan belajar mengajar bagi mahasiswa baik dalam
bentuk teks book/buku pegangan, buku paket, diktat atau kumpulan karya ilmiah maupun
informasi lainnya yang mendukung dengan bahasa yang mudah dimengerti dan dipahami oleh
semua pihak yang terlibat dalam proses pembelajaran tersebut.
Kebutuhan akan tersedianya buku ilmiah berbasis bahasa indonesia di perguruan
tinggi, khususnya untuk mata kuliah Kimia Analisa Instrumen dirasakan sangat penting
terutama bagi dosen, mahasiswa maupun para peneliti yang bergelut dalam pengembangan
ilmu kimia serta aplikasinya di berbagai bidang.
Buku ajar Kimia Analisa Instrumen sengaja disusun dengan harapan dapat membantu
pemahaman mahasiswa terhadap materi perkuliahan sehingga dapat meningkatkan mutu
pendidikan di perguruan tinggi khususnya dalam pengembangan ilmu kimia di berbagai
program studi/jurusan yang terkait. Buku ini dirancang sedemikian rupa dengan dilengkapi
berbagai gambar/ilustrasi sehingga diharapkan pembaca dapat memahami setiap konsep yang
terkandung di dalamnya.
Akhirnya, penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dan memberikan saran serta perhatiannya baik secara moriil maupun materil
hingga penulisan buku ajar ini dapat terlaksana. Penulis berharap semoga buku ini dapat
bermanfaat bagi siapapun yang menggunakannya.

Jakarta, September 2011


Penyusun

DAFTAR ISI
Halaman
Kata Pengantar

Daftar Isi

ii

BAB I : Dasar-dasar Kimia Analisis Instrumen

1
1
2
3
3
3

A.
B.
C.
D.
E.

Pendahuluan
Teknik Preparasi Sampel
Teknik Pengukuran Sampel
Pengolahan Data Analitik dan Pengambilan Kesimpulan
Validasi Metode

BAB II : Pengenalan Spektroskopi


A. Radiasi Gelombang Elektromagnetik
Panjang Gelombang, Frekuensi dan Kecepatan Cahaya
Frekuensi sinar dan energinya
Spektrum Sinar tampak
Spektrum elektromagnetik
B. Sejarah Spektroskopi

BAB III : Spektroskopi UV-Visible


A. Dasar-dasar Spektroskopi UV-Visible
Komponen Spektroskopi UV-Visible
Faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Absorbansi
B. Hukum Beer-Lambert
C. Toeri Orbital Molekul
Orbital Ikatan dan Anti Ikatan
Orbitan ikatan dalam ikatan rangkap dua
Energi relatif berbagai macam orbital ikatan
D. Teori Promosi Elektron
E. Warna Komplementer
F. Identifikasi Senyawa organik berdasarkan spektrum UV
G. Aplikasi Spektrofotometri UV-Visible untuk analisa kuantitatif

BAB IV : Spektroskopi Infra Merah


A. Dasar-dasar Spektroskopi Infra Merah
Pergerakan Ikatan (Vibrasi molekul)
B. Arti dari Spektrum Infra Merah
Spektrum Infra merah senyawa Alkohol
Spektrum Infra merah Golongan Ester
Spektrum Infra merah Golongan Keton
Spektrum Infra merah Golongan Asam Karboksilat
Spektrum Infra Merah Senyawa Amine Primer
C. Area Sidik Jari
D. Komponen Instrument Spektroskopi IR
E. Aplikasi Spektroskopi IR

8
8
8
9
9
10
11
13
13
13
16
16
17
17
19
20
26
30
36
37
39
39
40
42
43
44
44
45
45
46
48
49

BAB V : Spektroskopi Massa

51

A. Pendahuluan
Bagaimana Spekrometer massa bekerja
Diagram lengkap spektrometer massa
B. Bentuk output Spektrometer massa
C. Pola Fragmentasi Spektra massa senyawa organik
Menggunakan spektra massa untuk membedakan antar unsur

51

BAB VI : Spektroskopi Serapan Atom

62
62
62
64
65
66
67

A.
B.
C.
D.
E.
F.

Pendahuluan
Prinsip Analisa Spektroskopi Serapan Atom
Sistem Atomisasi
Instrumentasi Spektroskopi Serapan Atom
Metode Analisis
Gangguan dalam Analisis SSA

BAB VII : Spektroskopi Resonansi Magnet Inti


A. Latar Belakang Spektroskopi RMI
B. Prinsip dasar Spektroskopi RMI
Pergeseran Kimia
C. Pengaruh Lingkungan Kimia Atom Hidrogen
D. Pencacah Integrator
E. Ciri-ciri Spektrum RMI
F. Spektra RMI Resolusi Rendah
G. Spektra RMI resolusi Tinggi
H. Pemisahan (Splitting) pada spektra RMI Resolusi Tinggi
I. Spektra RMI 13C

BAB VIII : Dasar-dasar Kromatografi


A.
B.
C.
D.
E.

Pendahuluan
Sejarah Kromatografi
Jenis Kromatografi
Besaran-besaran Umum Kromatografi
Teori Dasar Proses Kromatografi

BAB IX : Kromatografi Kertas & KLT


A. Kromatografi Kertas
Nilai Rf
Kromatografi kertas dua arah
Bagaimana kromaografi kertas bekerja?
B. Kromatografi lapis Tipis
Bagaimana kromatografi lapis tipis bekerja

BAB X : Kromatografi Kolom


A. Pendahuluan
B. Kromatografi Kolom Adsorpsi
Penyiapan Kolom
Kelebihan dan kekurangan kromatografi kolom adsorpsi
C. Kromatografi Penukar Ion
Karakter Resin penukar Ion
Pemilihan resin

51
55
55
60

68
68
69
70
70
71
71
73
76
80
82
86
86
86
87
88
91
94
94
95
96
98
99
103
105
105
105
106
108
108
109
109

Penyiapan resin dan pemilihan buffer


D. Kromatografi gel Filtrasi
Karakterisasi sifat fisik gel filtrasi
Karakteristik kimia Gel
Penyiapan gel dan penyimpanan
Aplikasi kromatografi gel filtrasi

110
110
111
112
113
113

BAB XI : Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

115
105
116
118
119
120
123

Kolom dan Pelarut


Diagram Alir KCKT
Interpretasi output dari detector
Isocratic flow vs gradient elution
Jenis-jenis detector
Aplikasi KCKT

BAB XI : Kromatografi Gas


A. Pendahuluan
B. Prinsip dasar kromatografi gas
Bagaimana kerja kolom
Bagaimana pemisahan berlangsung dalam kolom
Isocratic flow vs gradient elution
Jenis-jenis detector
Aplikasi KCKT
C. Cara Memilih Kolom
D. Karakteristik kolom
E. Pemrograman temperatur
F. Detektor

BAB XI : Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa (GCMS)


A.
B.
C.
D.
E.
F.
G.

Prinsip dasar GCMS


Proses Pemisahan pada GCMS
Kegunaan bagian-bagian instrument
Faktor-faktor yang harus dipertimbangkan sebelum analisis
Sistem Operasional GCMS
Teknik Preparasi Sampel
Perawatan dan pemecahan masalah

DAFTAR PUSTAKA

Glossary of chromatographic terms

123
123
123
124
125
119
120
126
127
128
129
130

132
132
132
133
136
136
139
139

BAB I

DASAR-DASAR KIMIA ANALISIS


INSTRUMEN
A. Pendahuluan
Kimia analitik sering didifinisikan sebagai suatu ilmu atau seni ketrampilan mengenai
cara-cara menetapkan komposisi suatu zat baik dalam bentuk unsur-unsurnya maupun senyawa
yang terkandung di dalamnya. Dalam sejarahnya, perkembangan kimia analitik sejalan
kemajuan teknologi, dimana penemuan berbagai instrumen dan alat ukur telah mendukung
kemajuan dalam bidang analisa kimia., Pada awal abad 19, analisa gravimetri dan volumetri
merupakan cara-cara analisa konvensional yang mengandalkan pada ketrampilan seorang
analis dalam melakukan pengukuran dan perhitungan stoikimetrik untuk mengidentifikasi suatu
analit. Dekade berikutnya penemuan alat spektroskopi telah menghantarkan kepada cara-cara
analisa yang lebih mudah dan akurat, walaupun pada awalnya teknik ini hanya digunakan
untuk analisa kualitatif unsur/senyawa tetapi seiring dengan perkembangan teknologi, cara-cara
kolorimetri dan turbidimetri mulai mengambil peran dalam analisa kuantitatif. Beberapa tahun
kemudian metode pengukuran dengan arus listrik dapat digunakan untuk menentukan titik
akhir titrasi yang dikenal dengan titrasi konduktometri. Selanjutnya, melalui perkembangan
teknologi elektronik yang cukup pesat di era tahun 1930an, penggunaan alat instrumen dalam
kegiatan analisa menjadi bagian yang sangat penting dalam menunjang perkembangan ilmu
kimia analitik. Hampir semua sifat fisik yang khas dari suatu unsur atau senyawa dapat
digunakan sebagai dasar bagi cara-cara analisa secara instrmentasi.
Sifat fisik suatu unsur atau senyawa kimia umumnya berasal dari sifat khas atom-atom
unsur atau senyawa yang menyusunnya. Muatan listrik suatu atom hampir tidak terbaca dengan
alat listrik biasa sehingga memerlukan alat khusus untuk menggandakannya. Alat pengganda
muatan listrik atau radiasi gelombang elektromagnetik dari suatu unsur atau senyawa dikenal
dengan ampifier. Selain itu kepekaan dari pengamatan manusia juga sangat terbatas misalnya
dalam mengamati perbedaan warna yang intensitasnya sangat rendah, sehingga untuk itu
diperlukan sautu alat pedeteksi yang mampu mendeteksi perbedaan tersebut. Dengan
menggunakan detektor inilah alat instrumen mampu mendeteksi konsentrasi suatu senyawa
walaupun dalam jumlah yang sangat rendah. Oleh karena itu cara analisa intrumen memiliki
kepekaan yang relatif tinggi jika dibandingkan dengan analisa konvensional, selain itu analisa
instrumen juga tidak memerlukan waktu yang lama, penggunaan pelarut dan bahan-bahan
kimia pendukung yang sedikit serta reprodusibilitas yang tinggi. Namun demikian tidak berarti
cara analisa instrumen lebih sederhana dari cara-cara konvensional.
Ada beberapa hal yang setidaknya harus diperhatikan oleh analis sebelum melakukan
analisa dengan alat instrumen, antara lain :
a. Apakah analisis harus dilakukan di lapangan atau bisa dilakukan di laboratorium?
b. Apakah teknik sampling yang dilakukan telah sesuai dengan metode analisa yang akan
digunakan?
c. Apakah metode analisa telah divalidasi sebelumnya?
d. Bagaimanakah cara penyiapan contoh yang bisa meminimalkan atau menghindari
kesalahan dalam analisa?
e. Berapa derajat ketelitian dan ketepatan yang diperlukan?
f. Apakah terdapat zat/senyawa standar sebagai pembanding? Dst.
DASAR-DASAR KIMIA ANALISA INSTRUMEN

B. Teknik Preparasi Sampel


Untuk memperoleh informasi tentang komposisi kimia suatu bahan, terkadang
diperoleh dengan langkah yang sederhana dan cepat, namun tidak jarang pula yang
memerlukan langkah yang rumit dan waktu yang lama. Hal tersebut bergantung pada sifat dan
kompleksitas analit yang akan dianalisa serta keberadaannya di dalam matriks sampel. Secara
umum, langkah-langkah analisis antara lain melibatkan beberapa tahapan sebagai berikut :
sampling dan pengawetan sampel, perlakuan awal dalam upaya menyiapkan analit (preparasi
sampel), pengukuran, pengolahan data analitik dan pengambilan kesimpulan.
Dalam hal tertentu, kimia analisa instrumen melakukan pula upaya pemisahan dan
pemurnian suatu konstituen dari konstituen lainnya atau dari matriks sampelnya. Pekerjaan ini
dapat pula dimasukkan dalam tahap preparasi sampel. Namun bila konstituen yang diinginkan
berada dalam matriks sampel yang rumit, maka tahap ini merupakan suatu bidang pekerjaan
kimia analitik tersendiri, yang lebih dikenal dengan kimia pemisahan analitik. Dari sini muncul
teknik-teknik analisis baru yang merupakan gabungan dua atau lebih teknik analisis, misalnya
dalam analisa kafein dalam matriks sampel organik yang dilakukan dengan menggunakan
metode ekstraksi dan kromatografi.
Sifat informasi mengenai komposisi kimia suatu analit penting diketahui agar dapat
merancang skenario analisis beserta peralatan yang digunakan. Berdasarkan sifat informasinya,
analisis kimia dibedakan menjadi :
a. Analisa proksimat : informasi yang diperlukan cukup dengan mengetahui jenis dan jumlah
suatu unsur atau senyawa dalam suatu bahan tanpa mengetahui struktur senyawa yang
sesungguhnya.
b. Analisa parsial : analisa yang hanya memerlukan informasi konstituen tertentu dalam
sampel.
c. Analisa konstituen renik : analisa parsial yang khusus memerlukan informasi keberadaan
dan jumlah konstituen renik dalam sampel.
d. Analisa lengkap : analisa ini dilakukan untuk mendapatkan informasi secara lengkap
tentang keberadaan semua konstituen dalam suatu sampel.
Berdasarkan ukuran sampel yang digunaan, metode analisis dibedakan menjadi :
a. Analisis makro, bilamana ukuran sampel lebih dari 0,1 g.
b. Analisis semi mikro, bila ukuran sampel antara 0,01 hingga 0,1 g.
c. Analisis mikro, bilamana ukuran sampel kurang dari 0,01 g.
Tidak selamanya sampel dapat langsung diukur dengan suatu metode tertentu. Hal ini
disebabkan antara lain oleh :
1. Metode pengukurannya yang tidak memungkinkan untuk pengukuran langsung.
2. Konstituen yang diinginkan berada dalam matriks sampel yang rumit, yang bila dilakukan
pengukuran langsung akan mengganggu pengukuran konstituen yang diinginkan.
Perlakuan pendahuluan bisa saja dilakukan secara sederhana, namun banyak pula yang
membutuhkan teknik preparasi yang sangat rumit.Misalnya dalam penetapan kadar besi dalam
air sungai secara spektrofotometri serapan atom hanya memerlukan penambahan sedikit asam
ke dlam sampel untuk mencegah terjadinya hidrolisis dari ion besi. Sedangkan peentapan besi
dari sampel batuan (misalnya dari granit) memerlukan perlakuan awal yang lebih rumit,
dimana batuan digerus terlebih dahulu hingga ukuran tertentu, selanjutnya diambil sejumlah
kecil melalui prosedur sampling conning and quartering dan dilanjutkan dengan
memperlakukan sampel dengan pelarut asam (misalnya asam nitrat), dan memisahkan bagian
terlarutnya dari yang tidak larut dan diakhiri dengan menjadikan larutan itu dalam volume
tertentu sebelum dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer serapan atom.
Metode penguraian sampel sangat beragam, diantaranya adalah pelarutan dengan
pelarut yang sesuai, peleburan yang diikuti dengan pelarutan dan pelarutan yang diikuti dengan
pemisahan. Pemisahan yang digunakan selain untuk mengisolasi konstituen yang diinginkan
DASAR-DASAR KIMIA ANALISA INSTRUMEN

dari konstituen lainnya, juga digunakan sebagai upaya pemekatan. Cara-cara pemisahan yang
kerap digunakan antara lain adalah : distilasi, ektraksi pelarut, ekstraksi padat-cair,
pengendapan, ultrafiltasi, elektroforesis dan kromatografi.

C. Teknik Pengukuran Sampel


Tahap pengukuran merupakan tahapan yang memerlukan penanganan yang seksama,
agar pekerjaan-pekerjaan sebelumnya dalam mempersiapkan analit tidak sia-sia. Metode
analisis yang digunakan secara umum digolongkan menjadi metode kimia konvensional dan
metode kimia instrumen atau metode modern. Bagi keperluan analisis kualitatif diperlukan
konstituen standar sebagai referensi. Untuk keperluan analisa kuantitatif ditambah dengan
kalibrasi. Beberapa kriteria pengukuran diperlukan untuk mendapatkan hasil yang valid.
Kriteria tersebut antara lain : replikasi (keterulangan) pengukuran, presisi dan akurasi
(ketepatan dan kecermatan) hasil pengukuran, limit deteksi, limit kuantisasi dan kepekaan.
Pemilihan alat ukur yang memadai serta rancangan pengukuran sangat berpengaruh
terhadap hasil analisis. Informasi awal mengenai kadar suatu konstituen dalam sampel amat
membantu dalam memilih alat dan menentukan metode pengukuran. Dasar-dasar statistika juga
sangat menunjang dan banyak diperlukan dalam pengambilan keputusan, sehingga setiap
langkah analisis diupayakan untuk menghindari kesalahan sekecil mungkin.

D. Pengolahan data Analitik dan Pengambilan Kesimpulan


Kimia analitik instrumen tidak hanya melakukan pengukuran untuk keperluan
informasi kualitatif dan kuantitatif saja, namun melakukan pula interpretasi serta berupaya
memecahkan masalah yang timbul. Presisi dan akurasi serta batas ketangguhan hasil analisis
dapat ditentukan melalui pengolahan data analitik berdasarkan cara-cara yang dapat
dipertanggungjawabkan. Suatu hasil analisis dapat dinyatakan dengan bilangan tertentu atau
tidak ada sama sekali/ tidak terdeteksi (ttd). Pengukuran yang sudah dilandasi dengan hukumhukum tertentu, misalnya Hukum Lambert-Beer tentang penyerapan radiasi gelombang
elektromagnetik oleh suatu zat memberikan acuan bahwa hubungan antara absorbansi dengan
konsentrasi zat adalah linear. Namun demikian, dalam suatu pengukuran dalam upaya
membuktikan suatu kaidah, maka data-data yang diperoleh perlu diolah secara benar.
Pada kenyataannya informasi tentang komposisi kimia suatu bahan yang dianalisa
dengan metode tertentu memiliki perbedaan dengan nilai yang sesungguhnya. Perbedaan antara
nilai hasil pengukuran dengan nilai yang sesungguhnya merupakan kesalahan pengukuran.
Secara umum kesahalan pengukuran digolongkan menjaid kesalahan acak (random error) dan
kesalahan kontinyu (continue error). Kesalahan acak disebut juga kesalahan yang tidak dapat
diperbaiki (incorrigible error) atau kesalahan tak pasti (undefinit error), sedangkan kesalahan
kontinyu disebut pula kesalahan yang dapat diperbaiki (corrigible error) atau kesalahan yang
pasti (definit error). Kesalahan yang pasti dibedakan menjadi kesalahan metodik, kesalahan
operatip dan kesalahan instrumental. Besarnya kesalahan-kesalahan tersebut memberikan
kontribusi terhadap nilai ketidakpastian pengukuran (uncertenty).

E. Validasi Metode Analisis


Validasi merupakan suatu uji kinerja metode standar. Validasi ini dilakukan terhadap
suatu metode standar sebelum diterapkan di laboratorium. Validasi sebuah metode bermaksud
untuk membuktikan bahwa laboratorium yang bersangkutan mampu melakukan pengujian
dengan metode tersebut dengan hasil yang valid. Disamping itu validasi juga bertujuan untuk
membuktikan bahwa laboratorium memiliki data kinerja. Hal ini dikarenakan laboratorium
yang berbeda memiliki kondisi dan kompetensi personil serta kemampuan peralatan yang
berbeda. Sehingga, kinerja antara satu laboratorium dengan laboratorium lainnya tidaklah
sama.
Didalam verifikasi metode, kinerja yang akan diuji adalah keselektifan seperti uji
akurasi (ketepatan) dan presisi (kecermatan). Dua hal ini merupakan hal yang paling minimal
DASAR-DASAR KIMIA ANALISA INSTRUMEN

harus dilakukan dalam verifikasi sebuah metode. Suatu metoda yang presisi (cermat) belum
menjadi jaminan bahwa metode tersebut dikatakan tepat (akurat). Begitu juga sebaliknya, suatu
metode yang tepat (akurat) belum tentu presisi.
Hubungan antara akurasi dan presisi dalam uji metode dapat terjadi dalam empat hal:

Akurasi dan presisi sama-sama rendah


Presisi tinggi, akurasi rendah
Presisi rendah, akurasi tinggi
Akurasi dan Presisi tinggi.

Jika diimajinasikan kedalam dunia nyata, akurasi dan presisi digambarkan dengan
anak-anak panah yang dilepaskan dari busur dan sasaran tembak. Dikatakan akurat dan presisi
atau cermat dan tepat, jika anak panah yang dilepaskan dari busur tepat mengenai pusat sasaran
panah yang dituju. Ketika anak panah kedua dilepaskan, maka harus tepat mengenai pusat
sasaran, dan seterusnya. Artinya, setiap kali pengulangan berada pada sasaran yang hendak
dituju.
Meskipun demikian, akurasi tidaklah sama dengan presisi dan tidak sama dengan
reliabilitas/keandalan suatu data. Akurasi diartikan sebagai kedekatan hasil analisa terhadap
nilai yang sebenarnya. Presisi diartikan sebagai kedekatan antara sekumpulan hasil analisa.
Sedangkan reliabilitas data adalah gabungan antara presisi dan akurasi. Dengan kata lain,
akurasi bertujuan untuk mendapatkan suatu nilai yang benar. Presisi bertujuan untuk
mendapatkan nilai yang sama. Sedangkan reliabilitas data adalah untuk mendapatkan nilai
yang benar dan sama.
Reliabilatas data (keandalan suatu data) merupakan syarat mutlak yang harus
dimiliki oleh suatu laboratorium analisa. Suatu laboratorium yang berkualitas harus dapat
mengeluarkan data-data yang andal dan dapat dipercaya (memiliki akurasi dan presisi tinggi).
Dalam skala industri, laboratorium bertugas sebagai pabrik yang memproduksi data,
kemudian data ini akan diteruskan kepada pihak proses yang memproduksi barang yang
sebenarnya. Dan tentu saja mereka akan memproduksi barang sesuai dengan data-data yang
dikeluarkan laboratorium. Apa jadinya jika formula dan analisa yang dikeluarkan laboratorium
(misalnya farmasi) salah ? Bisa jadi obat yang akan diproduksi akan tidak sesuai dengan
fungsinya.
Berdasarkan SNI 19-17025-2000, validasi adalah konfirmasi suatu metode melalui
pengujian dan pengadaan bukti bahwa syarat-syarat tertentu dari suatu metode telah dipenuhi.
Validasi perlu dilakukan oleh laboratorium terhadap :
Metode non standar
Metode yang dikembangkan sendiri
Metode standar yang digunakan diluar lingkup yang dimaksud
Metode standar yang dimodifikasi
Metode standar untuk menegaskan dan mengkonfirmasikan bahwa metode tersebut sesuai
dengan penggunaannya.
Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode
analisis adalah sebagai berikut:
1. Accuracy (Kecermatan)
Accuracy adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan
kadar analit yang sebenarnya. Accuracy dinyatakan sebagai persen perolehan kembali
(recovery) analit yang ditambahkan. Accuracy dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu
metode simulasi (spiked-placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard
addition method).
Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke dalam
plasebo (semua campuran reagent yang digunakan minus analit), lalu campuran tersebut
dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar yang
sebenarnya). Recovery dapat ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien
DASAR-DASAR KIMIA ANALISA INSTRUMEN

obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80%
sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode
yang akan divalidasi. Tetapi bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo karena
matriksnya tidak diketahui seperti obat-obatan paten, atau karena analitnya berupa suatu
senyawa endogen misalnya metabolit sekunder pada kultur kalus, maka dapat dipakai
metode adisi.
Dalam metode adisi (penambahan baku), sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit
yang diperiksa (pure analit/standar) ditambahkan ke dalam sampel, dicampur dan dianalisis
lagi. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang
diharapkan).
Pada metode penambahan baku, pengukuran blanko tidak diperlukan lagi. Metode ini tidak
dapat digunakan jika penambahan analit dapat mengganggu pengukuran, misalnya analit
yang ditambahkan menyebabkan kekurangan pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar,
dll.
Dalam kedua metode tersebut, recovery dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang
diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. Biasanya persyaratan untuk recovery adalah tidak
boleh lebih dari 5%.
2. Precision (keseksamaan)
Precision adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji
individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur
diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang
homogen.
Presicion diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien
variasi). Precision dapat dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) atau
reproducibility (ketertiruan).
Repeatability adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh
analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Repeatability
dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik
yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi
yang normal.
Reproducibility adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang
berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda
menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis
dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang
sama. Reproducibility dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan
menggunakan peralatan, pereaksi, dan analis yang berbeda.
Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif (RSD)
atau koefisien variasi (CV) 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel
tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi
laboratorium. Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasi meningkat dengan
menurunnya kadar analit yang dianalisis.
Ditemukan bahwa koefisien variasi meningkat seiring dengan menurunnya
konsentrasi analit. Pada kadar 1% atau lebih, standar deviasi relatif antara laboratorium
adalah sekitar 2,5% ada pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm)
RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per bilion (ppb) adalah 32%. Pada metode yang
sangat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2%.
Percobaan keseksamaan dilakukan terhadap paling sedikit enam replika sampel
yang diambil dari campuran sampel dengan matriks yang homogen. Sebaiknya
keseksamaan
ditentukan terhadap sampel sebenarnya yaitu berupa campuran dengan bahan pembawa
sediaan farmasi (plasebo) untuk melihat pengaruh matriks pembawa terhadap keseksamaan
ini. Demikian juga harus disiapkan sampel untuk menganalisis pengaruh pengotor dan hasil
degradasi terhadap keseksamaan ini.

DASAR-DASAR KIMIA ANALISA INSTRUMEN

3. Selektivitas (Spesifisitas)
Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya
mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang
mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai
derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang
mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis,
senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak
mengandung bahan lain yang ditambahkan.
Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang
mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau pembawa
plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi.
Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya. Jika cemaran dan
hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat diperoleh, maka selektivitas dapat
ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil uji
urai dengan metode yang hendak diuji lalu dibandingkan dengan metode lain untuk
pengujian kemurnian seperti kromatografi, analisis kelarutan fase, dan Differential
Scanning Calorimetry. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran
selektivitas. Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi, selektivitas ditentukan
melalui perhitungan daya resolusinya (Rs).
4. Linearitas dan Rentang
Linearitas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon proporsional
terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas
terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan,
keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima.
Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi
yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit
dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakuan matematik dalam pengujian
linearitas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil
analisis terhadap konsentrasi analit.
Dalam beberapa kasus, untuk memperoleh hubungan proporsional antara hasil
pengukuran dengan konsentrasi analit, data yang diperoleh diolah melalui transformasi
matematik dulu sebelum dibuat analisis regresinya.
Dalam praktek, digunakan satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya antara 50
150% kadar analit dalam sampel. Di dalam pustaka, sering ditemukan rentang
konsentrasi yang digunakan antara 0 200%. Jumlah sampel yang dianalisis sekurangkurangnya delapan buah sampel blanko.
Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada
analisis regresi linier Y = a + bX. Hubungan linier yang r = +1 atau 1 bergantung pada
arah garis. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang
digunakan. Parameter lain yang harus dihitung adalah simpangan baku residual (Sy).
Dengan menggunakan kalkulator atau perangkat lunak komputer, semua perhitungan
matematik tersebut dapat diukur
5. Batas Deteksi (Limit of Detection) dan Batas Kuantitasi (Limit of Quatification)
Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang
masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi
merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik
dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi
kriteria cermat dan seksama.
Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode
analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan
instrumen batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada
pengenceran bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan
mengukur respon blangko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blangko dan
formula di bawah ini dapat digunakan untuk perhitungan :
DASAR-DASAR KIMIA ANALISA INSTRUMEN

Q = (k x Sb)/Sl
Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)
k = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantitasi
Sb = simpangan baku respon analitik dari blangko
Sl = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap konsentrasi = slope
(b pada persamaan garis y = a+bx)
Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi
linier dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan
garis linier y = a+bx, sedangkan simpangan baku blanko sama dengan simpangan baku
residual (Sy/x.)
a. Batas deteksi (LoD)
Karena k = 3, Simpangan baku (Sb) = Sy/x, maka:
LoD = (3 Sy/x)/ Sl
b. Batas kuantitasi (LoQ)
Karena k = 10, Simpangan baku (Sb) = Sy/x, maka:
LoQ = (10 Sy/x)/Sl
Cara lain untuk menentukan batas deteksi dan kuantitasi adalah melalui penentuan
rasio S/N (signal to noise ratio). Nilai simpangan baku blanko ditentukan dengan cara
menghitung tinggi derau pada pengukuran blanko sebanyak 20 kali pada titik analit
memberikan respon. Simpangan baku blanko juga dihitung dari tinggi derau puncak ke
puncak, jika diambil dari tinggi puncak derau atas dan bawah (Np-p) maka s0 = Np-p/5
sedangkan kalau dari puncak derau bawah saja (puncak negatif) maka s0 = Np/2,
selanjutnya perhitungan seperti tersebut di atas.
6. Ketangguhan metode (ruggedness)
Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari
analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium,
analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dll. Ketangguhan biasanya
dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada
hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal
antara lab dan antar analis.
Ketangguhan metode ditentukan dengan menganalisis beningan suatu lot sampel
yang homogen dalam lab yang berbeda oleh analis yang berbeda menggunakan kondisi
operasi yang berbeda, dan lingkungan yang berbeda tetapi menggunakan prosedur dan
parameter uji yang sama.
Derajat ketertiruan hasil uji kemudian ditentukan sebagai fungsi dari variabel
penentuan. Ketertiruan dapat dibandingkan terhadap keseksamaan penentuan di bawah
kondisi normal untuk mendapatkan ukuran ketangguhan metode. Perhitungannya
dilakukan secara statistik menggunakan ANOVA pada kajian kolaboratif yang disusun
oleh Youden dan Stainer.
7. Kekuatan (Robustness)
Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi
yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan
akurasi. Sebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan kekuatan
prosedur HPLC dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organik fase
gerak (1%), pH fase gerak ( 0,2 unit), dan perubahan temperatur kolom ( 2 3 C).
Perubahan lainnya dapat dilakukan bila sesuai dengan laboratorium. Identifikasi
sekurang-kurangnya 3 faktor analisis yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau
diubah. Faktor risinal ini dapat diidentifikasi sebagai A, B, dan C. Perubahan nilai faktorfaktor ini dapat diidentifikasi dengan a, b, dan c. Lakukan analisis pada kondisi yang telah
disebutkan pada pemeriksaan ketangguhan.

DASAR-DASAR KIMIA ANALISA INSTRUMEN

BAB II

PENGENALAN SPEKTROSKOPI
A. Radiasi Gelombang Elektromagnetik
Panjang gelombang, frekuensi, dan kecepatan cahaya
Jika anda menggambarkan suatu berkas sinar sebagai bentuk gelombang, jarak antara
dua puncak dinamakan panjang gelombang sinar (). Ini akan sama dengan jarak antara dua
lembah atau dua posisi lain yang identik dalam gelombang.

Gambar 2.1 Radiasi sinar sebagai gelombang

Kita dapat menggambarkan puncak-puncak gelombang ini bergerak dari kiri ke kanan.
Jika anda menghitung banyaknya puncak yang lewat tiap detiknya, anda akan mendapatkan
frekuensi sinar. Frekuensi diukur dengan satuan putaran per detik, atau disebut juga dengan
Hertz, Hz. Putaran per detik dan Hertz mempunyai arti yang sama.
Sinar oranye, sebagai contoh, mempunyai frekuensi sekitar 5 x 1014 Hz (sering
dinyatakan dengan 5 x 108 MHz - megahertz). Itu artinya terdapat 5 x 1014 puncak gelombang
yang lewat tiap detiknya.
Sinar mempunyai kecepatan tetap pada media apapun. Sebagai contoh, sinar selalu
melaju pada kecepatan sekitar 3 x 108 meter per detik pada kondisi hampa. Ini merupakan
kecepatan sebenarnya dari semua radiasi elektromagnetik ? tidak hanya sinar tampak.
Terdapat hubungan yang sederhana antara panjang gelombang dan frekuensi dari suatu
warna dengen kecepatan sinar.:

dan anda dapat mengolahnya untuk mendapatkan panjang gelombang jika diketahui
frekuensinya atau sebaliknya:

PENGENALAN SPEKTROSKOPI

Hubungan ini artinya jika anda menaikkan frekuensi, maka panjang gelombang akan
berkurang.

Gambar 2.2 Radiasi frekuensi tinggi berbanding terbalik dengan panjang gelombang

Bandingkan diagram ini dengan diagram yang sama di atas. jika panjang gelombang
lebih panjang, maka frekuensi lebih rendah. Ini sangat penting agar anda merasa cocok dengan
hubungan antara frekuensi dan panjang gelombang. Jika anda mempunyai dua gambar panjang
gelombang dari dua sinar yang berbeda warnanya, anda akan mengetahui manakah yang
frekuensinya lebih tinggi.
Sebagai contoh, jika anda mendapatkan sinar warna merah mempunyai panjang
gelombang 650 nm, dan hijau 540 nm, penting bagi anda untuk mengetahui manakah yang
lebih tinggi frekuensinya. (hijau - panjang gelombang yang lebih pendek berarti frekuensinya
lebih tinggi.
Frekuensi sinar dan energinya
Tiap frekuensi sinar mempunyai hubungan yang khas dengan energi, berikut adalah
persamaan sederhananya:

Anda dapat melihat bahwa pada frekuensi yang lebih tinggi, maka energi sinar akan lebih
tinggi.
Jadi, dapatkah anda mengelompokannya? Cobalah!
Sinar dengan panjang gelombang sekitar 380 ? 435 nm terlihat sebagai warna-warna
ungu. Berbagai warna merah mempunyai panjang gelombang sekitar 625 -740 nm. Manakah
yang energinya paling tinggi? Sinar dengan energi paling besar akan mempunyai frekuensi
paling tinggi - dan panjang gelombangnya paling pendek. Dengan kata lain, sinar ungu pada
380 nm adalah ujung dari urutan warna.
Spektrum Sinar tampak
Diagram berikut menunjukkan gambaran spektrum sinar tampak
PENGENALAN SPEKTROSKOPI

Warna

Panjang gelombang (nm)

Ungu

380 - 435

Biru

435 - 500

Sian (biru pucat)

500 - 520

Hijau

520 - 565

Kuning

565 - 590

Oranye

590 - 625

Merah

625 - 740

Spektrum elektromagnetik
Spektrum elektromagnetik tidak hanya terbatas pada warna-warna yang dapat kita
lihat. Sangat mungkin mendapatkan panjang gelombang yang lebih pendek dari sinar ungu atau
lebih panjang dari sinar merah. Spektrum elektromagnetik adalah rentang semua radiasi
elektromagnetik yang mungkin. Spektrum elektromagnetik dapat dijelaskan dalam panjang
gelombang, frekuensi, atau tenaga per foton.
Energi dari foton adalah 4.1 feV per Hz, yaitu 4.1eV/GHz
Panjang gelombang dikalikan dengan energy per foton adalah 1.24 eVm
Spektrum elektromagnetik dapat dibagi dalam beberapa daerah yang terentang dari
sinar gamma gelombang pendek berenergi tinggi sampai pada gelombang mikro dan
gelombang radio dengan panjang gelombang sangat panjang. Pembagian ini sebenarnya tidak
begitu tegas dan tumbuh dari penggunaan praktis yang secara historis berasal dari berbagai
macam metode deteksi. Biasanya dalam mendeskripsikan energi spektrum elektromagnetik
dinyatakan dalam elektronvolt untuk foton berenergi tinggi (di atas 100 eV), dalam panjang
gelombang untuk energi menengah, dan dalam frekuensi untuk energi rendah ( 0,5 mm).
Istilah "spektrum optik" juga masih digunakan secara luas dalam merujuk spektrum
elektromagnetik, walaupun sebenarnya hanya mencakup sebagian rentang panjang gelombang
saja (320 - 700 nm)
Pada spektrum yang lebih lengkap, akan ditunjukan ultra-unggu dan infra-merah, tetapi
dapat diperlebar lagi hingga sinar-X dan gelombang radio, diantara sinar yang lain. Diagram
berikut menunjukan gambaran posisi spektrum-spektrum tersebut.

PENGENALAN SPEKTROSKOPI

10

Gambar 2.3 Gambaran spektrum elektromagnetik

Jangan terlalu memikirkan batas-batas diantara berbagai bagian radiasi


elektromegnetik? karena tidak ada batasnya. Perhatikanlah bagian sinar tampak, dan satu
bagian yang berada didekatnya. Perhatikan juga pola umumnya. Juga perhatikan bahwa energi
dari berbagai macam radiasi meningkat dengan meningkatnya frekuensi.

B. Sejarah Spektroskopi
Penggunaan spektroskopi sebagai sarana penentuan struktur senyawa memiliki sejarah
yang panjang. Reaksi nyala yang populer berdasarkan prinsip yang sama dengan spektroskopi.
Di pertengahan abad ke-19, kimiawan Jerman Robert Wilhelm Bunsen (1811-1899) dan
fisikawan Jerman Gustav Robert Kirchhoff (1824-1887) berkerjasama mengembangkan
spektrometer (Gambar 2.4). Dengan bantuan alat baru ini, mereka berhasil menemukan dua
unsur baru, rubidium dan cesium. Kemudian alat ini digunakan banyak kimiawan untuk
menemukan unsur baru semacam galium, indium dan unsur-unsur tanah jarang. Spektroskopi
telah memainkan peran penting dalam penemuan gas-gas mulia.
Metoda penyelidikan dengan bantuan spektrometer disebut spektrometri. Dengan
sumber cahaya apapun, spektrometer terdiri atas sumber sinar, prisma, sel sampel, detektor dan
pencatat. Fungsi prisma adalah untuk memisahkan sinar polimkromatis di sumber cahaya
menjadi sinar monokromatis, dan dengan demikian memainkan peran kunci dalam
spektrometer.
Dalam spektrometer modern, sinar yang datang pada sampel diubah panjang
gelombangnya secara kontinyu. Hasil percobaan diungkapkan dalam spektrum dengan absisnya
menyatakan panjang gelombang (atau bilangan gelombang atau frekuensi) sinar datang dan
ordinatnya menyatakan energi yang diserap sampel.

PENGENALAN SPEKTROSKOPI

11

Gambar 2.4 Spektrometer yang dibuat oleh Bunsen dan Kirchhoff. detektor yang digunakan sangat
sederhana (mata manusia) kemudian pelat fotografi digunakan dengan ekstensif.

Metode spektroskopi/spektrometri banyak dimanfaatkan dalam analisis kimia terutama


untuk atom/senyawa yang memiliki sifat dapat mengemisikan atau mengabsorbsi cahaya
sebagai bentuk radiasi gelombang elektromagnetik.
Beberapa tipe alat spektroskopi antara lain adalah :
a. Spektroskopi adsorpsi (Spektrofotometer UV-Vis dan AAS).
b. Spektroskopi Fluorosen (Fluorescence spectroscopy)
c. Spektrsokopi sinar X
d. Sepktroskopi emisi
e. Flame fotometri
f. Spektroskopi infra merah
g. Spektroskopi sinar gamma, alpha dan beta.
h. Spektroskopi nuklir

Gambar 2.5 Contoh skema kerja alat spektroskopi

PENGENALAN SPEKTROSKOPI

12

BAB III

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL


(UV-VISIBLE)
A. Dasar-Dasar Spektroskopi UV-Visibel
Jika anda melewatkan sinar putih pada media yang berwarna, sebagian warna akan
terserap. Larutan yang mengandung ion tembaga (II) terhidrat, sebagai contoh, kelihatan
biru pucat karena larutan menyerap sinar dari spektrum merah. Panjang gelombang yang
tersisa akan berkombinasi di dalam mata dan otak untuk memunculkan warna sian (biru
pucat).
Beberapa media yang tak berwarna juga menyerap sinar, tetapi dalam daerah ultraungu (UV). Karena kita tak mampu melihat sinar UV, maka kita tak dapat mengamati
penyerapannya. Media yang berbeda akan menyerap sinar dengan panjang gelombang yang
berbeda, dan ini dapat dipakai untuk mengidentifikasi suatu materi. Keberadaan ion logam,
sebagai contoh, atau gugus fungsi dalam senyawa-senyawa organik.
Besarnya penyerapan juga tergantung pada konsentrasi materi, jika berupa larutan.
Perhitungan banyaknya penyerapan dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi larutan
yang sangat encer.

Bagian-bagian penting spektrofotometer UV-Visibel


Suatu spektrometer serapan menghitung banyaknya sinar yang diserap oleh
berbagai senyawa yang dilewati spektrum UV dan tampak. Kita akan memulai dengan
diagram lengkap, kemudian menerangkan apakah yang terjadi pada setiap bagian.

Gambar 3.1 Skema kerja alat spektrofotometer UV-Vis

Sumber sinar
Anda memerlukan sumber sinar yang menyediakan seluruh spektrum tampak dan
ultra-ungu dekat sehingga anda mendapatkan spektrum pada daerah 200 nm - 800 nm.
(sedikit melebar ke infra-merah dekat).
SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

13

Anda tidak akan mendapatkan daerah panjang gelombang tersebut dari lampu
tunggal, dan juga kombinasi dari dua lampu - lampu deuterium untuk mendapatkan
spektrum UV dan lampu tungsten/halogen untuk mendapatkan spektrum tampak.
Catatan: lampu deuterium mengandung gas deuterium pada kondisi tekanan rendah dan dihubungkan
dengan tegangan tinggi. Ini menghasilkan suatu spektrum kontinu yang merupakan spektrum UV.

Hasil kombinasi kedua lampu tersebut difokuskan pada kisi difraksi.


Kisi difraksi dan celah
Anda mungkin sudah terbiasa dengan percobaan prisma yang dapat memisahkan
sinar menjadi komponen-komponen warnanya. Suatu kisi difraksi mempunyai fungsi yang
sama, tetapi lebih efisien.

Gambar 3.2 Pola kisi difraksi sinar UV-visibel

Tanda panah biru menunjukan jalur berbagai panjang gelombang sinar diteruskan
dengan arah yang berbeda. Celah (slit) hanya menerima sinar pada daerah panjang
gelombang yang sangat sempit untuk diteruskan ke spektrometer. Dengan memutar kisi
difraksi secara perlahan, anda akan mendapatkan sinar dari seluruh spektrum (sebagian
kecil daerah panjang gelombang pada suatu waktu) yang selanjutnya diteruskan ke dalam
instrumen.
Lempeng putar

Gambar 3.3 Model lempeng putar monokromator

Sinar datang dari kisi difraksi dan celah akan mengenai lempeng putar dan satu dari tiga hal
berikut dapat terjadi.
1. Jika sinar mengenai bagian transparan, sinar akan mengarah langsung dan melewati sel
yang mengandung sampel. Kemudian dipantulkan oleh cermin ke lempeng putar kedua.
SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

14

Lempeng ini berputar ketika sinar datang dari lempeng yang pertama, sinar akan
mengenai bagian cermin lempeng kedua. Yang kemudian memantulkannya ke detektor.
Selanjutnya mengikuti jalur merah pada diagram berikut:

2. Jika berkas asli sinar dari celah mengenai bagian cermin lempeng putar pertama, berkas
akan dipantulkan sepanjang jalur hijau. Setelah cermin, sinar melewati sel referens
(akan diterangkan nanti). Akhirnya sinar mencapai lempeng kedua yang berputar,
sehingga sinar mengenai bagian transparan. Selanjutnya akan melewati detektor.

3. Jika sinar mengenai bagian hitam lempeng pertama, sinar akan dihalangi - dan untuk
sesaat tidak ada sinar yang melewati spektrometer. Komputer akan memroses arus yang
dihasilkan oleh detektor karena tidak ada sinar yang masuk.
Sel sampel dan referens
Baik sel sampel maupun referens biasanya merupakan wadah gelas atau kuarsa
kecil, sering juga disebut kuvet, dibuat sedemikian rupa sehingga jarak yang dilalui berkas
sinar adalah 1 cm. Sel sampel berisi larutan materi yang akan diuji - biasanya sangat encer.
Pelarut dipilih yang tidak menyerap sinar secara signifikan pada daerah panjang gelombang
yang digunakan (200 - 800 nm). Sel referens hanya berisi pelarut murni.
Detektor dan komputer
Detektor mengubah sinar yang masuk menjadi arus listrik. Arus lebih tinggi jika
intensitas sinarnya lebih tinggi. Untuk tiap panjang gelombang sinar yang melewati
spektrometer, intensitas sinar yang melewati sel referens dihitung. Biasanya disimbolkan
sebagai Io - dengan I adalah intensitas. Intensitas sinar yang melewati sel sampel juga
dihitung untuk panjang gelombang tersebut dan disimbolkan, I.
Jika I lebih kecil dari Io, berarti sampel menyerap sejumlah sinar. Kemudian suatu
matematika sederhana dikerjakan oleh komputer untuk mengubahnya menjadi apa yang
dinamakan absorbansi sampel, disimbolkan dengan A.
Agar lebih jelas ketika kita membahas teori pada bagian lain, hubungan antara A
dan dua intensitas adalah :
.1)

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

15

Pada diagram anda akan mendapatkan absorbansi berkisar dari 0 sampai 1, tetapi
dapat lebih tinggi dari itu. Absorbansi 0 pada suatu panjang gelombang artinya bahwa tidak
ada sinar yang diserap pada panjang gelombang tersebut. Intensitas berkas sampel dan
referens sama, sehingga perbandingan Io/I adalah 1. log10 dari 1 adalah nol.
Absorbansi 1 terjadi jika 90% sinar pada panjang gelombang yang ada diserap berarti 10% sinar tidak diserap. Pada kasus ini, Io/I adalah 100/10 (=10) dan log10 dari 10
adalah 1.
Perekam grafik
Perekam grafik biasanya merupakan plot antara absorbansi dengan panjang
gelombang. Hasilnya akan tampak sebagai berikut:

Materi ini diketahui mempunyai


puncak absorbansi pada 255 dan
395 nm.

Gambar 3.4 Contoh kurva spektrum UV-vis

Faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Absorbansi


Bagian sinar yang diserap akan tergantung pada berapa banyak molekul yang
beinteraksi dengan sinar. Bayangkan anda memiliki zat warna organik yang kuat/tajam.
Jika zat warna tersebut berupa larutan pekat, maka akan diperoleh absorbansi yang sangat
tinggi karena ada banyak molekul yang berinteraksi dengam sinar. Akan tetapi, dalam
larutan yang sangat encer, sangat sulit untuk melihat warnanya, sehingga absorbansinya
sangat rendah.
Seandainya anda ingin membandingkan zat warna tersebut dengan senyawa lain,
namun anda tidak mengetahui konsentrasinya, maka anda tidak akan dapat membuat
perbandingan dengan baik tentang senyawa mana yang menyerap sinar lebih banyak.
Pentingnya bentuk wadah
Seandainya sekarang anda memiliki larutan zat warna yang sangat encer dalam
wadah yang berbentuk tabung sedemikian sehingga yang dilewati sinar panjangnya 1cm.
Absorbansi tidak akan terlalu tinggi. Selain itu, seandainya anda melewatkan sinar
melalui tabung sepanjang 100 cm yang berisi larutan yang sama. Sinar akan lebih banyak
diserap karena sinar berinteraksi dengan lebih banyak molekul. Sekali lagi, jika anda
ingin membandingkan diantara larutan yang ada, anda juga harus memperhatikan panjang
larutan yang dilalui sinar.
Konsentrasi dan panjang larutan menjadi pertimbangan dalam menghitung nilai
Absorbansi. Hubungan antara konsentrasi, panjang larutan yang dilalui dan nilai
absorbansi digambarkan dalam persamaan matematis yang dikenal dengan Hukum BeerLambert.

B. Hukum Beer-Lambert
Seperti apakah hukum Beer-Lambert ?

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

16

Anda akan mendapatkan berbagai simbol untuk beberapa istilah dalam persamaan
hukum Beer-Lambert khususnya untuk konsentrasi dan panjang larutan. Saya akan
menggunakan bentuk yang mudah dimengerti dimana konsentrasi larutan adalah "c" dan
panjang adalah "l".

Anda
seharusnya mengenali bagian kiri persamaan seperti pada definisi absorbansi, A. Anda
juga mendapatkan persamaan yang menyatakan A:
2)
Ini lebih mudah diingat daripada yang sebelumnya, tetapi anda harus tetap
memahami persamaan untuk absorbansi. Jika persamaan pertama dan kedua digabungkan,
maka :

Huruf Yunani epsilon dalam persamaan ini disebut absorptivitas molar - atau
kadang-kadang disebut dengan koefisien absorpsi molar yang nilainya akan sangat
bervariasi bergantung pada jenis dan konsentrasi larutan.
Absorptivitas molar
Untuk menentukan nilai koefisien absorptivitas molar, dapat digunakan persamaan
berikut :

Ingat bahwa absorbansi larutan akan bervariasi berdasarkan konsentrasi atau


ukuran wadah. Absorptivitas molar diperoleh dari pembagian absorbansi dengan
konsentrasi dan panjang larutan yang dilalui sinar. Pada dasarnya, ini memberikan nilai
absorbansi standar - sinar berjalan sepanjang 1 cm melewati larutan 1 mol dm-3. Hal ini
artinya bahwa anda dapat membandingkan antara satu senyawa dengan senyawa lainnya
tanpa mengkhawatirkan pengaruh konsentrasi dan panjang larutan.
Nilai absorptivitas molar dapat bervariasi. Contohnya, etanal memiliki dua
puncak serapan dalam spektrum UV-tampak - keduanya dalam spektrum ultra-violet. Dua
puncak serapan ini disebabkan oleh promosi elektron dari pasangan bebas pada oksigen
ke orbital pi anti-ikatan; atau dari orbital pi ikatan ke orbital pi anti-ikatan.

C. Teori Orbital Molekul


Orbital ikatan dan anti-ikatan
Pada pembahasan ini diasumsikan bahwa anda telah memahami bagaimana
terbentuknya ikatan kovalen sederhana diantara dua atom. Orbital atom setengah isi pada
tiap atom mengalami tumpang-tindih (overlap) untuk membentuk orbital baru (orbital
molekul) yang berisi dua elektron dari kedua atom. Pada kasus dua atom hidrogen,

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

17

masing-masing atom mempunyai satu elektron dalam orbital 1s. Atom-atom hidrogen ini
akan membentuk orbital baru di sekitar kedua inti hidrogen.

Gambar 3.5. Orbital ikatan sigma

Adalah penting mengetahui secara pasti apakah arti dari orbital molekul ini.
Kedua elektron sangat mungkin ditemukan di orbital molekul ini - dan tempat yang paling
mungkin untuk menemukan elektron adalah di daerah yang berada diantara garis dua inti.
Molekul dapat terbentuk karena kedua inti atom tarik-menarik dengan kuat
dengan pasangan elektron. Ikatan yang paling sederhana ini disebut ikatan sigma ()
suatu ikatan sigma adalah ikatan dimana pasangan elektron paling mungkin ditemukan
pada garis diantara dua inti. Akan tetapi semua ini adalah hasil penyederhanaan. Pada
teori orbital molekul jika anda memulai dengan dua orbital atom, maka anda harus
mendapatkan dua orbital molekul - dan rupanya kita baru memperoleh satu orbital
molekul. Orbital molekul kedua terbentuk, tetapi dalam banyak kasus (termasuk molekul
hidrogen) orbital ini kosong, tidak terisi elektron. Orbital ini disebut sebagai orbital antiikatan. Orbital anti-ikatan mempunyai bentuk dan energi yang sedikit berbeda dari orbital
ikatan.
Diagram berikut menunjukkan bentuk-bentuk dan tingkat energi relatif dari
berbagai orbital atom dan orbital molekul ketika dua atom hidrogen dikombinasikan.

Orbital anti-ikatan selalu ditunjukan dengan tanda bintang pada simbolnya.


Perhatikan, ketika orbital ikatan terbentuk, energinya menjadi lebih rendah daripada
energi orbital atom asalnya (sebelum berikatan). Energi dilepaskan ketika orbital ikatan
terbentuk, dan molekul hidrogen lebih stabil secara energetika daripada atom-atom
asalnya.
Sedangkan, suatu orbital anti-ikatan adalah kurang stabil secara energetika
dibanding atom asalnya. Stabilnya orbital ikatan adalah karena adanya daya tarik-menarik
antara inti dan elektron. Dalam orbital anti-ikatan daya tarik-menarik yang ada tidak
ekuivalen. Sebaliknya, anda akan mendapatkan tolakan. Sehingga peluang menemukan
SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

18

elektron diantara dua inti sangat kecil, bahkan ada bagian yang tidak mungkin ditemukan
elektron diantara dua inti tersebut. Sehingga tak ada yang menghalangi dua inti untuk
saling menolak satu sama lain.
Jadi dalam kasus hidrogen, kedua elektron membentuk orbital ikatan, karena
menghasilkan stabilitas yang paling besar dan lebih stabil daripada yang dimiliki oleh
atom yang terpisah/tak berikatan, dan lebih stabil dari elektron dalam orbital anti-ikatan.
Mengapa helium tidak membentuk molekul He2?
Anda dapat memberikan penjelasan yang masuk akal bahwa helium tak dapat
membentuk molekul He2 karena helium tidak memiliki elektron tak berpasangan untuk
dipakai bersama. Baik! Tetapi marilah kita lihat juga dari sudut pandang teori orbital
molekul.
Diagram untuk helium merupakan sedikit modifikasi dari diagram hidrogen.

Sekarang kita mempunyai 4 elektron dalam orbital atom mula-mula. Dua orbital
atom akan membentuk dua orbital molekul. Ini artinya, kita akan menggunakan orbital
molekul ikatan dan anti-ikatan untuk mengakomodasi keduanya. Tetapi ada sesuatu yang
perlu diperhatikan karena stabilitas energetika dari pembentukan orbital ikatan akan
berkurang dengan adanya orbital anti ikatan. Pada kasus ini, pembentukan He2 tak ada
manfaatnya secara energetika - jadi He2 tak dapat terbentuk.
Orbital anti-ikatan dalam ikatan rangkap dua
Anda mungkin sudah tidak asing dengan gambar ikatan rangkap dua pada
molekul etena berikut:

Catatan: ikatan digambarkan dengan berbagai cara untuk menunjukan bagaimana atom diatur dalam 3
dimensi. Suatu ikatan ditunjukan dengan garis normal yang tak terpotong pada bidang gambar (layar). Garis
putus-putus menunjukan ikatan yang menjauhi anda. Garis tebal menunjukan ikatan yang mengarah keluar
bidang (mendekati permbaca).

Ikatan pi ditunjukan dengan warna merah, tentu, merupakan suatu orbital ikatan
normal. Ikatan ini dibentuk oleh tumpang-tindih diantara sisi-sisi orbital-p masing-masing

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

19

atom karbon yang setengah isi. Ingat bahwa dua bentuk merah yang ditunjukan pada
diagram adalah bagian dari orbital ikatan pi yang sama.
Menurut teori orbital molekul, jika terjadi tumpang-tindih diantara dua orbital
atom, pasti diperoleh dua orbital molekul. Orbital yang kedua adalah orbital pi anti-ikatan
dan kita tak pernah mendapatkannya pada keadaan normal. Orbital pi anti-ikatan (seperti
orbital sigma anti-ikatan) berada pada tingkat energi yang lebih tinggi daripada orbital
ikatan. Kedua elektron pada ikatan pi ditemukan dalam orbital pi ikatan.
Merangkuman energi relatif dari berbagai macam orbital
Diagram berikut memberikan gambaran umum bagaimana energi dari berbagai
jenis orbital saling berhubungan satu sama lain dalam beberapa senyawa. Kita akan
melihatnya untuk menerangkan penyerapan cahaya. Diagram ini hanya menunjukan skala
relatif. Anda akan melihat daftar orbital baru dalam diagram - yang ditandai "n" (untuk
non-ikatan). Orbital non-ikatan yang menjadi perhatian kita mengandung elektron
pasangan bebas, contohnya pada atom oksigen, nitrogen, dan halogen. Jadi orbital nonikatan adalah orbital yang mengandung pasangan elektron bebas pada tingkat ikatan.
Catatan: hati-hati, jangan bingung membedakan non-ikatan dengan anti-ikatan - keduanya sangatlah
berbeda. Orbital non-ikatan terjadi oleh adanya pasangan elektron bebas - sangat stabil, mengisi orbital.
Orbital anti-ikatan kosong dan stabilitasnya lebih rendah dari suatu senyawa jika senyawa tersebut
mengandung elektron. Jika ragu-ragu, kembalilah dan baca kembali materi mengenai orbital anti-ikatan,
dan yakinlah anda dapat mengetahui bahwa orbital anti ikatan tidak mengandung pasangan elektron
bebas.

Gambar 3.6 Diagram tingkat energi orbital

Pada saat sinar melewati suatu senyawa, sebagian energi dalam sinar mendorong
salah satu elektron dari orbital ikatan atau non-ikatan ke salah satu orbital anti-ikatan.
Perbedaan energi diantara tingkat-tingkat energi ini menentukan frekuensi (atau panjang
gelombang) sinar yang diserap, dan perbedaan energi itu akan berbeda pada tiap senyawa.
Konjugasi
Kita akan melewatkan sejenak penjelasan tentang konjugasi - adalah penting untuk
melihat terlebih dahulu beberapa jenis ikatan yang lain.
Ikatan rangkap dua pada etena
Untuk memahami ikatan rangkap dua terkonjugasi - pertama-tama anda harus
yakin bahwa anda telah memahami ikatan rangkap dua yang sederhana. Etena
mengandung ikatan rangkap dua sederhana antara dua atom karbon, tetapi dua bagian
ikatan ini berbeda. Bagian pertama adalah ikatan sigma sederhana yang terbentuk dari
tumpang-tindih antar ujung-ujung orbital pada tiap atom karbon, dan bagian lain
SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

20

disebabkan oleh tumpang-tindih sisi-sisi orbital-p masing-masing karbon. Diagram


menjelaskan pembentukan ikatan pi - dimana dua orbital-p bertumpang-tindih pada sisisisinya:

menghasilkan ikatan pi yang umum.

Ikatan rangkap dua terkonjugasi pada buta-1,3-diena


Buta-1,3-diena mempunyai struktur sebagai berikut:

Sekarang gambarkan pembentukan orbital molekul seperti anda membayangkan


dua molekul etena yang digabung menjadi satu. Anda akan mendapatkan ikatan sigma
yang terbentuk oleh tumpang-tindih pada ujung-ujung orbital atom karbon dan hidrogen.
Akan tersisa orbital-pi pada tiap atom karbon.

Orbital-p itu akan saling tumpang-tindih pada sisi-sisinya dan semuanya! Suatu
sistem delokalisasi ikatan pi terbentuk, sama dengan kasus benzena yang mungkin sudah
tak asing lagi bagi anda. Diagram menunjukan salah satu dari orbital molekul.

Untuk menekankan kembali - diagram hanya menunjukan satu orbital molekul


yang terdelokalisasi. Ingat bahwa warna merah (atas dan bawah) pada gambar
menunjukan bagian dari orbital yang sama. Interaksi dari dua ikatan rangkap dua untuk
menghasilkan sistem delokalisasi elektron pi pada keempat atom disebut sebagai
konjugasi. Konjugasi dalam konteks ini dapat diartikan "bergabung bersama".
Pada kenyataannya, jika anda memulai dengan tumpang-tindih empat orbital
atom, anda akan mendapatkan empat orbital molekul. Empat elektron akan menempati
dua tingkat energi terendah - masing-masing dua. Itu artinya anda akan mendapatkan dua

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

21

orbital ikatan pi. Kita hanya menggambarkan salah satunya untuk penyederhanaan lainnya mempunyai bentuk yang berbeda.
Ada juga dua orbital pi anti-ikatan, tetapi kosong. Untuk beberapa alasan, kita
mengabaikan hal ini - meskipun tidak untuk topik ini, karena energi dari sinar dapat
mendorong elektron dari orbital pi ikatan ke orbital anti-ikatan (sebagaimana akan anda
lihat pada bagian berikutnya).
Pengenalan ikatan rangkap dua terkonjugasi dalam suatu molekul
Ikatan rangkap dua terkonjugasi dapat anda jumpai pada molekul yang
mengandung lebih dari satu ikatan rangkap dua, yaitu dengan adanya ikatan rangkap dua
dan ikatan tunggal yang berselang-seling.
Ikatan rangkap dua tidak selalu terbentuk dari atom-atom karbon. Molekulmolekul berikut mengandung ikatan rangkap dua terkonjugasi, meskipun untuk contoh
terakhir, konjugasinya tidak terdapat pada seluruh bagian molekul:

Selanjutnya, molekul berikut mengandung dua ikatan rangkap dua, tetapi tidak
terkonjugasi. Ikatan rangkapnya terpisah oleh dua ikatan tunggal.

Alasan mengapa harus ada ikatan rangkap dua dan ikatan tunggal yang berselangseling adalah bahwa dengan cara ini dapat diperoleh semua orbital-pi bertumpang-tindih
pada sisi-sisinya. Pada contoh terakhir, anda akan mendapatkan tumpang-tindih pada sisisisi tiap ujung molekul untuk mendapatkan dua ikatan pi. Tetapi ikatan tunggal tambahan
di tengah menghentikan interaksi mereka satu sama lain.
Perluasan Delokalisasi ikatan rangkap dua terkonjugasi Cincin benzena
Anda pasti tidak asing lagi dengan delokalisasi pada cincin benzena. Jika anda
membayangkan benzena dengan struktur Kelul, anda mempunyai sistem yang sempurna
dengan ikatan tunggal dan ikatan rangkap dua yang berselang-seling di seluruh bagian
molekul.

Konjugasi ini memberikan sistem pi yang terdelokalisasi.

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

22

Sekali lagi, ingatlah bahwa ini hanyalah menunjukan satu orbital molekul yang
terbentuk. Sebenarnya ada tiga orbitan pi ikatan dan tiga orbital pi anti-ikatan - karena
mereka terbentuk dari kombinasi enam orbital atom. Orbital ikatan tambahan tidak
tergambarkan.
Fenilamin dan fenol
Delokalisasi juga dapat meluas di luar ikatan pi, yang melibatkan pasangan elektron
bebas seperti pada atom nitrogen atau oksigen. Dua contoh sederhana adalah fenilamin
(anilin) dan fenol. Digambarkan dengan struktur Kekul:

Anda dapat melihat ikatan tunggal dan ikatan rangkap dua berselang-seling
sepanjang cincin benzena. Konjugasi ini menyebabkan sistem delokalisasi elektron seperti
dalam benzena yang dapat ditunjukkan sebagai berikut:

Tetapi delokalisasi tidak terhenti pada cincin saja. Delokalisasi meluas ke atom
nitrogen dan oksigen. Pada fenilamin, ada satu pasangan elektron bebas pada atom
nitrogen yang dapat bertumpang-tindih dengan elektron cincin.

Sebagai akibatnya terjadi delokalisasi yang melibatkan cincin dan nitrogen.

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

23

Hal yang sama terjadi pada fenol. Satu pasangan elektron bebas dari oksigen
bertumpang-tindih dengan elektron cincin. Pasangan elektron bebas yang lain tidak
terlibat karena arahnya berbeda.

Jadi, jika anda mencoba untuk memperkirakan sejauh mana delokalisasi dapat
meluas dalam suatu molekul, jangan lupa untuk melihat atom-atom dengan pasangan
elektron bebas yang dapat dilibatkan dalam delokalisasi.
Gugus-gugus lain sebagai tambahan
Lihatlah secara khusus cincin benzena dengan gugus samping yang mengandung
ikatan rangkap dua. Sekarang mulailah dengan salah satu pasangan yang sederhana feniletena (stirena) dan benzaldehida.

Pada masing-masing contoh, anda mendapatkan delokalisasi di seluruh cincin.


Apakah delokalisasinya meluas ke gugus samping? Apakah anda mendapatkan ikatan
tunggal dan ikatan rangkap dua yang berselang-seling? Anda mempunyai ikatan rangkap
dua dalam gugus samping, kemudian suatu ikatan tunggal, dan cincin yang
terdelokalisasi. Lihatlah pada feniletena, dan bayangkanlah pengaturan orbital sebelum
terjadi delokalisasi pada gugus samping:

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

24

Anda dapat melihat bahwa ikatan rangkap dua dan elektron cincin akan bertumpangtindih untuk membentuk sistem delokalisasi seperti ini:

Benzaldehida sangat mirip, kecuali bahwa kali bukan gugus CH2 yagn berada di ujung,
ada sebuah oksigen dengan dua pasangan elektron bebas. Delokalisasinya sama persis.

Hati-hatilah, ingat bahwa untuk mendapatkan perluasan delokalisasi, ikatan


rangkap dua pada rantai samping harus dapat berkonjugasi dengan elektron cincin - dua
bagian ini harus mampu bergabung bersama. Molekul seperti dalam diagram berikut tidak
mempunyai delokalisasi yang meluas ke rantai cabang. Gugus CH2 tambahan mencegah
terjadinya tumpang-tindih pada sisi-sisi antara orbital p dari ikatan rangkap dua dengan
elektron cincin.

Gugus samping lain yang dapat diamati adalah gugus nitro, NO2 - contohnya
nitrobenzena. Ikatan dalam gugus nitro cukup sulit. Ikatannya sering ditunjukan dengan
ikatan rangkap dua antara nitrogen dengan salah satu oksigen, dan satu ikatan koordinasi
(ikatan kovalen dative).

Struktur ini kurang tepat. Kedua ikatan nitrogen-oksigen adalah identik dan gugus
tersebut terdelokalisasi. Sering digambarkan sebagai berikut:
SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

25

Setengah lingkaran yang terputus-putus menunjukan delokalisasi. Bayangkan ini


seperti lingkaran yang anda gambarkan di tengah-tengah heksagon benzena. Delokalisasi
ini hanyalah ikatan tunggal. Anda dapatkan dua konjugasi, dan delokalisasi terjadi di
seluruh molekul.

D. Teori promosi elektron


Ketika kita membicarakan urutan orbital-orbital yang ada pada senyawa organik
pada bagian pendahuluan, anda akan melihat bahwa diagram tersebut menunjukan energi
relatif tiap orbital:

Ingat bahwa diagram tersebut tidak menunjukan skala sebenarnya tetapi hanya
menunjukan kedudukan relatifnya terhadap orbital lain. Ketika sinar melewati suatu
senyawa, energi dari sinar digunakan untuk mendorong perpindahan elektron dari orbital
ikatan atau orbital non-ikatan ke salah satu orbital anti-ikatan yang kosong.
Perpindahan/lompatan elektron yang mungkin terjadi akibat adanya sinar adalah :

Gambar 3.7. Perpindahan/lompatan elektron dari orbital ikatan

Pada tiap kemungkinan, suatu elektron tereksitasi dari orbital yang terisi penuh ke
orbital anti-ikatan yang kosong. Tiap lompatan elektron memerlukan energi dari sinar,
SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

26

dan lompatan yang besar pasti membutuhkan energi yang lebih besar dari pada lompatan
yang kecil.
Tiap panjang gelombang sinar mempunyai energi yang khas. Jika besarnya energi
tersebut cukup untuk membuat suatu lompatan, maka panjang gelombang akan diserap energinya akan digunakan untuk promosi satu elektron.
Kita perlu mengetahui hubungan antara perbedaan energi dan panjang gelombang
yang diserap. Apakah dengan perbedaan energi yang lebih besar sinar yang panjang
gelombangnya lebih rendah akan diserap - atau bagaimana?
Akan lebih mudah jika diawali dengan melihat hubungan antara frekuensi sinar
yang diserap dan energinya:

Anda dapat melihat bahwa jika anda menginginkan lompatan energi yang tinggi,
anda akan menyerap sinar dengan frekuensi yang lebih tinggi. Frekuensi yang lebih
tinggi, berarti energinya lebih tinggi. Hal itu mudah - tetapi sayangnya spektra serapan
UV-tampak selalu menggunakan panjang gelombang bukan frekuensi. Ini artinya bahwa
anda perlu mengetahui hubungan antara panjang gelombang dan frekuensi.

Anda dapat melihat dari persamaan ini bahwa frekuensi yang lebih tinggi akan
mempunyai panjang gelombang yang lebih rendah. Jadi jika terdapat lompatan energi
yang lebih besar, molekul akan menyerap sinar dengan frekuensi yang lebih tinggi, dapat
dikatakan juga bahwa molekul akan menyerap sinar dengan panjang gelombang yang
lebih rendah.
Beberapa lompatan yang penting dalam spektrometri serapan
Suatu spektrometer serapan bekerja pada daerah panjang gelombang sekitar 200
nm (pada ultra-violet dekat) sampai sekitar 800 nm (pada infra-merah sangat dekat).
Lompatan elektron yang mungkin menyerap sinar pada daerah itu jumlahnya terbatas.
Sekarang, lompatan yang penting ditunjukan dengan panah hitam, dan yang tidak
mungkin dengan warna abu-abu. Panah dengan titik-titik abu-abu menunjukan lompatan
yang menyerap sinar di luar daerah spektrum yang kita amati.

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

27

Gambar 3.8. Lompatan elektron yang penting

Ingat bahwa lompatan yang lebih besar membutuhkan energi yang lebih besar dan
menyerap sinar dengan panjang gelombang yang lebih pendek. Lompatan yang
ditunjukan dengan tanda panah abu-abu menyerap sinar UV dengan panjang gelombang
yang lebih rendah dari 200 nm.
Lompatan yang penting diantaranya:
Dari orbital pi ikatan ke orbital pi anti-ikatan;
Dari orbital non-ikatan ke orbital pi anti-ikatan;
Dari orbital non-ikatan ke orbital sigma anti-ikatan.
Artinya untuk menyerap sinar pada daerah antara 200 - 800 nm (pada daerah
dimana spektra diukur), molekul harus mengandung ikatan pi atau terdapat atom dengan
orbital non-ikatan. Ingat bahwa orbital non-ikatan adalah pasangan elektron bebas,
misalnya pada oksigen, nitrogen, atau halogen.
Bagian molekul yang dapat menyerap sinar disebut sebagai gugus kromofor.
Seperti apakah spektrum serapan
Diagram berikut menunjukan spektrum serapan sederhana buta-1,3-diena molekul yang telah kita bahas sebelumnya. Absorbansi (pada sumbu tegak) adalah ukuran
banyaknya sinar yang diserap. Nilai yang lebih tinggi, berarti lebih banyak panjang
gelombang khas yang diserap.

Anda akan melihat puncak serapan pada 217 nm. Ini berada pada daerah ultraviolet dan tidak ada tanda yang menunjukan penyerapan pada daerah sinar tampak karena
buta-1,3-diena tidak berwarna. Anda mendapatkan puncak pada grafik dengan simbol
"lambda-max".
Pada buta-1,3-diena, CH2=CH-CH=CH2, tidak ada elektron non-ikatan. Artinya
lompatan elektron yang terjadi hanya (dalam kisaran yang dapat diukur oleh
spektrometer) dari orbital pi ikatan ke orbital pi anti-ikatan.
SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

28

Satu kromofor yang menghasilkan dua puncak


Suatu kromofor seperti pada ikatan rangkap dua karbon-oksigen pada etanal,
sebagai contoh, jelas memiliki elektron pi sebagai bagian dari ikatan rangkap dua, dan
juga mempunyai pasangan elektron bebas pada atom oksigen.
Artinya bahwa dimungkinkan terjadi dua penyerapan yang penting dari diagram
energi terakhir. Anda akan mendapatkan satu elektron tereksitasi dari orbital pi ikatan ke
orbital pi anti-ikatan, atau eksitasi elektron pasangan bebas pada oksigen (orbital nonikatan) ke orbital pi anti-ikatan.

Orbital non-ikatan memiliki energi yang lebih tinggi daripada orbital pi ikatan.
Artinya, lompatan elektron dari pasangan bebas pada oksigen ke orbital pi anti-ikatan
memerlukan energi yang lebih rendah. Dapat diartikan juga elektron dari pasangan bebas
pada oksigen menyerap sinar dengan frekuensi yang lebih rendah dan karena itu panjang
gelombangnya lebih tinggi. Karena itu etanal menyerap sinar dari dua panjang gelombang
yang berbeda:

pi ikatan ke pi anti-ikatan puncak serapannya pada 180 nm;


non-ikatan ke pi anti-ikatan puncak serapannya pada 290 nm.

Kedua serapan ini berada pada daerah ultra-violet, tetapi sebagian besar
spektrometer tidak dapat membaca serapan pada 180 nm karena spektrometer tersebut
bekerja pada kisaran 200 - 800 nm.
Pentingnya konjugasi dan delokalisasi terhadap panjang gelombang yang diserap
Perhatikan tiga molekul berikut:

Etena mempunyai ikatan rangkap dua karbon-karbon yang terisolasi, tetapi dua
senyawa lainnya mempunyai ikatan rangkap dua yang terkonjugasi. Pada contoh ini, ada
delokalisasi dari orbital pi ikatan pada semua molekul.
Sekarang lihat pada panjang gelombang sinar yang diserap oleh masing-masing molekul.
molekul

panjang gelombang serapan maksimum (nm)

etena

171

buta-1,3-diena

217

heksa-1,3,5-triena

258

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

29

Semua molekul memberikan spektra serapan UV-Vis yang sama, perbedaannya hanya
panjang gelombang serapannya makin tinggi dengan meningkatnya delokalisasi pada
molekul.

Serapan maksimum bergeser ke panjang gelombang yang lebih tinggi dengan


meningkatnya delokalisasi
Karena itu serapan maksimum bergeser ke frekuensi yang lebih pendek dengan
meningkatnya delokalisasi
Karena itu serapan memerlukan energi yang lebih kecil dengan meningkatnya
delokalisasi/font>
Karena itu perbedaan energi antara orbital ikatan dan orbital anti-ikatan makin
berkurang dengan meningkatnya delokalisasi

Bandingkan etena dengan buta-1,3-diena. Pada etena satu orbital pi ikatan dan
satu orbital pi anti-ikatan. Pada buta-1,3-diena, ada dua orbital pi ikatan dan dua orbital pi
anti ikatan. Hal ini telah dibahas secara detail pada bagian pendahuluan.

Orbital molekul berpasangan yang tertinggi (the highest occupied molecular


orbital) sering disingkat HOMO - pada contoh ini adalah orbital pi ikatan. Orbital
molekul tak berpasangan yang terendah (the lowest unoccupied molecular orbital,
LUMO) adalah orbital pi anti-ikatan. Perhatikan bahwa perbedaan energi antara orbitalorbital tersebut HOMO dan LUMO) makin kecil. Perbedaan ini menyebabkan energi
yang diperlukan untuk mengeksitasi elektron pada buta-1,3-diena lebih rendah daripada
etena. Pada heksa-1,3,5-triena, lebih rendah lagi.

Jika anda memperdalam hal ini untuk senyawa-senyawa dengan delokalisasi yang
sangat besar, panjang gelombang yang terserap akan cukup tinggi dalam daerah spektrum
sinar tampak, dan senyawa akan terlihat berwarna. Contoh yang baik adalah pigmen
tanaman yang berwarna orange, beta-karoten - yang ada pada wortel, sebagai contoh.

E. Warna Komplementer
Mengapa beta-karoten berwarna orange?
Beta-karoten mempunyai deretan delokalisasi seperti yang telah kita lihat, tetapi
pada skala yang lebih besar dengan 11 ikatan rangkap dua karbon-karbon terkonjugasi
SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

30

bersama-sama. Gambar berikut menunjukan struktur beta-karoten dengan ikatan rangkap


dua dan ikatan tunggal yang berselang-seling yang ditunjukan dengan warna merah.

Gambar 3.9. Struktur molekul -karoten

Yang lebih terdelokalisasi, perbedaan energi antara energi tertinggi orbital pi


ikatan dan energi terendah orbital pi anti-ikatan lebih kecil. Karena itu untuk mendorong
elektron pada beta-karoten dibutuhkan energi yang lebih kecil daripada contoh-contoh
molekul sebelumnya - karena perbedaan tingkat energinya lebih rendah. Ingat bahwa
energi yang rendah artinya sinar yang diserap frekuensinya lebih rendah dan hal itu
ekivalen dengan panjang gelombang yang lebih panjang. Beta-karoten menyerap sinar
pada daerah ultra-violet sampai violet tetapi lebih kuat pada daerah tampak antara 400 dan
500 nm dengan puncak 470 nm.
Jika anda membaca bahasan tentang radiasi elektromegnetik, anda mungkin ingat
bahwa panjang gelombang berhubungan dengan warna:
daerah warna

panjang gelombang (nm)

ungu

380 - 435

biru

435 - 500

sian (biru-pucat)

500 - 520

hijau

520 - 565

kuning

565 - 590

oranye

590 - 625

merah

625 - 740

Jadi jika serapan paling kuat adalah dari violet ke sian, warna apakah yang dapat
anda lihat? Hal ini menarik, anda tentu memikirkan warna yang ada di sebelah kiri.
Sayangnya, ini tidaklah sesederhana itu! Kadang-kadang apa yang anda lihat tidak seperti
yang anda harapkan. Pencampuran panjang gelombang sinar tidak memberikan hasil yang
sama seperti jika anda mencampurkan warna-warna cat. Anda akan mendapatkan bahwa
warna yang anda lihat adalah warna-warna komplementer..
Jika anda menyusun beberapa warna dalam suatu lingkaran, anda mendapatkan
suatu "roda warna". Diagram berikut menunjukan salah satu versi yang mungkin
diperoleh. Pencarian dengan internet akan mendapatkan beberapa versi yang berbeda!

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

31

Warna-warna yang saling berlawanan satu sama lain pada roda warna dikatakan
sebagai warna-warna komplementer. Biru dan kuning adalah warna komplementer; merah
dan sian adalah komplementer; demikian juga hijau dan magenta (merah muda).
Pencampuran dua warna komplementer akan menghasilkan sinar putih.
Apakah ini artinya jika sinar putih diserap, yang ditangkap oleh mata kita adalah
hasil pencampuran suatu panjang gelombang sinar dengan warna komplementernya. Pada
beta-karoten lebih membingungkan, karena anda menyerap suatu daerah panjang
gelombang. Jika puncak serapan bergerak dari biru ke sian, warna yang anda lihat adalah
lawannya, yaitu kuning kemerahan atau orange. Anda akan mendapatkan perubahan
warna yang lebih jelas pada dua contoh yang akan kita bahas berikut.
Penerapanya pada perubahan warna dari dua indikator
Fenolftalin
Anda pernah memakai fenolftalin sebagai indikator asam-basa, dan mengetahui
bahwa fenolftalin tak berwarna dalam suasana asam dan berwarna merah muda pada
larutan basa. Bagaimana hubungan perubahan warna ini dengan perubahan dalam
molekul?
Struktur dari dua molekul yang berbeda warna adalah:

Keduanya menyerap sinar ultra-violet, selain itu struktur di sebelah kanan juga
menyerap sinar tampak dengan puncak 553 nm. Molekul dalam larutan asam tak
berwarna karena mata kita tidak dapat mendeteksi fakta adanya penyerapan beberapa
sinar ultra-violet. Akan tetapi, mata kita mampu mendeteksi penyerapan pada 553 nm
yang dihasilkan oleh pembentukan molekul dalam larutan basa. 553 nm merupakan
daerah hijau pada spektrum sinar tampak. Jika anda melihat kembali roda warna, anda
akan menemukan bahwa warna komplementer hijau adalah merah muda dan itulah warna
yang dapat kita lihat.
Lalu mengapa perubahan struktur menyebabkan perubahan warna? Yang terjadi
adalah pergeseran serapan ke panjang gelombang yang lebih tinggi pada larutan basa.
Seperti yang telah kita ketahui, pergeseran ke panjang gelombang yang lebih tinggi terkait
dengan derajat delokalisasi yang lebih besar. Berikut adalah struktrur pada larutan asam

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

32

yang telah dimodifikasi menjadi bentuk tak berwarna. Jangkauan delokalisasi ditunjukan
dengan warna merah.

Perlu diketahui bahwa delokalisasi terjadi pada ketiga cincin - melebar hingga
ikatan rangkap dua karbon-oksigen, dan ke atom-atom oksigen karena adanya pasangan
elektron bebas. Tetapi delokalisasi tidak meluas ke seluruh molekul. Atom karbon di
tengah dengan empat ikatan tunggal menghalangi tiap daerah delokalisasi berhubungan
satu sama lain. Sekarang bandingkan dengan bentuk yang berwarna merah muda :

Penataan-ulang menyebabkan delokalisasi melebar ke seluruh ion. Delokalisasi


yang lebih besar ini menurunkan beda energi antara orbital molekul berpasangan yang
tertinggi dan orbital pi anti-ikatan tak berpasangan yang paling rendah. Energi yang
dibutuhkan untuk melompat lebih rendah dan panjang gelombang sinar yang diserap lebih
Ingat : kenaikan delokalisasi menggeser puncak serapan ke panjang gelombang yang lebih tinggi.

panjang.
Metil oranye
Anda mengetahui bahwa metil oranye berwarna kuning dalam larutan basa dan
berwarna merah dalam larutan asam.
Struktur dalam larutan basa:

Dalam larutan asam, ion hidrogen (barangkali tidak diharapkan) menempel pada
salah satu nitrogen pada ikatan rangkap dua nitrogen-nitrogen.

Sekarang lebih rumit! Muatan positif pada nitrogen terdelokalisasi (menyebar ke


seluruh struktur) - khususnya ke bagian molekul sebelah kiri. Umumnya penggambaran
struktur untuk metil oranye yang berwarna merah adalah :
SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

33

Tetapi ini dapat menyebabkan kebingungan karena banyaknya delokalisasi dalam


struktur, akan dibahas nanti (setelah kotak warna merah) jika anda tertarik.
Struktur manakah yang lebih terdelokalisasi - merah atau kuning?
Mari lihat ke belakang pada bagian spektra serapan untuk melihat apakah hal
tersebut dapat membantu. Bentuk kuning mempunyai serapan sekitar 440 nm. Ini berada
di daerah biru dari spektrum, dan warna komplementer biru adalah kuning. Ini seperti
yang anda harapkan. Bentuk merah mempunyai puncak serapan sekitar 520 nm. Ini
terdapat pada ujung daerah sian dari spektrum, dan warna komplementer sian adalah
merah. Sekali lagi sesuai harapan kita.
Perlu diingat bahwa perubahan dari bentuk kuning ke merah menghasilkan
peningkatan panjang gelombang serapan. Peningkatan panjang gelombang menunjukan
kenaikan delokalisasi. Itu artinya bahwa harus ada delokalisasi yang lebih besar pada
bentuk merah daripada bentuk kuning.
Berikut sekali lagi untuk struktur bentuk kuning:

Delokalisasi akan melebar ke seluruh struktur - hingga pasangan elektron bebas di sebelah
kiri atom nitrogen. Jika anda menuliskan struktur yang umum untuk bentuk merah,
delokalisasi rusak di bagian tengah - pola selang-seling ikatan tunggal dan rangkap dua
hilang.

Tapi itu jika kita tidak memahami apa yang ditunjukkan oleh struktur terakhir ini.
Bentuk yang diterima
Jika anda menggambarkan dua strktur Kekul yang mungkin untuk benzena, anda
akan tahu bahwa struktur benzena sebenarnya tidaklah seperti itu. Struktur yang
sebenarnya adalah diantara keduanya - semua ikatan adalah identik dan berada diantara
karakter ikatan tunggal dan rangkap dua. Hal ini karena adanya delokalisasi pada
benzena.

Dua struktur itu disebut sebagai struktur yang diterima, dan keduanya dapat dipakai
untuk menggambarkan struktur yang sebenarnya. Sebagai contoh, penggambaran ikatan

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

34

pada sisi kanan atas molekul tidak benar-benar tunggal atau rangkap dua, tetapi diantara
keduanya. Demikian juga untuk semua ikatan yang ada.
Dua struktur yang kita miliki sebelumnya yang menggambarkan bentuk merah
dari metil oranye juga merupakan bentuk yang dapat diterima dimana struktur metil
oranye dapat digambarkan dalam dua bentuk. Kita dapat menunjukan struktur
terdelokalisasinya:

Dua bentuk ini merupakan hasil pergerakan elektron dalam struktur, tanda panah
bergelombang dipakai untuk menunjukan bagaimana struktur tersebut berubah.

Dalam kenyataannya, elektron tidak bergeser penuh. Hanya dalam kasus benzena,
struktur yang sebenarnya berada diantaranya. Anda dapat juga memahami bahwa
penggambaran bentuk yang dapat diterima tidak berpengaruh pada geometri struktur.
Jenis, panjang dan sudut ikatan tidak berubah pada struktur sebenarnya.
Sebagai contoh, pasangan elektron bebas pada atom nitrogen yang ditunjukan
dalam gambar terakhir keduanya terlibat delokalisasi. Untuk terjadinya hal ini semua
ikatan di sekitar nitrogen harus berada dalam sisi yang sama dengan pasangan elektron
bebas sehingga dapat terjadi tumpang-tindih dengan orbital atom tetangga pada sisisisinya. Kenyataannya pada masing-masing bentuk yang dapat diterima satu dari nitrogen
ini ditunjukan berlaku seperti pada amonia - seperti terjadi kesalahan pengaturan ikatan dan terlihat jika delokalisasi dirusak.
Masalahnya adalah tidak mudah menggambarkan struktur delokalisasi yang rumit
dengan gambar sederhana. Hal ini cukup sulit untuk benzena dan untuk metil oranye ada
metode yang memberikan kemungkinan kekeliruan jika anda tidak menggunakan bentuk
yang dapat diterima. Struktur yang sebenarnya tak dapat ditunjukan dengan salah satu dari
bentuk-bentuk yang mungkin, tetapi masing-masing memberikan petunjuk bagaimana
terjadinya delokalisasi.
Jika kita mengambil dua bentuk dan menuliskan kemungkinan yang paling besar,
ini menunjukan bahwa ada delokalisasi elektron di seluruh struktur, tetapi kerapatan

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

35

elektron yang sedikit agak rendah di sekitar dua nitrogen menyebabkan muatan positif
muncul pada salah satu bentuk yang diterima atau lainnya.
Lalu mengapa bentuk merah lebih terdelokalisasi daripada bentuk kuning?
Akhirnya, kita menerima penjelasan mengapa delokalisasi lebih besar pada
bentuk merah metil oranye dalam larutan asam daripada bentuk kuning dalam larutan
basa. Jawaban dapat didasarkan pada fakta bahwa pasangan elektron bebas terlibat penuh
dalam delokalisasi bentuk merah sebagaimana yang kita gambarkan. Bentuk yang dapat
diterima dengan muatan positif pada nitrogen menunjukan gerakan yang signifikan bahwa
pasangan elektron bebas bergerak ke seluruh molekul.
Bukankah hal yang sama juga terjadi pada pasangan elektron bebas nitrogen yang
sama dalam bentuk kuning metil oranye? Secara keseluruhan tidak sama. Bentuk yang
dapat diterima yang anda gambar menghasilkan atom bermuatan negatif lain pada seluruh
struktur. Pemisahan muatan negatif dan positif secara energetika tidak disukai. Pada
bentuk merah, tidak ada pemisahan muatan yang baru melainkan hanya menggeser
muatan positif di sekitar struktur.

F. Identifikasi senyawa organik berdasarkan spektra serapan UV


Jika anda telah mempelajari bagian terakhir, anda akan mengetahui bahwa
panjang gelombang serapan maksimum (lambda-max) tergantung pada keberadaan
kromofor (gugus penyerap sinar) pada suatu molekul. Sebagai contoh, pada bagian lain
anda telah mengetahui fakta bahwa ikatan rangkap dua karbon-karbon (contohnya dalam
etena) mempunyai serapan maksimum pada 171 nm. Dua ikatan ganda terkonjugasi
dalam buta-1,3-diena mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang yang lebih
panjang dari 217 nm. Kita juga telah membahas mengenai dua puncak dalam spektrum
etanal (mengandung ikatan rangkap dua karbon-oksigen) pada 180 dan 290 nm. Contoh
lainnya yang sederhana, jika anda membandingkan puncak spektrum serapan UV-tampak
yang ada dengan daftar puncak yang telah diketahui, akan mudah untuk mendapatkan
gambar struktur molekul yang tidak diketahui.
Daftar puncak termasuk nilai absorptivitas molar telah diketahui. Hal ini akan
membantu anda agar lebih yakin. Contohnya (kembali menggunakan ikatan rangkap dua
karbon-oksigen), data menunjukan bahwa puncak pada 290 mempunyai absorptivitas
molar hanya 15, bandingkan dengan puncak pada 180 yang mencapai 10000.
Tabel 3.1. Contoh gugus-gugus kromofor

max, nm

Solvent

> *

171

15,000

hexane

> *

180

10,000

hexane

> *
> *

290
180

15
10,000

hexane
hexane

> *
> *

275
200

17
5,000

ethanol
ethanol

> *
> *

205
255

200
360

hexane
hexane

Chromophore

Example

Excitation

C=C

Ethene

__

CC

1-Hexyne

__

Ethanal

__

C=O

__

N=O

Nitromethane

C-X X=Br
X=I

Methyl bromide
Methyl Iodide

n
n

__

__

__

__

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

36

G. Aplikasi Spektrofotometri UV-Vis untuk Analisa Kuantitatif


Anda harus mengingat hukum Beer-Lambert:

Pada bagian kiri persamaan diketahui sebagai absorbansi larutan dan dihitung
dengan spektrometer. Persamaannya kadang ditulis dalam term absorbansi.

Simbol epsilon adalah absorptivitas molar larutan.


Menentukan konsentrasi dengan absorptivitas molar
Jika anda mengetahui absorptivitas larutan pada suatu panjang gelombang, dan
anda mengukur absorbansi larutan pada panjang gelombang itu, maka konsentrasi dapat
dihitung dengan mudah. Variabel lain dalam persamaan itu adalah panjang larutan.
Variabel ini dapat ditentukan, kenyataannya, sel yang berisi larutan dapat dibuat dengan
panjang yang telah diketahui yaitu 1 cm.
Contohnya, andaikan anda mempunyai suatu larutan dalam sel sepanjang 1 cm.
Anda menghitung absorbansinya pada panjang gelombang tertentu dengan spektrometer.
Nilainya adalah 1,92. Anda mendapatkan nilai absorptivitas molar dalam tabel adalah
19400 untuk panjang gelombang yang dimaksud.
Mensubstitusikan nilai-nilai itu:

Konsentrasi yang sangat rendah dapat diperoleh jika senyawa yang anda miliki
mempunyai absorptivitas molar yang sangat tinggi. Metode ini tentu saja tergantung pada
ada-tidaknya nilai absorptivitas molar yang akurat. Akan lebih baik menentukan
konsentrasi dengan kurva kalibrasi.
Menentukan konsentrasi dengan kurva kalibrasi
Dengan cara ini anda tidak perlu bertumpu pada nilai absorptivitas molar,
reliabilitas hukum Beert-Lambert, bahkan dimensi sel larutan. Yang anda lakukan adalah
membuat seri larutan senyawa yang akan diamati dengan konsentrasi yang akurat.
Konsentrasi seri larutan ini harus berada pada kisaran konsentrasi yang akan ditentukan
lebih encer dan lebih pekat dari konsentrasi yang diperkirakan. Dengan larutan yang
berwarna hal ini tidak sulit. Anda cukup membuat beberapa larutan dengan warna yang
lebih terang dan lebih gelap.
Untuk masing-masing larutan, tentukan absorbansinya pada panjang gelombang
yang memberikan serapan paling kuat gunakan wadah yang sama. Kemudian buat grafik
SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

37

antara absorbansi lawan konsentrasi. Ini disebut dengan metode kurva kalibrasi.
Berdasarkan hukum Beet-Lambert, absorbansi sebanding dengan konsentrasi, dan
diharapkan anda akan mendapatkan garis lurus. Hal ini berlaku pada larutan encer, dan
kurang cocok pada larutan pekat, sehingga anda akan mendapatkan suatu kurva. Selama
anda bekerja pada kisaran konsentarsi yang diamati, hal ini tidak terlalu dipermasalahkan.
Untuk grafik yang paling baik, kurva kalibrasinya akan tampak seperti gambar
berikut. (saya menggambarkannya sebagai garis lurus dengan koefisien linieritas (R2)
mendekati 1, ini dapat anda peroleh jika anda bekerja pada larutan yang benar-benar
encer. Tetapi jika berupa kurva, tidak masalah!)

Gambar 3.10. Contoh kurva kalibrasi

Ingat bahwa tidak perlu dibuat garis yang melewati titik nol. Jika hukum BeerLambert bekerja sempurna, garis tersebut akan melewati titik nol, tetapi anda tidak dapat
menjamin hal ini untuk konsentrasi yang anda amati. Sekarang anda harus menghitung
absorbansi larutan yang tidak diketahui konsentrasinya pada panjang gelombang yang
sama. Sebagai contoh, absorbansinya 0,600, maka anda dapat membaca hubungannya
dengan konsentrasi seperti pada grafik berikut.

Gambar 3.10. Cara menentukan konsentrasi melalui ekstrapolasi kurva kalibrasi

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL (UV-VISIBLE)

38

BAB IV

SPEKTROSKOPI SERAPAN MOLEKUL


(INFRA MERAH)
A. Dasar-dasar Spektroskopi Infra Merah (IR)
Anda mungkin tahu bahwa cahaya yang bisa kita lihat itu terdiri dari gelombang
elektromagnetik dengan frekwensi yang berbeda-beda, setiap frekwensi tersebut bisa dilihat
sebagai warna yang berbeda. Radiasi Infra-merah juga merupakan gelombang dengan
frekwensi yang berkesinambungan, hanya saja mata kita tidak bisa melihat mereka.
Jika anda menyinari sebuah senyawa organik dengan sinar infra-merah yang
mempunyai frekwensi tertentu, anda akan mendapatkan bahwa beberapa frekwensi tersebut
diserap oleh senyawa tersebut. Sebuah alat pendetektor yang diletakkan di sisi lain senyawa
tersebut akan menunjukkan bahwa beberapa frekwensi melewati senyawa tesebut tanpa diserap
sama sekali, tapi frekwensi lainnya banyak diserap.
Berapa banyak frekwensi tertentu yang melewati senyawa tersebut diukur sebagai
'persentasi transmitasi' (percentage transmittance). Persentasi transmitasi dengan nilai 100
berarti semua frekwensi dapat melewati senyawa tersebut tanpa diserap sama sekali. Pada
kenyataannya, itu tidak pernah terjadi, selalu akan ada penyerapan, walaupun kecil, mungkin
transmitasi sebesar 95% adalah yang terbaik yang bisa anda peroleh. Transmitasi sebesar 5%
mempunyai arti bahwa hampir semua frekwensi tersebut diserap oleh senyawa itu. Tingginya
penyerapan seperti ini akan membuat kita mengerti tentang ikatan-ikatan yang ada dalam
senyawa tersebut.
1. Bagaimana bentuk sebuah spektrum Infra-merah
Grafik di bawah ini menunjukkan bagaimana nilai persentasi transmitasi berubah jika
frekwensi dari radiasi Infra-merah yang diberikan itu dirubah.

Gambar 4.1 Contoh spektrum infra merah senyawa 1-propanol


Catatan: spektrum Infra-merah ini dibuat berdasarkan data yang diambil dari Spectral Data Base for Organic
Compounds (SDBS) di National Institute of Materials and Chemical Research di Jepang.

SPEKTROSKOPI INFRA MERAH

39

Anda harus memperhatikan bahwa besaran untuk mengukur frekwensi yang ada pada
sumbu horizontal adalah bilangan gelombang, yang didefinisikan sebagai berikut:

Hal lainnya yang perlu diperhatikan adalah pergantian skala pada sumbu horizontal
bagian tengah. Anda akan melihat bahwa ada spektrum infra-merah yang mempunyai skala
yang sama dari awal-akhir, ada juga spektrum yang skalanya berubah pada nilai sekitar 2000
cm-1, dan walaupun jarang, ada juga yang berubah lagi pada skala sekitar 1000 cm-1.
Hal-hal diatas bukanlah masalah yang besar, karena pada waktu kita ingin mengartikan
spektrum infra-merah, anda hanya perlu hari-hati dalam membaca skala pada sumbu
horizontal.
2. Apa yang menyebabkan beberapa frekwensi itu terserap?
Setiap frekwensi sinar (termasuk infra-merah) mempunyai energi tertentu. Apabila
frekwensi tertentu diserap ketika melewati sebuah senyawa tersebut diselidiki, maka pasti
energi dari frekwensi tersebut ditransfer ke senyawa tersebut. Energi pada radiasi infra-merah
sebanding dengan energi yang timbul pada getaran-getaran ikatan.
Pergerakan ikatan
Pada ikatan kovalent, atom-atom tidak disatukan oleh ikatan yang kaku, kedua atom
berikatan karena kedua inti atom tersebut terikat pada pasangan elektron yang sama. Kedua inti
atom tersebut dapat bergetar maju-mundur dan depan-belakang, atau menjauhi masing-masing,
dalam posisi yang memungkinkan.

Gambar 4.2 Vibrasi ulur (streching) molekul

Energi yang terlibat pada getaran ini tergantung pada hal-hal seperti jarak ikatan
tersebut, massa kedua atom. Ini berarti bahwa setiap jenis ikatan akan bergetar dengan cara
yang berbeda pula, yang melibatkan energi dengan jumlah yang berbeda-beda pula.
Ikatan-ikatan selalu bergetar, tapi jika anda menyinarkan energi dengan jumlah yang
tepat sama dengan yang dipunyai ikatan tersebut, anda bisa membuat getaran-getaran itu ke
tingkat yang lebih tinggi. Jumlah energi yang diperlukan untuk melakukan ini tergantung pada
ikatan masing-masing, karenanya setiap ikatan-ikatan yang berbeda, akan menyerap frekwensi
(energi) infra-merah yang berbeda-beda pula.
Pembelokan ikatan
Tidak hanya bergerak, ikatan-ikatan juga dapat berbelok.

SPEKTROSKOPI INFRA MERAH

40

Gambar 4.3 Vibrasi bengkokan (bending) molekul

Sekali lagi, ikatan-ikatan akan selalu bergetar seperti ini setiap saat dan jika anda
menyinari ikatan itu dengan jumlah energi yang tepat, maka anda bisa membuat getaran itu ke
tingkat yang lebih tinggi. Karena energi yang terlibat pada pembelokan ini juga berbeda-beda
pada setiap jenis ikatan, maka setiap jenis ikatan akan menyerap sinar infra-merah dengan
frekwensi yang berbeda-beda pula untuk membuatnya meloncat ke tingkat yang lebih tinggi.
Coba kita amati lagi spektrum infra-merah dari 1-propanol, CH3CH2CH2OH:

Gambar 4.4 Contoh-contoh penyerapan ikatan dalam spektrum IR 1-propanol

Pada gambar di atas, 3 contoh penyerapan itu dipilih untuk menunjukkan jenis getarangetaran ikatan yang membuat penyerapan itu terjadi. Perhatikan bahwa pergerakan ikatan dan
pembelokan ikatan menghasilkan lembah yang berbeda dalam spektrum tersebut.
Keadaan vibrasi dari suatu ikatan terjadi pada keadaan tetap, atau terkuantisasi pada
tingkat-tingkat energi tertentu. Tingkat energi dari panjang gelombang eksak yang teradsorbsi
oleh suatu tipe ikatan tertentu bergantung pada macam getaran dari ikatan tersebut. Oleh karena
itu tipe ikatan yang berlaianan (C-H, C=C, O-H dan sebagainya) menyerap radiasi infra merah
dengan karakteristik tingkat energi dan panjang gelombang tertentu.
Kedudukan relatif atom-atom dalam suatu molekul tidak tetap melainkan berubah
secara terus-menerus, sebagai akibat dari vibrasi yang bermacam-macam. Molekul sederhana
dapat dianggap sama dengan vibrasi harmonis dengan suatu pegas dengan massa-massa atom
pada kedua ujungnya. Dengan demikian berlaku Hukum Hooks tentang gerakan harmonis :
V = (1k/2)
Dimana : k = tatapan gaya
V = frekuensi
= massa tereduksi = (m1 + m2)
SPEKTROSKOPI INFRA MERAH

41

Karena energi vibrasi molekul terkuantisasi maka secara mekanika hanya energi
tertentu yang diperbolehkan :
EV = (V + ) H. E
V = bilangan kuantum yang nilainya + 1, sehingga energi yang diserap (E) = E E1.
Tingkat energi vibrasi yang sama hanya memberikan satu puncak serapan, tetapi terkadang
puncak yang timbul lebih dari satu yang disebabkan aturan seleksi tidak terpenuhi lagi
sehingga dapat terjadi transisi V = 2 atau + 3.

B. Arti dari Spektrum Infra-Merah


Bagaimanakah cara menggunakan spektrum infra-merah untuk mengetahui keberadaan
beberapa ikatan sederhana dalam senyawa-senyawa organik? Misalnya pada senyawa asam
etanoat. Asam etanoat mempunyai struktur sebagai berikut:

Dari struktur diatas dapat diketahui bahwa senyawa tersebut terdiri dari ikatan-ikatan sebagai
berikut:
Ikatan rangkap karbon-oksigen, C=O
Ikatan tunggal karbon-oksigen, C-O
Ikatan oksigen-hidrogen, O-H
Ikatan karbon-hidrogen, C-H
Ikatan tunggal carbon-carbon, C-C
Ikatan karbon-karbon mempunyai penyerapan cahaya yang terjadi pada gelombang
dalam jangkauan yang luas di dalam 'Area sidik jari' sehingga sangat sulit untuk membedakan
spektrum infra-merahnya.
Ikatan tunggal karbon-oksigen juga mempunyai penyerapan dalam 'Area sidik jari',
yang berkisar antara 1000 - 1300cm-1, tergantung pada molekul yang mempunyai ikatan
tersebut. Anda harus sangat hati-hati dalam membedakan mana yang merupakan spektrum
ikatan C-O.
Ikatan-ikatan lainnya dalam asam etanoat ini dapat diketahui secara mudah dengan
memperhatikan penyerapan di luar area sidik jari. Ikatan C-H (dimana hidrogen tersebut
menempel pada karbon yang mempunyai ikatan tunggal dengan unsur-unsur lainnya) menyerap
sinar pada jangkauan sekitar 2853-2962 cm-1. Karena ikatan ini terdapat pada sebagian besar
senyawa ornganik, maka ini sangatlah tidak bisa diandalkan. Maksud saya adalah anda bisa
mengabaikan lembah pada sekitar sedikit di bawah 3000 cm-1, karena mungkin itu hanya
karena ikatan C-H saja.
Ikatan rangkap antara karbon-oksigen, C=O, adalah salah satu penyerapan yang sangat
berguna, yang bisa anda temukan pada daerah sekitar 1680-1750 cm-1. Posisinya sedikit
terpengaruh oleh jenis senyawa yang mempunyai ikatan tersebut.
Ikatan lainnya yang sangat berguna adalah ikatan O-H. Ikatan ini menyerap sinar yang
berbeda-beda, tergantung pada kondisi lingkungannya. Ikatan ini akan sangat mudah dikenali
dalam sebuah asam karena akan menghasilkan lembah yang sangat luas pada daerah sekitar
2500-3300 cm-1.
Spektrum infra-merah untuk asam etanoat adalah sebagai berikut:

SPEKTROSKOPI INFRA MERAH

42

Gambar 4.5 Contoh spektrum infra merah senyawa asam etanoat


Catatan: spektrum Infra-merah ini dibuat berdasarkan data yang diambil dari Spectral Data Base for Organic
Compounds (SDBS) di National Institute of Materials and Chemical Research di Jepang.

Kemungkinan penyerapan yang disebabkan oleh ikatan tunggal C-O ini diragukan
karena terletak pada area sidik jari. Anda tidak bisa yakin bahwa lembah ini terbentuk bukan
karena ikatan yang lain. Ada kemungkinan bahwa kesalahan-kesalahan kecil mungkin timbul
dalam proses perubahan dari data tersebut untuk digunakan dalam situs ini, tapi itu tidak akan
mempengaruhi argument ini sedikitpun.
Spektrum IR senyawa golongan alkohol
Etanol

Gambar 4.6 Contoh spektrum infra merah senyawa etanol


Catatan: spektrum Infra-merah ini dibuat berdasarkan data yang diambil dari Spectral Data Base for Organic
Compounds (SDBS) di National Institute of Materials and Chemical Research di Jepang.

Ikatan O-H yang terdapat pada alkohol menyerap sinar dengan bilangan gelombang
yang lebih besar daripada ikatan O-H yang terdapat dalam asam, yaitu sekitar 3230-3550 cm-1.
Dan lagi penyerapan ini akan terjadi pada bilangan gelombang yang lebih besar lagi jika
alkohol ini tidak terikat dengan ikatan hidrogen, seperti alkohol dalam bentuk gas. Semua
spektrum infra-merah pada halaman ini dilakukan dalam bentuk cairan sehingga kemungkinan
itu tidak akan muncul. Perhatikan bahwa penyerapan karena ikatan C-H hanya sedikit dibawah
3000cm-1,dan juga pada lembah-lembah sekitar 1000-1100cm-11, dimana salah satunya
disebabkan oleh ikatan C-O.
SPEKTROSKOPI INFRA MERAH

43

Spektrum infra-merah golongan ester


Etil etanolat

Gambar 4.7 Contoh spektrum infra merah senyawa etil etanoat


Catatan: spektrum Infra-merah ini dibuat berdasarkan data yang diambil dari Spectral Data Base for Organic
Compounds (SDBS) di National Institute of Materials and Chemical Research di Jepang.

Pada grafik ini penyerapan oleh O-H hilang sama sekali. Jangan bingung dengan
lembah yang disebabkan oleh C-H yang sebagian kecil berada pada sekitar 3000cm-1.
Keberadaan ikatan rangkap C=O dapat dilihat sekitar 1740cm-1.
Ikatan tunggal C-O menyebabkan penyerapan pada sekitar 1240cm-1. Pertanyaan
apakah anda bisa menentukan lembah tersebut adalah tergantung pada tabel data atau detail
yang diberikan pada anda waktu ujian, karena ikatan tunggal C-O itu tersebar pada daerah
1000-1300cm-1, tergantung pada jenis senyawa apa yang mempunyai ikatan ini. Beberapa tabel
data ada yang memutuskan bahwa penyerapan dari 1230-1250 adalah karena ikatan C-O pada
sebuah etanoat.
Spektrum infra-merah golongan keton Propanon

Gambar 4.8 Contoh spektrum infra merah senyawa propanon


Catatan: spektrum Infra-merah ini dibuat berdasarkan data yang diambil dari Spectral Data Base for Organic
Compounds (SDBS) di National Institute of Materials and Chemical Research di Jepang.

Bagaimana halnya dengan spektrum senyawa keton seperti propanon. Anda akan
berpikir bahwa grafik spektrum IR yang dihasilkan akan sangat mirip dengan spektrum infraSPEKTROSKOPI INFRA MERAH

44

merah etil etanolat dan ester. Karena tidak ada lembah yang disebabkan oleh ikatan O-H, dan
karena adanya penyerapan tegas yang disebabkan oleh ikatan C=O pada daerah sekitar
1700cm-1.
Hal yang juga membingungkan, terdapat juga penyerapan yang kelihatannya
merupakan penyerapan karena ikatan tunggal C-O, yang tentunya tidak ada pada propanon. Hal
ini menyebabkan harus mencoba mengidentifikasi penyerapan-penyerapan yang ada pada
daerah sidik jari. Golongan aldehid akan mempunyai spektrum infra-merah yang sama dengan
golongan keton.
Spektrum infra-merah golongan asam hidroksil
Asam 2-hidroksipropanoat (asam laktat)

Gambar 4.9 Contoh spektrum infra merah senyawa asam laktat


Catatan: spektrum Infra-merah ini dibuat berdasarkan data yang diambil dari Spectral Data Base for Organic
Compounds (SDBS) di National Institute of Materials and Chemical Research di Jepang.

Grafik ini sangat menarik, karena mempunyai dua macam ikatan O-H dimana yang
satu terikat pada asam dan yang satunya lagi merupakan 'alkohol' yang terikat pada rantai
golongan-COOH.
Ikatan O-H dalam golongan asam timbul pada daerah sekitar 2500-3300, sedangkan
yang terikat pada rantai pada daerah sekitar 3230-3550cm-1. Bila digabungkan, akan menjadi
lembah dengan jangkauan yang sangat besar meliputi daerah 2500-3550cm-1. Binggung pada
daerah lembah tersebut akan sama seperti penyerapan yang disebabkan oleh ikatan C-H.
Perhatikan juga bahwa keberadaan ikatan C=O yang kuat pada daerah sekitar 1730cm-1.
Spektrum infra-merah amine primer
1-aminobutan

SPEKTROSKOPI INFRA MERAH

45

Gambar 4.10 Contoh spektrum infra merah senyawa 1-aminobutan

Amina primer ini mempunyai group -NH2 yang juga termasuk ikatan N-H. Penyerapan
group ini timbul pada daerah sekitar 3100-3500cm-1.Dua lembah tersebut (ciri khas amine
primer) bisa dilihat secara jelas pada spektrum sebelah kiri dari penyerapan oleh C-H.

C. Area sidik jari


Contoh sebuah spektrum infra-merah yang umum:

Setiap lembah yang dilihat pada grafik diatas adalah karena energy diserap dari
frekwensi tertentu sebuah radiasi infra-merah yang digunakan untuk mengaktivasikan ikatanikatan dalam molekul itu kepada tingkat getaran yang lebih tinggi- baik pergerakan maupun
pembelokan.
Beberapa lembah dapat digunakan dengan mudah untuk mengidentifikasi ikatan
tertentu dalam sebuah molekul. Sebagai contoh: lembah besar yang terdapat pada sebelah kiri
dari spektrum diatas digunakan untuk mengindentifikasi keberadaan ikatan oksigen-hidrogen
dalam group -OH.
Daerah di sebelah kanan diagram (sekitar 1000-1500 cm-1) biasanya mempunyai
penyerapan yang sangat beragam dan bermacam-macam. Ini adalah karena semua sifat
pembelokan getaran-getaran dalam molekul tersebut. Daerah ini biasanya disebut 'Daerah sidik
jari'
Akan jauh lebih sulit untuk membedakan ikatan-ikatan tertentu dalam area ini daripada
dalam area yang lebih 'bersih' yang berada dalam area dengan nomor gelombang yang lebih
besar. Hal penting dalam area sidik jari ini adalah setiap senyawa yang berbeda menghasilkan
pola lembah yang berbeda-beda pada spektrum bagian ini.

SPEKTROSKOPI INFRA MERAH

46

Menggunakan area sidik jari


Bedakanlah spektrum infra-merah 1-propanol dan 2-propanol. Kedua senyawa ini
mempunyai jenis dan jumlah ikatan yang sama persis. Kedua senyawa ini menghasilkan
lembah yang sama pada area sekitar 3000 cm-1, tapi coba bedakan lagi pada daerah antara
1500-500 cm-1.

Gambar 4.11 Contoh perbandingan spektrum infra merah senyawa 1-propanol dan 2-propanol
Catatan: spektrum Infra-merah ini dibuat berdasarkan data yang diambil dari Spectral Data Base for Organic
Compounds (SDBS) di National Institute of Materials and Chemical Research di Jepang.

Pola pada daerah sidik jari sangat berbeda satu dengan yang lain, karenanya hal ini
dapat digunakan untuk mengidentifikasi senyawa tersebut.
Jadi, .untuk mengetahui secara jelas sebuah senyawa yang ingin diketahui, gunakanlah
spektrum infra-merah untuk mengetahui 'jati diri' senyawa tersebut dengan mencari
penyerapan-penyerapan sinar oleh ikatan-ikatan tertentu. Dengan begitu, anda akan tahu
bahwa, untuk contoh, bahwa senyawa tersebut adalah alkohol karena ia mempunyai sebuah
group -OH.
Setelah itu anda bisa membandingkan area sidik jari dari spektrum infra-merah
senyawa itu dengan contoh spektrum yang diukur pada kondisi yang sama persis untuk
mengetahui jenis alkohol apa sebenarnya senyawa yang anda punya.
Identifikasi suatu molekul organik dapat dilakukan melalui dua tahap, pertama
penentuan gugus fungsi

SPEKTROSKOPI INFRA MERAH

47

D. Komponen Instrumen Spektroskopi IR


Spektrofotometer IR pada dasarnya sama dengan spektrofotometer UV-Vis, tetapi
sumber cahaya, detektor dan komponen optiknya sedikit berbeda. Pada spektroskopi IR,
sumber cahaya yang paling umum digunakan adalah Lampu Nerst atau Lampu Glower,
sedangkan detektor yang digunakan adalah detektor termal dan tempat sampel (sample holder)
diletakkan diantara sumber cahaya dan kromator untuk menghilangkan hamburan sinar yang
berasal dari sampel dan untuk mencegah terjadinya penguraian secara fotokimia.
Skema alat spektrofotometer IR adalah sebagai berikut :

Gambar 4.12 Skema kerja alat spektroskopi IR

Untuk ahli kimia organik, fungsi utama dari spektrofotometer IR adalah untuk
mengidentifikasi struktur molekul khususnya gugus fungsional. Dengan adanya interferometer
Michelson dan penggunaan laser sebagai sumber radiasi serta komputer untuk memproses data,
maka metode pengukuran dengan spektroskopi IR berkembang dengan adanya metode baru
yaitu FTIR (Fourier Transform Infra Red). Dengan metode ini spektroskopi IR dapat menyerap
radiasi hingga frekuensi 5000 400 cm-1. Perbedaan antara spektrofotometer FTIR dengan
spektrofotometer IR dispersi, adalah pada pengembangan sistem optiknya sebelum berkas sinar
infra red melewati contoh.
Perbedaan sistem optik antara spektroskopi IR dispersif dan spektrofotometer FTIR
terlihat seperti pada gambar berikut :

Gambar 4.13 Perbedaan sistem optik spektroskopi IR dispersif dan FTIR


SPEKTROSKOPI INFRA MERAH

48

Sistem optik dari spektrofotometer FTIR dilengkapi dengan cincin yang bergerak tegak
lurus dan cermin yang diam. Sistem optik ini bekerja atas dasar fourier transform
interferometer. Ada tiga bagian utama dari inetrferometer yaitu cermin diam (Fixed mirror),
cermin bergerak (Vibrated miror) dan cermin penjatah sinar (chopper mirror). Sinar dibagi
menjadi 2 bagian. Bagian pertama dilewatkan pada cermin diam (F) kemudian kembali,
sedangkan bagian yang lain dilewatkan pada cermin bergerak (M) dan kembali. Kedua berkas
digabung kembali di (O) kemudian dipancarkan ke sampel dan kemudian dibaca oleh detektor.

Gambar 4.14 Sistem optik spektrofotometer FTIR

Sumber sinar dan detektor


Semua spektroskopi IR memerlukan sumber sinar yang kontinyu dan detektor yang
sensitif terhadap sinar IR. Sumber sinar biasanya terdiri dari padatan inert yang dapat
dipanaskan hingga suhu antara 1500 2200 K, spektra kontinyu yang dipancarkan mendekati
aturan pancaran kotak hitam. Intensitas radiasi maksimumnya berada pad daerah 5000 cm-1.
Ada beberapa tipe sumber sinar yang dapat digunakan antara lain : Nernst Glower yang terdiri
dari oksida unsur lantanida, sumber globar yang terbuat dari batang silikon karbida dan filamen
lampu Tungsten yang merupakan sumber sinar di daerah IR dekat serta laser karbon dioksida
yang sering digunakan sebagai sumber sinar IR untuk alat monitoring polutan di atmosfir yang
dpat digunakan pada daerah radiasi 900 1100 cm-1.
Secara umum terdapat tiga detektor IR, yaitu :
1. Detektor thermal
2. Detektor pyroelectric
3. Detektor fotoconducting
Yang pertama dan kedua seringa digunakan untuk spektrometer IR dispersif, sedang detektor
fotoconducing biasanya digunakan dalam FTIR.
Tranduser photoconducting terdiri dari film tipis bahan semi konduktor.seperti PbS,
H/Cd teluroid atau indium antimonid. Bahan tersebut didepositkan pada permukaan gelas yang
diberi penutup untuk melindungi dari udara. Adanya absorpsi IR akan mempromosikan
elektron valensi non konduksi ke tingkat konduksi yang lebih tinggi, sehingga nilai tahanan
turun dan voltase luar akan berkurang apabila terjadi absorpsi radiasi.

E. Aplikasi Spektroskopi IR
Spektrometri absorpsi dan repleksi daerah IR sedang merupakan alat utama untuk
penentuan struktur senyawa organik dan biokimia. Pembagian daerah spektra IR dengan jenis
pengukuran dan analisis sampel dapat dilihat pada tabel berikut :
SPEKTROSKOPI INFRA MERAH

49

Tabel 4.1 Pembagian daerah spektra IR

Daerah spektra
IR dekat
12.800-4000 cm-1
IR sedang
4000 200 cm-1
IR jauh
200 10 cm-1

Jenis pengukuran
Difusi
Reflectan
Absorpsi
Absorpsi
Reflectan
Emisi
Absorpsi

Jenis sampel
Bahan padatan,
campuran gas

cair

Jenis Analisis
dan Kuantitatif
kualitatif

Senyawa murni padatan, cairan Kualitatif


atau gas
Kuantitatif
Sampel atmosfir
Kuantitatif
Organik
murni
atau Kualitatif
organologam

Cara penanganan sampel


Kita telah melihat bahwa pada spektrofotometri UV-vis, spektra molekul diperoleh dari
larutan yang sangat encer. Pengukuran absorban di daerah optimum diperoleh dengan mengatur
konsentrasi dan tebal larutan. Tetapi cara ini sukar diterapkan pada spektroskopi IR. Pelarut yang
baik adalah yang tidak memberikan serapan pada daerah pengukuran. Oleh karena itu penanganan
sampel dalam spektroskopi IR jauh lebih sukar dan memerlukan waktu yang tidak sedikit.
Terdapat beberapa teknik preparasi sampel untuk keperluan pengukuran IR, yaitu :
1. Sampel gas, spektra cairan dengan titik didih rendah atau gas dapat diperoleh dengan
memasukkan sampel padxa tabung silinder yang dilenghkapi dengan jendela yang transparan.
Sampel yang panjang dibuat dengan beberapa pemantul di bagian dalam sel sedemikian rupa
sehingga panjang jalan yang ditempuh sinar menjadi panjang.
2. Sampel larutan, jika mungkin dibuat larutan yang konsentrasinya diketahui seperti pada
spektrometri UV-vis, tetpi dalam IR hal ini sangat dibatasi karena tidak ada satu pelarutpun
yang transparan pada daerah IR. Air dan alkohol tidak bisa digunakn karena kuat sekali
menyerap IR, selain itu merusak garam alkali halida. Dengan alan ini juga harus digunakan
pelarut yang kering (bebas air). Window kristal NACl dan KBr sering digunakan sebagai
window untuk analisa sampel.
3. Sampel padatan, Karena sebagian besar senyawa organik menyerap di daerah IR sedang, dan
sukarnya mendapat pelarut yang cocok, maka sampel biasanya digerus sampai mencapai
ukuran tertentu dan dicampurkan dengan senyawa KBr (1:100) sampai terbetuk pelet KBr. Jika
pdatan tidak larut dalam pelarut yang transparan IR, sedangkan lat pellet KBr tidan ada, maka
bisa juga dibuat dengan teknik Mulls, yaitu dengan menggerus 2-5 mg zat dengan mineral oil
atau hidrokarbon terfluorinasi (ukuran partikel , 2 mm) yang dikenal dengan Nujol.

SPEKTROSKOPI INFRA MERAH

50

BAB V

SPEKTROSKOPI MASSA
A. Pendahuluan
Bagaimana Spektrofotometer massa bekerja?
Apabila ada sebuah benda sedang bergerak lurus dan diberikan gaya luar ke arah
samping maka benda itu tidak akan bergerak lurus, melainkan ia akan bergerak membelok ke
arah samping karena adanya gaya luar tersebut.
Misalkan anda sedang menghadapi sebuah bola meriam yang sedang melewati anda
dan anda mau membelokkannya pada saat tepat lewat di depan anda. Dan alat yang anda punya
hanyalah sebuah selang penyemprot air yang dihubungkan dengan sebuah pompa jet.
Sejujurnya, apa yang anda lakukan .itu tidak akan berpengaruh banyak. Karena bola meriam itu
sangat berat dan ia tidak akan membelok dari jalur lurusnya.
Tapi coba kita pikir lagi, anda mencoba membelokan sebuah bola tenis yang sedang
bergerak dengan kecepatan yang sama dengan bola meriam tersebut dengan menggunakan
selang penyemprot air yang sama. Karena bola tenis ini sangat ringan, maka ia akan membelok
dengan amat sangat. Berapa besar penyimpangan yang akan terjadi karena gaya luar itu,
tergantung pada massa benda tersebut (dalam hal ini bola). Apabila kecepatan bola dan
besarnya gaya luar itu diketahui, maka anda bisa menghitung massa bola tersebut jika sudah
diketahui bagaimana pola pembelokan yang terjadi pada bola tersebut. Semakin kecil
pembelokan yang terjadi, berarti semakin berat massa bola tersebut.(Perhitungan yang
sebenarnya tidaklah terlalu sulit) Prinsip diatas tersebut dapat juga diterapkan pada benda atau
partikel seukuran atom.

Garis besar tentang apa yang terjadi dalam alat spektrometer massa
Atom dapat dibelokkan dalam sebuah medan magnet (dengan anggapan atom tersebut
diubah menjadi ion terlebih dahulu). Karena partikel-partikel bermuatan listrik dibelokkan
dalam medan magnet dan partikel-partikel yang tidak bermuatan (netral) tidak dibelokkan.
Urutannya adalah sebagai berikut:
Tahap pertama : Ionisasi
Atom di-ionisasi dengan mengambil satu atau lebih elektron dari atom tersebut supaya
terbentuk ion positif. Ini juga berlaku untuk unsur-unsur yang biasanya membentuk ion-ion
negatif (sebagai contoh, klor) atau unsur-unsur yang tidak pernah membentuk ion (sebagai
contoh, argon). spektrometer massa ini selalu bekerja hanya dengan ion positif.
Tahap kedua : Percepatan
Ion-ion tersebut dipercepat supaya semuanya mempunyai energi kinetik yang sama.
Tahap ketiga : Pembelokan
Ion-ion tersebut dibelokkan dengan menggunakan medan magnet, pembelokan yang terjadi
tergantung pada massa ion tersebut. Semakin ringan massanya, akan semakin dibelokan.
Besarnya pembelokannya juga tergantung pada besar muatan positif ion tersebut. Dengan kata
lain, semakin banyak elektron yang diambil pada tahap 1, semakin besar muatan ion tersebut,
pembelokan yang terjadi akan semakin besar.

SPEKTROSKOPI MASSA

51

Tahap keempat : Pendeteksian


Sinar-sinar ion yang melintas dalam mesin tersebut dideteksi dengan secara elektrik.

Diagram lengkap dari spektrometer massa

Gambar 5.1 Skema kerja alat spektroskopi massa

Keadaan hampa udara


Penting bagi ion-ion yang telah dibuat dalam ruang ionisasi untuk dapat bergerak lurus dalam
mesin tanpa bertabrakan dengan molekul2 udara.

Gambar 5.2 Komponen ion source dalam ruang ionisasi

Ionisasi
Sampel yang berbentuk gas (vaporised sample) masuk ke dalam ruang ionisasi. Kumparan
metal yang dipanaskan dengan menggunakan listrik emelepaskanf elektron-elektron yang
ada pada sampel dan elektron-elektron lepas itu menempel pada perangkap elektron (electron
trap) yang mempunyai muatan positif. Partikel-partikel dalam sample tersebut (atom atau
molekul) dihantam oleh banyak sekali elektron-elektron, dan beberapa dari tumbukan tersebut
mempunyai energi cukup untuk melepaskan satu atau lebih elektron dari sample tersebut
sehingga sample tersebut menjadi ion positif.
SPEKTROSKOPI MASSA

52

Kebanyakan ion-ion positif yang terbentuk itu mempunyai muatan +1 karena akan jauh lebih
sulit untuk memindahkan elektron lagi dari sample yang sudah menjadi ion positif. Ion-ion
positif yang terbentuk ini diajak keluar dan masuk ke bagian mesin yang merupakan sebuah
lempengan metal yang bermuatan positif (Ion repellel).
Tambahan: Seperti yang anda akan lihat sebentar lagi, seluruh ruang ionisasi ini dilakukan
dengan menggunakan tegangan listrik positif yang besar (10.000 V). Ketika kita berbicara
tentang kedua lempengan bermuatan positif, berarti lempengan tersebut mempunyai muatan
lebih dari 10.000 V.
Percepatan

Gambar 5.3 Model akselerator ion

Ion-ion positif yang ditolak dari ruang ionisasi yang sangat positif itu akan melewati 3
celah, dimana celah terakhir itu bermuatan 0 V. Celah yang berada di tengah mempunyai
voltase menengah. Semua ion-ion tersebut dipercepat sampai menjadi sinar yang sangat
terfokus.
Pembelokkan

Ion yang berbeda-beda akan dibelokkan secara berbeda pula oleh medan magnet. Besarnya
pembelokan yang dialami oleh sebuah ion tergantung pada:
* Massa ion tersebut.
Ion-ion yang bermassa ringan akan dibelokkan lebih daripada ion-ion yang bermassa berat.
* Muatan ion.

SPEKTROSKOPI MASSA

53

Ion yang mempunyai muatan +2 (atau lebih) akan dibelokkan lebih daripada ion-ion yang
bermuatan +1. Dua faktor diatas digabungkan ke dalam Perbandingan Massa/Muatan.
Perbandingan ini mempunyai simbol m/z (atau m/e) Sebagai contoh: Apabila sebuah ion
mempunyai massa 28 dan bermuatan +1, maka perbandingan massa/muatan ion tersebut adalah
28. Ion yang mempunyai massa 56 dan bermuatan +2 juga mempunyai perbandingan
massa/muatan yang sama yaitu 28.
Pada gambar di atas, sinar A mengalami pembelokkan yang paling besar, yang berarti
sinar tersebut terdiri dari ion-ion yang mempunyai perbandingan massa/muatan yang terkecil.
Sedangkan sinar C mengalami pembelokkan yang paling kecil, berarti ia terdiri dari ion-ion
yang mempunyai perbandingan massa/muatan yang paling besar. Akan jauh lebih mudah
untuk membahas masalah ini jika kita menganggap bahwa muatan semua ion adalah +1.
Hampir semua ion-ion yang lewat dalam spektrometer massa ini bermuatan +1, sehingga
besarnya perbandingan massa/muatannya akan sama dengan massa ion tersebut.
Pendeteksian
Pada gambar diatas, hanya sinar B yang bisa terus melaju sampai ke pendetektor ion. Ion-ion
lainnya bertubrukan dengan dinding dimana ion-ion akan menerima elektron dan dinetralisasi.
Pada akhirnya, ion-ion yang telah menjadi netral tersebut akan dipisahkan dari spektrometer
massa oleh pompa vakum.

Gambar 5.4 Detektor spektroskopi massa

Ketika sebuah ion menubruk kotak logam, maka ion tersebut akan dinetralisasi oleh
elektron yang pindah dari logam ke ion (gambar kanan). Hal ini akan menimbulkan ruang
antara elektron-elektron yang ada dalam logam tersebut, dan elektron-elektron yang berada
dalam kabel akan mengisi ruang tersebut. Aliran elektron di dalam kabel itu dideteksi sebagai
arus listrik yang bisa diperkuat dan dicatat. Semakin banyak ion yang datang, semakin besar
arus listrik yang timbul.
Mendeteksi ion-ion lainnya.
Bagaimana ion-ion lainnya dapat dideteksi - padahal sinar A dan sinar B sudah tidak ada lagi
dalam mesin?
Ingat bahwa sinar A dibelokkan paling besar, berarti ia mempunyai nilai m/z yang paling
kecil(ion yang paling ringan bila bermuatan +1) Untuk membuat sinar ini sampai ke detektor
ion, anda perlu membelokkan sinar tersebut dengan menggunakan medan magnet yang lebih
kecil(gaya luar yang lebih kecil).

SPEKTROSKOPI MASSA

54

Untuk membuat ion-ion yang mempunyai nilai m/z yang besar(ion yang berat bila bermuatan
+1) sampai ke detektor ion, maka anda perlu membelokkannya dengan menggunakan medan
magnet yang lebih besar.
Dengan merubah besarnya medan magnet yang digunakan, maka anda bisa membawa
semua sinar yang ada secara bergantian ke detektor ion, dimana disana ion-ion tersebut akan
menimbulkan arus listrik dimana besarnya berbanding lurus dengan jumlah ion yang datang.
Massa dari semua ion yang dideteksi itu tergantung pada besarnya medan magnet yang
digunakan untuk membawa sinar tersebut ke detektor ion. Mesin ini dapat disesuaikan untuk
mencatat arus listrik (yang merupakan jumlah ion-ion) dengan m/z secara langsung. Massa
tersebut diukur dengan menggunakan skala 12C.
Tambahan: Skala 12C adalah skala dimana isotop 12C mempunyai berat tepat 12 unit.

B. Bentuk output dari spektrometer massa


Hasil dari pencatat diagram disederhanakan menjadi diagram garis. Ini menunjukkan
arus listrik yang timbul oleh beragam ion yang mempunyai perbandingan m/z masing2.
Diagram garis Molybdenum (Mo) adalah sebagai berikut:

Gambar 5.5 Bentuk output spektroskopi massa

Garis tegak lurus itu menunjukkan besarnya arus listrik yang diterima oleh alat
pencatat arus yang berarti banyaknya ion datang ke detektor. Seperti yang anda bisa lihat dari
diagram diatas, ion yang paling banyak adalah ion yang mempunyai perbandingan m/z 98. Ionion lainnya mempunyai perbandingan m/z 92,94,95,96,97 dan 100.
Ini berarti molybdenum mempunyai 7 macam isotop. Dengan menganggap bahwa
semua ion tersebut bermuatan +1 maka berarti massa dari ketujuh isotop tersebut adalah
92,94,95,96,97 ,98 dan 100.
Tambahan: Bila ada ion bermuatan +2 , maka anda akan tahu karena semua garis yang ada pada diagram diatas
akan mempunyai garis lain dengan besar 1/2 dari nilai m/z (karena, sebagai contoh, 98/2=49). Garis-garis itu akan
jauh lebih sedikit daripada garis ion +1 karena kemungkinan terbentuknya ion +2 adalah jauh lebih kecil bila
dibandingkan dengan kemungkinan terbentuknya

C. Pola Fragmentasi Pada Spektra Massa Senyawa Organik


Bagian ini akan membahas bagaimana pola fragmentasi dibentuk ketika molekul
organik dimasukkan ke dalam spektrometer massa, dan bagaimana anda mendapatkan
informasi dari suatu spektrum massa.
Asal-usul pola fragmentasi (Pembentukan ion molekuler)

SPEKTROSKOPI MASSA

55

Ketika sampel organik yang teruapkan melewati kamar ionisasi spektrometer massa,
uap akan ditembak oleh berkas elektron. Elektron-elektron ini mempunyai energi yang cukup
untuk mengeluarkan sebuah elektron dari molekul organik untuk membentuk ion positif. Ion
ini disebut ion molekuler - kadang disebut juga ion induk.
Ion molekuler disimbolkan dengan M+ atau
- titik pada versi yang kedua
menunjukkan fakta bahwa pada ion tersebut terdapat elektron tunggal tak berpasangan.
Merupakan setengah dari pasangan elektron dalam keadaan normal - setengah yang lain
dihilangkan pada proses ionisasi.
Fragmentasi
Ion-ion molekuler tidak stabil secara energetika, dan beberapa diantaranya akan
terpecah menjadi bagian-bagian yang lebih kecil. Contoh paling sederhana adalah sebuah ion
molekuler pecah menjadi dua bagian - satu bagian ion positif, dan bagian lain berupa radikal
bebas tak bermuatan.

Radikal bebas tak bermuatan tidak akan menghasilkan garis pada spektrum massa.
Hanya partikel-partikel bermuatan yang akan dipercepat, dibelokkan, dan dideteksi oleh
spektrometer massa. Partikel tak bermuatan ini akan dengan mudah hilang dalam mesin
akhirnya, terbuang ke pompa vakum. Ion, X+, akan berjalan melalui spektrometer massa seperti
ion positif yang lain - dan akan menghasilkan sebuah garis pada diagram.
Semua daftar fragmentasi dari ion molekuler awal adalah mungkin dan artinya anda
akan mendapatkan seluruh garis pada spektrum massa. Sebagai contoh, spektrum massa
pentana terlihat seperti ini:

Gambar 5.6 Spektrum massa dari senyawa pentana

Adalah penting untuk memahami bahwa pola garis pada spektrum massa senyawa
organik menceritakan sesuatu yang sedikit berbeda dari pola garis pada spektrum massa unsur.
Untuk unsur, tiap garis menunjukkan isotop yang berbeda dari unsur tersebut. Untuk senyawa,
tiap garis menunjukkan fragmen/pecahan yang berbeda yang dihasilkan ketika ion molekuler
pecah.
Puncak ion molekuler dan puncak dasar
Pada diagram spektrum massa pentana, garis yang dihasilkan oleh ion paling berat
yang melewati mesin (pada m/z = 72) adalah garis untuk ion molekuler. Garis paling tinggi
pada diagram (dalam contoh ini pada m/z = 43) disebut puncak dasar.Biasanya diberi tinggi
100, dan tinggi yang lainnya dihitung relatif terhadap puncak dasar. Puncak dasar adalah
SPEKTROSKOPI MASSA

56

puncak yang paling tinggi karena menunjukkan ion fragmen yang paling banyak terbentuk selain itu karena ada beberapa cara dimana ia dapat dihasilkan selama fragmentasi dari ion
induk, atau karena ia merupakan ion yang stabil.
Menggunakan pola fragmentasi
Bagian ini akan mengabaikan pengetahuan yang dapat anda peroleh dari ion molekuler. Itu
dibahas dalam tiga bagian lain yang anda dapatkan pada menu spektrometri massa. Anda akan
menemukan link pada akhir halaman.
Mengamati ion yang menghasilkan garis
Ini biasanya merupakan sesuatu yang paling sederhana yang ditanyakan kepada anda. Misalnya
pada spektrum massa pentana.

Apakah yang menyebabkan garis pada m/z = 57? Berapa banyak atom karbon yang ada dalam
ion ini? Tidak mungkin 5 karena 5 x 12 = 60. Bagaimana dengan 4? 4 x 12 = 48. Sisa 9 untuk
mencapai 57. Bagaimana dengan C4H9+? C4H9+ dapat dituliskan [CH3CH2CH2CH2]+, dan ini
dapat dihasilkan melalui fragmentasi berikut:

Radikal metil yang dihasilkan akan dengan mudah hilang dalam mesin. Garis pada m/z
= 43 dapat dikerjakan dengan cara yang sama. Jika anda mengutak-atik angkanya, anda akan
menemukan bahwa ini berhubungan dengan pemecahan yang menghasilkan ion 3-karbon:

Garis pada m/z = 29 adalah khas untuk ion etil, [CH3CH2]+:

Garis lain pada spektrum massa lebih sulit untuk diterangkan. Sebagai contoh, garis dengan
nilai m/z lebih kecil 1 atau 2 dari garis-garis yang mudah, sering disebabkan oleh hilangnya
satu atau lebih atom hidrogen selama proses fragmentasi. Anda sangat tidak menyukai jika
diminta untuk menjelaskannya tetapi ini merupakan contoh yang paling mudah dimengerti
dalam ujian level A.

SPEKTROSKOPI MASSA

57

Spektrum massa pentan-3-on

Gambar 5.7 Spektrum massa 3-pentanon

Sekarang puncak dasar ( puncak paling tinggi - dan juga ion fragmen paling umum)
adalah pada m/z = 57. Tetapi ini bukan dihasilkan oleh ion yang sama seperti puncak dengan
nilai m/z yang sama pada pentana. Jika anda ingat, puncak m/z = 57 dalam pentana dihasilkan
oleh [CH3CH2CH2CH2]+. Jika anda melihat struktur pentan-3-on, tidak mungkin mendapatkan
fragmen yang sama. Cari dengan cara memotong molekul sedikit demi sedikit sampai
mendapatkan 57. Dengan sedikit kesabaran, anda akhirnya akan mendapatkan [CH3CH2CO]+ yang dihasilkan dari fragmentasi ini:

Anda akan mendapatkan hasil yang sama, dimanapun anda memecah ion molekuler, di sisi kiri
maupun kanan gugus CO. Puncak m/z = 29 dihasilkan oleh ion etil - yang sekali lagi dapat
dibentuk dengan memecah ion molekuler pada bagian lain gugus CO.

Tinggi puncak dan stabilitas ion


Ion yang lebih stabil akan lebih disukai pembentukannya. Makin banyak ion yang
terbentuk, makin tinggi puncaknya. Kita akan melihat dua contoh yang umum untuk hal ini.
Contoh yang melibatkan karbokation (ion karbonium)
Urutan stabilitas karbokation
primer < sekunder < tersier
Menerapkan logika ini untuk pola fragmentasi, artinya bahwa pemecahan yang
menghasilkan karbokation sekunder akan lebih berhasil dibanding primer. Pemecahan yang
menghasilkan karbokation tersier akan lebih disukai lagi.
Sekarang lihatlah pada spektrum massa 2-metilbutana. 2-metilbutana adalah isomer
dari pentana - isomer adalah molekul dengan rumus molekul sama, tetapi berbeda dalam
pengaturan susunan atom-atomnya.

SPEKTROSKOPI MASSA

58

Gambar 5.8 Spektrum massa 2-metil butana

Pertama lihatlah pada puncak yang sangat kuat pada m/z = 43. Ini disebabkan oleh ion
yang berbeda, tak ada hubungannya dengan puncak dalam spektrum massa pentana. Puncak ini
dalam 2-metilbutana disebabkan oleh:

Ion yang terbentuk adalah karbokation sekunder - mempunyai dua gugus alkil yang
menempel pada karbon yang bermuatan positif. Ini relatif stabil.
Puncak pada m/z = 57 lebih tinggi daripada garis yang ada pada pentana. Sekali lagi
karbokation dibentuk - sekarang, dengan:

Anda akan mendapatkan ion yang sama, tentu, jika tangan kiri gugus CH3 pecah tanpa
bagian bawah seperti yang kita gambarkan.
Dua spektra berikut, mungkin merupakan contoh paling menarik dari stabilitas
karbokation sekunder.
Contoh yang melibatkan ion asilium, [RCO]+
Ion dengan muatan positif pada karbon dari gugus karbonil, C=O, juga relatif stabil. Ini
terlihat sangat jelas dalam spektra massa keton seperti pentan-3-on.

Gambar 5.9 Spektrum massa 3-pentanon


SPEKTROSKOPI MASSA

59

Puncak dasar, pada m/z=57, disebabkan oleh ion [CH3CH2CO]+. Kita telah
membicarakannya pada fragmentasi yang menghasilkan ini.
1. Menggunakan spektra massa untuk membedakan antar senyawa
Andaikan anda diminta untuk menunjukkan cara membedakan antara pentan-2-on dan
pentan-3-on menggunakan spektra massanya.
pentan-2-on
pentan-3-on

CH3COCH2CH2CH3
CH3CH2COCH2CH3

Masing-masing akan terpecah untuk menghasilkan ion dengan muatan positif pada gugus CO.
Pada kasus pentan-2-on, ada dua ion yang berbeda:

[CH3CO]+
[COCH2CH2CH3]+

Yang akan memberikan garis yang kuat pada m/z = 43 dan 71.
Dengan pentan-3-on, anda hanya akan mendapatkan satu ion yang sejenis:

[CH3CH2CO]+

Anda akan mendapatkan garis yang kuat pada 57.


Anda tak perlu khawatir dengan garis-garis lain pada spektra - garis 43, 57, dan 71 memberikan
anda banyak perbedaan diantara keduanya. Garis 43 dan 71 tidak ada pada spektrum pentan-3on, dan garis 57 tidak ada pada spektrum pentan-2-on.
Kedua spektra terlihat seperti ini:

Gambar 5.10 Perbedaan spektrum massa 2-pentanon dan 3-pentanon

SPEKTROSKOPI MASSA

60

Pencocokan komputer terhadap spektra massa


Seperti yang anda lihat, spektrum massa senyawa organik, bahkan yang sangat mirip
pun, akan berbeda karena fragmentasi yang berbeda dapat terjadi. Tersedia bagi anda basis data
spektra massa, beberapa spektrum yang tak diketahui dapat dianalisis dengan komputer dan
dicocokkan dengan basis data.

SPEKTROSKOPI MASSA

61

BAB VI

SPEKTROSKOPI SERAPAN ATOM


A. Pendahuluan
Dalam kimia analitik instrumen, spektroskopi serapan atom (SSA) adalah suatu teknik
yang sering digunakan untuk menentukan konsentrasi logam tertentu dalam suatu sampel. Teknik
ini dapat digunakan untuk menganalisis konsentrasi lebih dari 70 jenis logam yang berbeda dalam
suatu spesi larutan. Spektroskopi serapan atom dipergunakan untuk mengidentifikasi dan
menentukan keberadaan ion logam baik secara kualitatif maupun kuantitatif dalam semua jenis
materi dan larutan. Pengukuran dalam spektroskopi serapan atom ini didasarkan pada radiasi yang
diserap oleh atom yang tidak tereksitasi dalam bentuk uap.
Spektroskopi serapan atom mulai dikembangkan pada tahun 1950-an oleh Alan Walsh dan
beberapa orang ahli kimiawan Australia yang bekerja di CSIRO (Commonwealth Science and
Industry Research Organisation) Divisi Kimia Fisika di Melbourne Australia.
Penyerapan energi radiasi oleh suatu unsur sebagai fungsi konsentrasi unsur dalam nyala
merupakan dasar spektroskopi serapan atom. Untuk beberapa unsur seperti logam alkali Na dan K,
nyala udara asetilen cukup panas tidak hanya menghasilkan atom-atom dalam keadaan dasar tetapi
juga menaikkan jumlah atom ke keadaan elektronik tereksitasi. Energi radiasi dipancarkan
(diemisikan) jika atom-atom kembali ke keadaan dasar yang sebanding dengan konsentrasi dan
merupakan dasar spektroskopi emisi nyala.

- E Light
e

Mo

+E

M*

-E

Mo

back to ground state


Gambar 6.1 Penyerapan energi radiasi oleh suatu unsur menyebabkan electron tereksitasi
dan kembali ke keadaan dasar dengan mengemisikan cahaya.

B. Prinsip analisa spektrofotometri serapan atom


Prinsip analisis dengan SSA adalah interaksi antara energi radiasi dengan atom unsur yang
dianalisis. Atom suatu unsur akan menyerap energi dan terjadi eksitasi atom ke tingkat energi yang
lebih tinggi. Keadaan ini tidak stabil dan akan kembali ke tingkat dasar dengan melepaskan
sebagian atau seluruh tenaga eksitasinya dalam bentuk radiasi. Frekuansi radiasi yang dipancarkan
karakteristik untuk setiap unsur dan intensitasnya sebanding dengan jumlah atom yang tereksitasi
SPEKTROSKOPI SERAPAN ATOM

62

yang kemudian mengalami deeksitasi. Teknik ini dikenal dengan SEA (spektrofotometer emisi
atom). Untuk SSA keadaan berlawanan dengan cara emisi yaitu, populasi atom pada tingkat dasar
dikenakan seberkas radiasi, maka akan terjadi penyerapan energi radiasi oleh atom-atom yang
berada pada tingkat dasar tersebut. Penyerapan ini menyebabkan terjadinya pengurangan intensitas
radiasi yang diberikan. Pengurangan intensitasnya sebanding dengan jumlah atom yang berada
pada tingkat dasar tersebut.
Dalam teknik analisa SSA, larutan sampel diaspirasikan ke suatu nyala dan unsur-unsur di
dalam sampel diubah menjadi uap atom sehingga nyala rnengandung atom unsur-unsur yang
dianalisis. Beberapa diantara atom akan tereksitasi secara termal oleh ayala, tetapi kebanyakan
atom tetap tinggal sebagai atom netral dalam keadaan dasar (ground state). Atom-atom ground state
ini kemudian menyerap radiasi yang diberikan oleh sumber radiasi yang terbuat dari unsur-unsur
yang bersangkutan. Panjang gelombang yang dihasilkan oleh sumber radiasi adalah sama dengan
panjang gelombang yang diabsorpsi oleh atom dalam nyala. Absorpsi ini mengikuti hukum
Lambert-Beer. yakni absorbansi berbanding lurus dengan panjang uyala yang dilalui sinar dan
konsentrasi uap atom dalam nyala. Kedua variabel ini sulit untuk ditentukan tetapi panjang nyala
dapat dibuat konstan sehingga absorbansi hanya berbanding langsung dengan konsentrasi analit
dalam larutan sampel. Teknik-teknik analisisnya sama seperti pada spektrofotometri UV -Vis yaitu
standar tunggal, kurva kalibrasi dan kurva adisi standar.
Teknik serapan biasanya disertai pemasukan suatu larutan sampel dalam bentuk aerosol
dalam nyala. Evaporasi pelarut dan penguapan garam terjadi terlebih dahulu untuk mendisosiasi
garam ke dalam atom-atom gas yang bebas. Pada suhu udara asetilen ( kurang lebih 23000 C ) atom
dari sejumlah banyak unsur berada dalam keadaan dasar. Jika seberkas energi radiasi yang terdiri
dari spectrum emisi untuk unsur tertentu yang akan ditentukan dilewatkan melalui nyala ini,
sejumlah atom dalam keadaan dasar akan menyerap energi dari panjang gelombang yang
karakteristik (garis resonansi) dan mencapai keadaan energi yang lebih tinggi.
Suatu sample pertama-tama harus dilarutkan, proses pelarutan dikenal dengan istilah destruksi yang
bertujuan untuk membuat unsur logam menjadi ion logam yang bebas. Terdapat 2 cara destruksi
yaitu:
1) Destruksi basah : sample ditambahkan asam-asam oksidator, jika perlu dilakukan dengan
pemanasan.
2) Destruksi kering : sample langsung dipanaskan untuk diabukan.
Hasil destruksi baik secara basah maupun kering kemudian dilarutkan. Larutan sample
dimasukkan ka dalam nyala dalam bentuk aerosol yang selanjutnya akan membentuk atomatomnya. Serapan akan terjadi dari radiasi suatu sinar yang sesuai dengan atom yang ditentukan.
Pancaran atau emisi energi radiasi dan emisi nyala atau energi radiasi lampu eksternal yang
tidak bisa hilang oleh serapan atom akan di dispersi oleh monokromator dan dideteksi oleh foto
multifier, dirumuskan oleh persamaan Boltzman sebagai berikut :
Ej

Nj Pj

exp kT .....................................................................................*)
No Po
K = tetapan Boltzman
T = suhu nyala dalam Kelvin
Ej = perbedaan energi dalam energi dari tingkat tereksitasi dasar
Nj = jumlah atom pada tingkat tereksitasi
No = jumlah atom dalam tingkat dasar
Pj dan Po = factor statistic yang ditentukan oleh jumlah tingkat yang mempunyai
energi yang sama dari atom yang tereksitasi dan pada tingkat dasar.
Persamaan di atas memberikan informasi bahwa dengan atomisasi dan suhu maka terdapat
2 kemungkinan yaitu keadaan tereksitasi dan keadaan dasar. Pada analisis spektroskopi serapan
atom ini banyak digunakan untuk analisis atom-atom dari golongan alkali dan alkali tanah hal ini
karena kemudahan dari atom-atom tersebut tereksitasi. Pada dasarnya jika diringkas, bila suatu
larutan yang mengandung senyawa yang cocok dari logam yang akan diselidiki itu dihembus ke
dalam nyala, terjadi peristiwa berikut secara berurutan dengan cepat yaitu :
a) Pengisatan pelarut yang meninggalkan residu padat
SPEKTROSKOPI SERAPAN ATOM

63

b) Penguapan zat padat dengan disosiasi menjadi atom-atom penyusunnya, yang mula-mula
akan berada dalam keadaan dasar
c) Beberapa atom dapat tereksitasi oleh energi termal (dari) nyala ke tingkatan-tingkatan
energi yang lebih tinggi dan mencapai kondisi dimana mereka akan memancarkan energi.

Gambar 6.2 Skema kerja alat Spektroskopi Serapan Atom (SSA)

C. Sistem Atomisasi
1. Sistem Atomisasi Nyala
Setiap alat spektrometri atom akan mencakup dua komponen utama sistem introduksi
sampel dan sumber (source) atomisasi. Untuk kebanyakan instrumen sumber atomisasi ini
adalah nyala dan sampel di introduksikan dalarn bentuk larutan. Sampel masuk ke nyala dalam
bentuk aerosol. Aerosol biasanya dihasilkan oleh Nebulizer (pengabut) yang dihubungkan ke
nyala oleh ruang penyemprot (chamber spray).
Ada banyak variasi nyala yang telah diapakai bertahun-tahun untuk spektrometri atom. Namun
demikian. yang saat ini menonjol dan dipakai secara luas untuk pengukuran analitik adalah
udara-asetilen dan nitrous oksida- asetilen. Dengan kedua jenis nyala ini, kondisi analisis yang
sesuai untuk kebanyakan ana!it (unsur yang dianalisis) dapat ditentukan dengan menggunakan
metode-metode emisi, absorbsi dan juga fluoresensi.
1) Nyala udara-asetilen
Biasanya menjadi pilihan untuk analisis menggunakan AAS,. temperarur nyala-nya yang lebih
rendah mendorong terbentuknya atom netral dan dengan nyala yang kaya bahan bakar
pembentukan oksida dari banyak unsur dapat diminimalkan.
2) Nitrous oksida-asetilen
Dianjurkan dipakai untuk penentuan unsur-unsur yang mudah membentuk oksida dan sulit
terurai. Hal ini disebabkan temperatur nyala yang dihasilkan relative tinggi. Unsur-unsur
tersebut adalah: Al, B, Mo, Si, So, Ti, V danW.
Proses atomisasi adalah proses pengubahan sample dalam bentuk larutan menjadi
spesies atom dalam nyala. Proses atomisasi ini akan berpengaruh terhadap hubungan antara
konsentrasi atom analit dalam larutan dan sinyal yang diperoleh pada detektor dan dengan
demikian sangat berpengaruh terhadap sensitivitas analisis. Langkah-langkah proses atomisasi
SPEKTROSKOPI SERAPAN ATOM

64

melibatkan hal-hal kunci sebagaimana diberikan pada Gambar 3. Secara ideal fungsi dari
sistem atomisasi (source) adalah :
1) Mengubah sembarang jenis sampel menjadi uap atom fasa-gas dengan sedikit perlakuan
atau tanpa perIakuan awal.
2) Me!akukan seperti pada point 1) untuk semua elemen (unsur) dalam sampel pada semua
level konsentrasi.
3) Agar diperoleh kondisi operasi yang identik untuk setiap elemen dan sampel.
4) Mendapatkan sinyal analitik sebagai fungsi sederhana dari konsentrasi tiap-tiap elemen.
yakni agar gangguan(interfererisi) dan penganih matriks (media) sampel menjadi
minimal. "
5) Memberikan analisis yang teliti (precise) dan tepat (accurate).
6) Mendapatkan harga beli, perawatan dan pengoperasian yang murah.
7) Memudahkan operasi.

2. Sistem atomisasi dengan elektrothermal (tungku)


Sistem nyala api ini lebih dikenal dengan nama GF-AAS (Graffit furnace- Atomic
Adsorption Spectrofotometer). GFAAS dapat mengatasi kelemahan dari sistem nyala seperti,
sensitivitas, jumlah sampel dan penyiapan sampel. Ada tiga tahap atomisasi dengan tungku
yaitu:
a. Tahap pengeringan atau penguapan larutan
b. Tahap pengabuan atau penghilangan senyawa-senyawa organik dan
c. Tahap atomisasi
Unsur-unsur yang dapat dianalsis dengan menggunakan GFAAS adalah sama dengan
unsur-unsur yang dapat dianalisis dengan sistem nyala. Beberapa unsur yang sama sekali tidak
dapat dianalisis dengan GFAAS adalah tungsten, Hf, Nd, Ho, La, Lu, Os, Br, Re, Sc, Ta, U, W,
Y dan Zr, hal ini disebabkan karena unsur tersebut dapat bereaksi dengan graphit.
Petunjuk praktis penggunaan GFAAS:
1. Jangan menggunakan media klorida, lebih baik gunakan nitrat
2. Sulfat dan fosfat bagus untuk pelarut sampel, biasanya setelah sampel ditempatkan dalam
tungku.
3. Gunakan cara adisi sehingga bila sampel ada interferensi dapat terjadi pada sampel dan
standard.

D. Instrumentasi SSA
Karena komponen lain dalam instrumentasi AAS telah disinggung sebelumnya kecuali
hollow cathode lamp: HCL (Iampu katoda cekung), maka selanjutnya hanya akan dibahas
komponen HCL yang merupakan kunci berkembang pesatnya AAS dan sekaligus penjelasan
mengapa metode AAS merupakan metode analsis yang sangat selektif.

Lampu HCL (Hollow Chatode Lamp)


Lampu ini merupakan sumber radiasi dengan spektra yang tajam dan mengemisikan
gelombang monokhromatis. Lampu ini terdiri dari katoda cekung yang silindris yang terbuat
dari unsur yang akan ditentukan atau campurannya (alloy) dan anoda yang terbuat dari
tungsten. Elektroda-elektroda ini berada dalam tabung gelas dengan jendela quartz karena
panjang gelombang emisinya sering berada pada daerah ultraviolet. Tabung gelas tersebut
dibuat bertekanan rendah dan diisi dengan gas inert Ar atau Ne. Beda voltase yang cukup
tinggi dikenakan pada kedua elektroda tersebut sehingga atom gas pada anoda terionisasi. Ion
positif ini dipercepat kearah katoda dan ketika menabrak katoda menyebabkan beberapa logam
pada katoda terpental dan berubah menjadi uap, Atom yang teruapkan ini, karena tabrakan
dengan ion gas yang berenergi tinggi, tereksitasi ke tingkat energi elektron yang lebih tinggi;
ketika kembali ke keadaan dasar atom-atom tersebut memancarkan sinar dengan yang
SPEKTROSKOPI SERAPAN ATOM

65

karakteristik untuk unsur katoda tersebut. Berkas sinar yang diemisikan bergerak melalui nyala
dan berkas dengan tertentu yang dipilih dengan monokromator akan diserap oleh uap atom
yang ada dalam nyala yang berasal dari sampel. Sinar yang diabsorpsi paling kuat biasanya
adalah sinar yang berasal dart transisi elektron ke tingkat eksitasi terendah. Sinar ini disebut
garis resonansi.
Sumber radiasi lain yang sering digunakan adalah "Electrodless Discharge Lamp ".
Lampu ini mempunyai prinsip kerja hampir sama dengan HCL, tetapi mempunyai output
radiasi lebih tinggi dan biasanya digunakan untuk analisis unsur-unsur As dan Se, karena
lampu HCL untuk unsur-unsur ini mempunyai sinyal yang lemah dan tidak stabil.
E.

Metode Analisis
Ada tiga teknik yang biasa dipakai dalam analisis secara spektrometri. Ketiga teknik tersebut
antara lain adalah :
(1) Metoda Standar Tunggal
Metoda ini sangat praktis karena hanya menggunakan satu larutan standar yang telah
diketahui konsentrasinya (Cstd). Selanjutnya absorbsi larutan standar (Astd) dan absorbsi
larutan sampel (Asmp) diukur dengan Spektrofotometri. Dari hukum Lambert-Beer diperoleh :

Astd = .b.Cstd Asmp =.b.Csmp


.b = Astd/ Cstd
.b = Asmp/Csmp
sehingga,
Astd/Cstd = Csmp /Csmp Csmp = (Asmp/Astd) X Cstd

Dengan mengukur Absorbansi larutan sampel dan standar, konsentrasi larutan sampel dapat
dihitung.
(2) Metode Kurva Kalibrasi
Dalam metode ini dibuat suatu seri larutan standar dengan berbagai konsentrasi dan
absorbansi dari larutan tersebut diukur dengan AAS. Langkah selanjutnya adalah membuat
grafik antara konsentrasi (C) dengan Absorbansi (A) yang akan merupakan garis lurus
melewati titik nol dengan slope = .b atau slope = a.b. Konsentrasi larutan sampel dapat dicari
setelah absorbansi larutan sampel diukur dan diintrapolasi ke dalam kurva kalibrasi atau
dimasukkan ke dalam persamaan garis lurus yang diperoleh dengan menggunakan program
regresi linear pada kurva kalibrasi.
(3) Metoda Standar Adisi
Metoda ini dipakai secara luas karena mampu meminimalkan kesalahan yang
disebabkan oleh perbedaan kondisi lingkungan (matriks) sampel dan standar. Dalam metoda ini
dua atau lebih sejumlah volume tertentu dari sampel dipindahkan ke dalam labu takar. Satu
larutan diencerkan sampat volume tertentu kemudian diukur absorbansinya tanpa ditambah
dengan zat standar, sedangkan larutan yang lain sebelum diukur absorbansinya ditambah
terlebih dulu dengan sejumlah tertentu tarutan standar dan diencerkan seperti pada larutan yang
pertama. Menurut hukum Beer akan berlaku hal-hal berikut :
Ax = k.Cx

AT = k(Cs + Cx)

Dimana.,
Cx = konsentrasi zat sample
Cs = konsentrasi zat standar yang ditambahkan ke larutan sampel
Ax = Absorbansi zat sampel (tanpa penambahan zat standar)
Ar = Absorbansi zat sampel + zat standar

SPEKTROSKOPI SERAPAN ATOM

66

Jika kedua persarnaan diatas digabung akan diperoleh:


Cx = Cs x {Ax/(AT - Ax)}
Konsentrasi zat dalam sampel (Cx) dapat dihitung dengan mengukur Ax dan AT dengan
spektrofotometer. Jika dibuat suatu seri penambahan zat standar dapat pula dibuat suatu grafik
antara AT lawan Cs, garis lurus yang diperoleh diekstrapolasi ke AT = 0, sehingga diperoleh:
Cx = Cs x {Ax/(O - Ax)} ; Cx = Cs x (Ax /-Ax)
Cx = Cs x ( -1) atau Cx = - Cs

F. Gangguan Dalam Analisis Dengan SSA


Ada tiga gangguan utama dalam SSA :
(1) Gangguan ionisasi
(2) Gangguan akibat pembentukan senyawa refractory (tahan panas)
(3) Gangguan fisik alat.
Gangguan lonisasi: Gangguan ini biasa terjadi pada unsur alkali dan alkali tanah dan
beberapa unsur yang lain karena unsur-unsur tersebut mudah terionisasi dalam nyala. Dalam
analisis dengan FES dan AAS yang diukur adalah emisi dan serapan atom yang tidak
terionisasi. Oleh sebab itu dengan adanya atom-atom yang terionisasi dalam nyala akan
mengakibatkan sinyal yang ditangkap detek'tor menjadi berkurang. Namun demikian gangguan
ini bukan gangguan yang sifatnya serius, karena hanya sensitivitas dan linearitasnya saja yang
terganggu. Gangguan ini dapat diatasi dengan menambahkan unsur-unsur yang mudah
terionisasi ke dalam sampel sehingga akan menahan proses ionisasi dari unsur yang dianalisis.
Pembentukan Senyawa Refraktori: Gangguan ini diakibatkan oleh reaksi antara analit
dengan senyawa kimia, biasanya anion yang ada dalam larutan sampel sehingga terbentuk
senyawa yang tahan panas (refractory). Sebagai contoh, pospat akan bereaksi dengan kalsium
dalam nyala menghasilkan kalsium piropospat (CaP2O7). Hal ini menyebabkan absorpsi
ataupun emisi atom kalsium dalam nyala menjadi berkurang. Gangguan ini dapat diatasi
dengan menambahkan stronsium klorida atau lantanum nitrat ke dalam tarutan. Kedua logam
ini lebih mudah bereaksi dengan pospat dihanding kalsium sehingga reaksi antara kalsium
dengan pospat dapat dicegah atau diminimalkan. Gangguan ini juga dapat dihindari dengan
menambahkan EDTA berlebihan. EDTA akan membentuk kompleks chelate dengan kalsium,
sehingga pembentukan senyawa refraktori dengan pospat dapat dihindarkan. Selanjutnya
kompleks Ca-EDTA akan terdissosiasi dalam nyala menjadi atom netral Ca yang menyerap
sinar. Gangguan yang lebih serius terjadi apabi!a unsur-unsur seperti: AI, Ti, Mo,V dan lainlain bereaksi dengan O dan OH dalam nyala menghasilkan logam oksida dan hidroksida yang
tahan panas. Gangguan ini hanya dapat diatasi dengan menaikkan temperatur nyala., sehingga
nyala yang urnum digunakan dalam kasus semacam ini adalah nitrous oksida-asetilen.
Gangguan Fisik Alat : yang dianggap sebagai gangguan fisik adalah semua parameter
yang dapat mempengaruhi kecepatan sampel sampai ke nyala dan sempurnanya atomisasi.
Parameter-parameter tersebut adalah: kecepatan alir gas, berubahnya viskositas sampel akibat
temperatur atau solven, kandungan padatan yang tinggi, perubahan temperatur nyala dll.
Gangguan ini biasanya dikompensasi dengan lebih sering membuat Kalibrasi (standarisasi).

SPEKTROSKOPI SERAPAN ATOM

67

BAB VII

SPEKTROSKOPI RESONANSI MAGNET INTI


A. Latar belakang Spektroskopi RMI
Resonansi magnetik inti mempunyai kaitan dengan sifat-sifat magnetik suatu inti tertentu.
Jika anda mempunyai suatu kompas jarum, biasanya akan mengarah pada medan magnet bumi
dengan arah utara. Jika jarum kompas tersebut anda putar dengan jari sehingga menunjukkan arah
selatan arah yang berlawanan dengan medan magnet bumi. Posisi ini sangat tidak stabil karena
berlawanan dengan arah medan magnet bumi, dan jika anda membiarkannya jarum akan segera
kembali ke posisi semula yang lebih stabil.

Inti hidrogen juga mempunyai perilaku seperti magnet kecil dan inti-inti hidrogen dapat juga
diatur arahnya agar sesuai dengan arah medan magnet luar atau berlawanan dengan arah medan
magnet luar. Arah yang berlawanan dengan medan adalah tak stabil (energinya tinggi). Ini
memungkinkan untuk mengubah arahnya dari yang lebih stabil ke kurang stabil dengan
memberikan energi yang sesuai.

Gambar 7.1 Perubahan arah magnet inti hidrogen

Energi yang dibutuhkan untuk mengubahnya tergantung pada kekuatan medan magnet luar
yang digunakan, tetapi biasanya dalam kisaran gelombang radio pada frekuansi antara 60 100
MHz. (frekuansi radio BBC 4 adalah diantara 92-95 MHz!). Hal ini memungkinkan untuk
mendeteksi hubungan antara gelombang radio pada frekuensi tertentu dengan perubahan orientasi
proton sebagai suatu puncak dalam grafik. Perubahan proton dari satu arah ke arah lain oleh
gelombang radio disebut dengan kondisi resonansi.
SPEKTROSKOPI RMI

68

B. Prinsip Dasar Spektroskopi RMI


Banyak inti (atau lebih tepat, inti dengan paling tidak jumlah proton atau neutronnya ganjil)
dapat dianggap sebagai magnet kecil. Inti seperti proton (1H atau H-1) dan inti karbon-13 (13C atau
C-13; kelimpahan alaminya sekitar 1%). Karbon -12 (12C), yang dijadikan standar penentuan
massa, tidak bersifat magnet.
Bila sampel yang mengandung 1H atau 13C (bahkan semua senyawa organik) ditempatkan dalam
medan magnet, akan timbul interaksi antara medan magnet luar tadi dengan magnet kecil (inti).
Karena ada interaksi ini, magnet kecil akan terbagi atas dua tingkat energi (tingkat yang sedikit
agak lebih stabil (+) dan keadaan yang kurang stabel (-)) yang energinya berbeda. Karena dunia inti
adalah dunia mikroskopik, energi yang berkaitan dengan inti ini terkuantisasi, artinya tidak
kontinyu. Perbedaan energi antara dua keadaan diberikan oleh persamaan.
E = hH/2 ..(1)
H kuat medan magnet luar (yakni magnet spektrometer), h tetapan Planck, tetapan khas bagi jenis
inti tertentu, disebut dengan rasio giromagnetik dan untuk proton nilainya 2,6752 x 10 8 kg-1 s A
(A= ampere). Bila sampel disinari dengan gelombang elektromagnetik yang berkaitan dengan
perbedaan energi E, yakni,
E = h.. (2)
inti dalam keadaan (+) mengabsorbsi energi ini dan tereksitasi ke tingkat energi (-). Proses
mengeksitasi inti dalam medan magnetik akan mengabsorbsi energi (resonansi) disebut nuclear
magnetic resonance (NMR).
Frekuensi gelombang elektromagnetik yang diabsorbsi diungkapkan sebagai fungsi H.
= H/2 ... (3)
Bila kekuatan medan magnet luar, yakni magnet spektrometer, adalah 2,3490 T(tesla; 1 T = 23490
Gauss), yang diamati sekitar 1 x 108 Hz = 100 MHz. Nilai frekuensi ini di daerah gelombang
mikro. Secara prinsip, frekuensi gelombang elektromagnetik yang diserap ditentukan oleh kekuatan
magnet dan jenis inti yang diamati. Namun, perubahan kecil dalam frekuensi diinduksi oleh
perbedaan lingkungan kimia tempat inti tersebut berada. Perubahan ini disebut pergeseran kimia.
Dalam spektroskopi 1H NMR, pergeseran kimia diungkapkan sebagai nilai relatif terhadap
frekuensi absorpsi (0 Hz) tetrametilsilan standar (TMS) (CH3)4Si. Pergeseran kimia tiga jenis
proton dalam etanol CH3CH2OH adalah sekitar 10.5, 25 dan 490 Hz bila direkam dengan
spektrometer dengan magnet 21140 T (90 MHz) (Gambar 13 (a)). Karena frekuensi absorpsi proton
adalah 0,9 x 108Hz (90 MHz), pergeseran kimia yang terlibat hanya bervariasi sangat kecil.

Gambar 7.2. 1H spektra NMR etanol CH3CH2OH (a) spektrum resolusi rendah,
(b) spektrum resolusi tinggi. Garis bertangga adalah integral intensitas absorpsi.

SPEKTROSKOPI RMI

69

Frekuensi resonansi (frekuensi absorpsi) proton (atau inti lain) sebanding dengan kekuatan
magnet spektrometer. Perbandingan data spektrum akan sukar bila spektrum yang didapat dengan
magnet berbeda kekuatannya. Untuk mencegah kesukaran ini, skala , yang tidak bergantung pada
kekuatan medan magnet, dikenalkan. Nilai didefinisikan sebagai berikut.:
= ( /) x 106 (ppm) (4)
perbedaan frekuensi resonansi (dalam Hz) inti yang diselidiki dari frekuensi standar TMS
(dalam banyak kasus) dan frekuensi (dalam Hz) proton ditentukan oleh spektrometer yang sama.
Anda harus sadar bahwa Hz yang muncul di pembilang dan penyebut persamaan di atas dan oleh
karena itu saling meniadakan. Karena nilai / sedemikian kecil, nilainya dikalikan dengan 106.
Jadi nilai diungkapkan dalam satuan ppm.

Pergeseran kimia ()
Skala horisontal ditunjukkan sebagai (ppm). dinamakan pergeseran kimia/ chemical shift
dan dihitung dalam bagian per juta/ parts per million ppm. Suatu puncak dengan pergeseran
kimia, misalnya 2.0 artinya atom-atom hidrogen yang memunculkan puncak tersebut memerlukan
medan magnet 2 juta lebih kecil dari medan yang dibutuhkan oleh TMS untuk menghasilkan
resonansi. Suatu puncak pada pergeseran kimia 2.0 dikatakan mempunyai medan lebih rendah dari
TMS (downfiled).
Untuk sebagian besar senyawa, nilai proton dalam rentang 0-10 ppm. Nilai tiga puncak
etanol di Gambar 13 adalah 1,15; 3,6 dan 5,4. Penemuan pergeseran kimia memberikan berbagai
kemajuan dalam kimia. Sejak itu spektroskopi NMR telah menjadi alat yang paling efektif untuk
menentukan struktur semua jenis senyawa. Pergeseran kimia dapat dianggap sebagai ciri bagian
tertentu struktur. Misalnya, pergeseran kimia proton dalam gugus metil sekitar 1 ppm apappun
struktur bagian lainnya. Lebih lanjut, seperti yang ditunjukkan di Gambar 13, dalam hal spektra 1H
NMR, intensitas sinyal terintegrasi sebanding dengan jumlah inti yang relevan dengan sinyalnya.
Hal ini akan sangat membantu dalam penentuan struktur senyawa organik.

C. Pengaruh lingkungan kimia atom Hidrogen


Mungkinkah kita mendapatkan suatu proton yang terisolasi, kenyataannya proton
mempunyai sesuatu yang mengelilinginya terutama elektron. Adanya elektron ini akan
mengurangi pengaruh medan magnet luar yang dirasakan oleh inti hidrogen.

Misalkan anda menggunakan frekuensi radio 90 MHz, dan anda mengatur besarnya medan
magnet
sehingga
suatu
proton
yang
terisolasi
dalam
kondisi
resonansi.
Jika anda mengganti proton yang terisolasi dengan proton yang terhubung dengan sesuatu, proton
tidak akan merasakan pengaruh yang penuh dari medan luar dan akan berhenti beresonansi
(berubah dari satu arah magnetik ke arah yang lain). Kondisi resonansi tergantung pada adanya
kombinasi yang tepat antara medan magnet luar dan frekuensi radio.
Bagaimanakah anda mengembalikan kondisi resonansi? Anda dapat sedikit meningkatkan
medan magnet luar untuk mengimbangi pengaruh elektron. Misalnya anda menghubungkan
hidrogen dengan sesuatu yang lebih elektronegatif. Elektron dalam ikatan akan makin menjauh dari
inti hidrogen, sehingga pengaruhnya terhadap medan magnet di sekitar hidrogen akan berkurang.

SPEKTROSKOPI RMI

70

Untuk mengembalikan hidrogen pada kondisi resonansi, anda harus sedikit meningkatkan medan
magnet luar untuk mengimbangi pengaruh elektron tetapi tidak sebanyak jika hidrogen berada
didekat atom X.
Untuk suatu frekuensi radio yang diberikan (katakanlah, 90 MHz) atom hidrogen
membutuhkan sedikit medan magnet untuk membuatnya beresonansi yang besarnya tergantung
pada apa yang ada didekatnya dengan kata lain kebutuhan medan magnet adalah untuk
mengarahkan lingkungan atom hidrogen dalam suatu molekul.

D. Pencacah Integrator
Pencacah integrator adalah suatu garis yang dihasilkan dari perhitungan (komputer) yang
dikenakan pada spektrum NMR. Pada diagram, pencacah integrator ditunjukkan oleh warna merah.

Gambar 7.3 Spektrum RMI asam propanoat

Apakah yang ditunjukkan oleh suatu pencacah integrator?


Suatu pencacah integrator menghitung luas area relatif di bawah puncak suatu spektrum.
Ketika pencacah integrator melewati suatu puncak atau kumpulan puncak, pencacah akan
meninggi. Tinggi yang diperoleh setara dengan area di bawah puncak atau kumpulan puncak.
Anda dapat menentukan tinggi tiap puncak atau kumpulan puncak dengan menghitung jarak yang
ditunjukan oleh warna hijau pada diagram di atas dan kemudian dapat diketahui
perbandingannya.
Sebagai contoh, jika tingginya 0.7 cm, 1.4 cm dan 2.1 cm, maka perbandingan area
puncaknya adalah 1 : 2 : 3. Itu menunjukan perbandingan jumlah atom-atom hidrogen dalam tiga
lingkungan kimia yang berbeda, yaitu 1 : 2 : 3.

E. Ciri-ciri spektrum RMI


SPEKTROSKOPI RMI

71

Spektrum RMI yang sederhana adalah seperti berikut:

Gambar 7.4 Spektrum RMI asam etanoat

Puncak
Pada gambar 7.3 di atas, terdapat dua puncak karena ada dua lingkungan hidrogen yang
berbeda dalam gugus CH3 dan gugus COOH yang mengandung oksigen. Mereka berada pada
posisi yang berbeda dalam spektrum karena membutuhkan medan magnet luar yang sedikit berbeda
untuk menyebabkannya beresonansi pada frekuensi radio tertentu.
Ukuran kedua puncak memberikan informasi yang penting, yaitu banyaknya atom hidrogen
dalam tiap-tiap lingkungan. Bukan tinggi puncaknya tetapi perbandingan luas area di bawah
puncak. Jika anda dapat menghitung luas area di bawah puncak pada diagram di atas, anda akan
mendapatkan perbandingannya 3 (untuk puncak yang besar) dan 1 (untuk yang kecil).
Perbandingan 3:1 menunjukkan banyaknya atom hidrogen dalam dua lingkungan yang berbeda
hal ini sesuai untuk CH3COOH.

Perlunya standar sebagai pembanding TMS


Sebelum kita menjelaskan makna skala pada posisi horisontal, kita akan menjelaskan tentang
titik nol - pada bagian kanan skala. Nol adalah titik dimana anda akan mendapatkan suatu puncak
yang disebabkan oleh atom-atom hidrogen dalam tetrametilsilan biasanya disebut dengan TMS.
Setiap pembacaan spektrum RMI akan dibandingkan dengan TMS ini.

Anda akan menemukan puncak pada beberapa spektra RMI yang ditimbulkan oleh TMS (pada
nol), dan yang lainnya akan menjauhi puncak TMS ke sebelah kiri. Pada dasarnya, jika anda akan
menganalisis spektrum dengan suatu puncak pada nol, anda dapat mengabaikannya karena itu
adalah puncak dari TMS.
TMS dipilih sebagai standar karena beberapa alasan, diantaranya:
TMS mempunyai 12 atom hidrogen yang semuanya memiliki lingkungan kimia yang sama.
Mereka terikat oleh atom yang sama dengan cara yang sama sehingga tidak hanya
menghasilkan puncak tunggal tetapi juga puncak yang kuat (karena ada banyak atom
hidrogen).
Hidrogen pada senyawa ini lebih terlindungi dibandingkan pada senyawa lain karena adanya
elektron-elektron ikatan C-H. Ini artinya inti hidrogen lebih terlindungi dari medan magnet
luar, dan anda harus meningkatkan medan magnet untuk membawa hidrogen ini kembali ke
kondisi resonansinya.
SPEKTROSKOPI RMI

72

Pengaruh dari hal ini adalah TMS menghasilkan puncak yang ekstrim pada sisi kanan. Dan puncak
lain akan muncul di sebelah kirinya.

Pelarut untuk spektroskopi RMI


Spektra RMI biasanya ditentukan dari larutan substansi yang akan dianalisis. Untuk itu
pelarut yang digunakan tidak boleh mengandung atom hidrogen, karena adanya atom hidrogen
pada pelarut akan mengganggu puncak-puncak spektrum.
Ada dua cara untuk mencegah gangguan oleh pelarut. Anda dapat menggunakan pelarut
seperti tetraklorometana, CCl4, yang tidak mengandung hidrogen, atau anda dapat menggunakan
pelarut yang atom-atom hidrogennya telah diganti dengan isotopnya, deuterium, sebagai contoh
CDCl3 sebagai ganti CHCl3. Semua spektrum RMI pada bagian ini menggunakan CDCl3 sebagai
pelarut. Atom-atom deuterium mempunyai sifat-sifat magnetik yang sedikit berbeda dari hidrogen,
sehingga mereka akan menghasilkan puncak pada area spektrum yang berbeda.

F. Spektra NMR Resolusi Rendah


Perbedaan antara spektra resolusi tinggi dan spektra resolusi rendah

Gambar 7.5 Spektrum RMI metil propanoat resolusi tinggi

Spektrum resolusi rendah terlihat lebih sederhana karena tidak mampu memisahkan puncak-puncak
individu dalam berbagai kumpulan puncak.

Gambar 7.6 Spektrum RMI metil propanoat resolusi rendah

Angka pada puncak menunjukkan luas area relatif tiap puncak. Informasi ini sangat penting dalam
menginterpretasikan spektra.

SPEKTROSKOPI RMI

73

Menginterpretasikan spektrum resolusi rendah


Mengartikan jumlah puncak
Tiap puncak menunjukan lingkungan kimia yang berbeda untuk atom-atom hidrogen dalam suatu
molekul. Dalam spektrum metil propanoat di atas, terdapat tiga puncak karena ada tiga lingkungan
kimia hidrogen yang berbeda.
Ingat rumus molekul metil propanoat adalah CH3CH2COOCH3. Hidrogen dalam gugus CH2 jelas
berada pada lingkungan kimia yang berbeda dari gugus CH3. Dua gugus CH3 mempunyai
lingkungan kimia yang berbeda. Yang satu menempel pada gugus CH2 dan yang lainnya menempel
pada oksigen.

Mengartikan luas area di bawah puncak


Perbandingan luas area di bawah puncak menunjukan banyaknya hidrogen pada berbagai
lingkungan kimia. Pada kasus metil propanoat, perbandingan luas areanya 3:2:3, sesuai dengan apa
yang kita duga yaitu dua posisi untuk gugus CH3 yang berbeda dan satu posisi untuk gugus CH2.
Anda memerlukan luas area relatif di bawah puncak khususnya jika anda hanya melihat
spektra resolusi rendah. Spektrometer RMI dilengkapi dengan bagian/alat yang akan memunculkan
garis pada spektrum yang disebut dengan pencacah integrator (atau pencacah integrasi). Anda
dapat menentukan luas area relatif dengan pencacah ini.
Mengartikan pergeseran kimia
Posisi puncak menunjukan pada gugus fungsi apakah hidrogen berada. Pada beberapa soal,
anda akan diberikan tabel pergeseran kimia untuk beberapa gugus fungsi jika anda
memerlukannya. Pergeseran kimia yang penting pada metil propanoat adalah:

catatan: - R - menunjukkan gugus alkil (seperti metil, etil, dll). Pergeseran ditunjukan
sebagai kisaran nilai. Posisi yang pasti adalah bervariasi tergantung pada apa yang ada di
sekitar gugus tersebut dalam molekul.

Beberapa contoh pertanyaan


Contoh 1
Suatu senyawa organik diketahui sebagai salah satu dari senyawa berikut. Gunakan spektrum RMI
untuk menentukannya

SPEKTROSKOPI RMI

74

Pada gambar terdapat tiga puncak yang menunjukan tiga lingkungan kimia hidrogen yang berbeda.
Metil etanoat hanya akan memberikan dua puncak sehingga dapat diabaikan karena ada dua
gugus CH3 dengan lingkungan hidrogen yang berbeda.
Apakah perbandingan luas area dapat membantu? Tidak untuk kasus ini keduanya mempunyai
tiga puncak dengan perbandingan 1:2:3.
Sekarang anda perlu melihat nilai pergeseran kimia:

Lihat posisi-posisi hidrogen dalam dua senyawa yang mungkin dan bandingkan dengan nilai
pergeseran kimia pada tabel sehingga diperoleh pola berikut:

bandingkan pola tersebut dengan spektrum yang ada, maka akan diperoleh senyawa yang dimaksud
adalah asam propanoat, CH3CH2COOH.

SPEKTROSKOPI RMI

75

Contoh 2
Bagaimanakah anda menggunakan RMI resolusi rendah untuk membedakan antara isomer
propanon dan propanal?

Propanon hanya akan memunculkan satu puncak pada spektrum RMI karena kedua gugus
CH3-nya mempunyai lingkungan kimia yang identik keduanya menempel pada -COCH3.
Propanal memberikan tiga puncak dengan perbandingan luas area sekitar 3:2:1.
Anda dapat mengacu pada tabel pergeseran kimia di atas untuk menentukan dimanakah
puncak-puncak akan muncul, tetapi ini bukanlah hal yang terlalu penting.
Contoh 3
Berapakah puncak yang akan muncul pada spektrum RMI resolusi rendah dari senyawa
berikut, dan berapakah rasio luas area di bawah puncak?

semua gugus CH3 ekivalen sehingga hanya menghasilkan satu puncak. Muncul juga
puncak untuk hidrogen dari gugus CH2 dan gugus COOH.
Akan ada tiga puncak dengan perbandingan luas area 9:2:1.

G. Spektra RMI Resolusi Tinggi


Pada spektrum resolusi tinggi, anda dapat menemukan puncak-puncak yang terlihat
sebagai puncak tunggal pada spektrum resolusi rendah akan terpisah dalam suatu
kumpulan puncak.
Pertama-tama, anda perlu memperhatikan hal-hal berikut:
1 puncak
2 puncak in the cluster
3 puncak in the cluster
4 puncak in the cluster

singlet
doublet
triplet
quartet

Informasi yang dapat diperoleh dari spektrum resolusi tinggi adalah sama dengan spektrum
resolusi rendah anda dapat menyederhanakan tiap kumpulan puncak sebagai satu
puncak tunggal seperti pada resolusi rendah.
SPEKTROSKOPI RMI

76

Tetapi sebagai tambahan, banyaknya pemisahan/splitting puncak memberikan informasi


tambahan yang penting.
Menginterpretasikan spektrum resolusi tinggi
Aturan n+1
Banyaknya pemisahan menunjukan jumlah hidrogen yang terikat pada atom karbon atau
atom-atom tetangga yang berikatan langsung dengan atom karbon yang diamati.
Jumlah sub-puncak dalam suatu kumpulan sama dengan jumlah hidrogen yang terikat pada
karbon tetangga ditambah satu (n+1).
Jadi asumsinya adalah ada satu atom karbon yang diamati dan atom karbon tetangga
dengan atom-atom hidrogen yang diikat.
singlet bertetangga dengan atom karbon yang tidak mengikat hidrogen
doublet bertetangga dengan gugus CH
triplet bertetangga dengan gugus CH2
quartet bertetangga dengan gugus CH3
Menggunakan aturan n+1
Informasi apakah yang dapat diperoleh dari spektrum RMI ini?

Asumsikan anda mengetahui senyawa di atas mempunyai rumus molekul C4H8O2.


Untuk memulainya, anggaplah spektrum tersebut seperti spektrum resolusi rendah, ada tiga
kumpulan puncak, berarti ada tiga lingkungan hidrogen yang berbeda. Hidrogen pada
ketiga lingkungan mempunyai rasio 2:3:3, sehingga jumlahnya 8 hidrogen, ini
menunjukkan satu gugus CH2 dan dua gugus CH3.
Bagaimana dengan pemisahan puncak?
Gugus CH2 pada 4,1 ppm adalah quartet. Hal ini menunjukan gugus CH2 bertetangga dengan atom
karbon yang mengikat tiga atom hidrogen yaitu gugus CH3.
Gugus CH3 pada 1,3 ppm adalah triplet, berarti bertetangga dengan gugus CH2.
Kombinasi dari dua kumpulan puncak ini kuartet dan triplet biasanya berupa gugus etil,
CH3CH2. Hal ini sangat umum, kenalilah!
Terakhir, gugus CH3 pada 2,0 ppm adalah singlet. Artinya bertetangga dengan karbon yang tidak
mempunyai hidrogen.
Jadi senyawa apakah ini? Anda dapat juga menggunakan data pergeseran kimia untuk membantu
mengidentifikasi tiap gugus, dan akhirnya anda dapatkan:
SPEKTROSKOPI RMI

77

Dua kasus khusus


1. Alkohol
Dimanakah posisi puncak -O-H ?
Ini sangat membingungkan! Berbagai sumber memberikan pergeseran kimia yang sangat berbeda
untuk atom hidrogen pada gugus -OH dalam alkohol sering tidak konsisten. Sebagai contoh:

Buku data Nuffield menunjukan puncaknya pada 2,0 4,0, tetapi buku teks Nuffield
menunjukannya di sekitar 5,4
Data dari OCR yang digunakan dalam ujian memberikan 3,5 5,5.
Buku teks kimia organik yang dapat dipercaya memberikan 1,0 5,0, tetapi kemudian
menunjukan suatu spektrum RMI untuk etanol dengan puncak pada 6,1.
Spektrum RMI untuk etanol, CH3CH2OH sumber SDBS

Data SDBS (yang digunakan pada bagian ini) memberikan puncak -OH dalam etanol pada 2,6.
Masalah ini menunjukan bahwa posisi puncak -OH bervariasi, tergantung pada kondisinya
sebagai contoh, pelarut apa yang digunakan, konsentrasi, dan kemurnian alkohol terutama apakah
mengandung air atau tidak.
Cara untuk mengamati puncak OH
Jika anda ingin menentukan spektrum RMI alkohol misalnya etanol, tambahkan beberapa tetes
deuterium oksida, D2O, ke dalam larutan, lakukan dan tentukan kembali spektrumnya, puncak -OH
tidak muncul! Dengan membandingkan dua spektra, anda dapat menunjukan puncak yang
disebabkan oleh gugus -OH.
Catatan: deuterium oksida (kadang disebut juga dengan air berat) adalah air yang atom hidrogennya
(Hidrogen bermassa atom 1) diganti dengan isotopnya, yaitu deuterium (Hidrogen bermassa atom 2).

SPEKTROSKOPI RMI

78

Alasan hilangnya puncak dapat dijelaskan pada interaksi antara deuterium oksida dengan alkohol.
Semua alkohol, termasuk etanol, merupakan asam yang sangat sangat lemah. Hidrogen pada gugus
-OH mentranfer satu pasangan elektron bebas pada oksigen dari molekul air. Faktanya kita
mendapatkan air berat yang tidak berbeda.

Ion negatif yang terbentuk cenderung menyerang molekul deuterium oksida lain untuk
menghasilkan alkohol. Sekarang gugus -OH telah berubah menjadi -OD.
Atom-atom deuterium tidak menghasilkan puncak pada spektrum RMI seperti atom hidrogen,
sehingga tidak ada lagi puncak -OH.
Bagaimana dengan ion positif pada persamaan pertama dan OD- pada persamaan kedua. Keduanya
mengalami kesetimbangan membentuk molekul air berat.

Kelemahan pemisahan oleh gugus -OH


Meskipun alkohol benar-benar bebas air, hidrogen pada gugus -OH dan beberapa hidrogen pada
karbon tetangga tidak dapat berinteraksi untuk menghasilkan pemisahan. Puncak -OH adalah
singlet dan anda tidak perlu memikirkan pengaruh hidrogen dari atom tetangga.

Kumpulan puncak di sebelah kiri muncul oleh adanya gugus CH2. Merupakan quartet, karena ada
tiga hidrogen pada karbon tetangga (gugus CH3). Anda dapat mengabaikan pengaruh hidrogen pada
-OH.
Demikian juga puncak -OH di tengah spektrum adalah singlet. Puncak ini tidah berubah menjadi
triplet oleh pengaruh gugus CH2.
Atom-atom hidrogen yang ekivalen
Atom-atom hidrogen yang terikat pada atom karbon yang sama disebut atom hidrogen yang
ekivalen. Atom-atom hidrogen yang ekivalen ini tidak saling mempengaruhi sehingga satu
hidrogen pada gugus CH2 tidak akan menyebabkan pemisahan puncak spektrum satu sama lain.
Atom-atom hidrogen pada atom karbon tetangga dapat juga ekivalen jika benar-benar mempunyai
lingkungan kimia yang sama. Sebagai contoh:

SPEKTROSKOPI RMI

79

Keempat atom hidrogen tersebut ekivalen. Anda akan mendapatkan puncak tunggal tanpa adanya
pemisahan.
Hanya dengan mengubah molekul tersebut sedikit saja, anda akan mendapatkan spektrum yang
berbeda.

Sekarang molekul tersebut mengandung atom yang berbeda pada kedua ujungnya, hidrogen tidak
berada dalam lingkungan kimia yang sama. Senyawa ini akan memberikan dua puncak terpisah
pada spektrum RMI resolusi rendah. Spesktrum resolusi tinggi menunjukkan kedua puncak
terpecah menjadi triplet karena masing-masing bertetangga dengan gugus CH2.

H. Pemisahan (splitting) pada spektra NMR resolusi tinggi


Penggabungan spin (Asal usul doublet)
Perhatikan spectrum NMR resolusi tinggi dari senyawa CH2Cl-CHCl2

Kita fokuskan pada gugus CH2. Mengapa berupa doublet?


Ingat bahwa perbedaan posisi puncak-puncak pada spektrum NMR adalah karena
hidrogen-hidrogen mengalami medan magnet yang berbeda yang disebabkan oleh perbedaan
lingkungan kimia. Dua puncak yang terpisah artinya, hidrogen-hidrogen mempunyai dua medan
magnet yang sedikit berbeda. Dua perbedaan medan tersebut disebabkan oleh hidrogen pada gugus
CH tetangga. Hidrogen tetangga mempunyai medan magnet lemah yang dapat searah ataupun
berlawanan dengan medan magnet luar. Tergantung pada arahnya, yang akan memperkuat atau
melemahkan medan yang dirasakan oleh hidrogen-hidrogen pada CH2.

SPEKTROSKOPI RMI

80

Terdapat peluang yang sama untuk terjadinya susunan arah seperti di atas, sehingga akan ada dua
puncak yang disebabkan oleh hidrogen CH2, yang keduanya terpisah dan mempunyai luas area
yang sama (karena peluangnya 50/50 dari masing-masing susunan).

Asal-usul triplet
Sekarang fokuskan pada gugus CH dalam senyawa CH2Cl-CHCl2. Mengapa triplet? Hal ini
karena hidrogen mempunyai tiga medan magnet yang sedikit berbeda. Pikirkan susunan arah
magnetik hidrogen-hidrogen gugus CH2 tetangga. Ada beberapa kemungkinan:

Dua susunan di bagian tengah diagram menghasilkan medan yang sama (sama dengan medan
magnet luar). Sehingga, ada tiga medan magnet yang mungkin yang dapat dirasakan oleh hidrogen
CH, dan menyebabkan ada tiga puncak suatu triplet.
Luas area di bawah puncak mempunyai perbandingan 1 : 2 : 1 hal ini menunjukkan peluang dari
medan magnet yang ada.
Asal-usul kuartet
Jika anda menerapkan cara pengelompokan yang sama terhadap hidrogen yang bertetangga dengan
gugus CH3, anda akan mendapatkan empat medan magnet yang berbeda, tergantung pada susunan
hidrogen CH3.

SPEKTROSKOPI RMI

81

Semua susunan pada baris kedua menghasilkan medan yang sama, dan semua susunan pada baris
ketiga juga menghasilkan medan yang sama, tetapi waktunya sedikit lebih kecil. Ada empat medan
yang berbeda, dengan perbandingan peluangnya 1 : 3 : 3 : 1.
Sehingga hidrogen yang bertetangga dengan gugus CH3 akan memberikan puncak kuartet pada
spektrumnya, dengan ukuran perbandingan puncak 1 : 3 : 3 : 1.

Carbon Nuclear Magnetic Resonance (13C-NMR) Spectroscopy


Carbon-13 NMR (or 13C NMR or sometimes simply referred to as carbon NMR) is the
application of nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy with respect to carbon. It is
analogous to proton NMR (1H NMR) and allows the identification of carbon atoms in an organic
molecule just as proton NMR identifies hydrogen atoms. As such 13C NMR is an important tool in
chemical structure elucidation in organic chemistry. 13C NMR detects only the 13C isotope of
carbon, whose natural abundance is only 1.1%, because the main carbon isotope, 12C, is not
detectable by NMR. Since carbon is the element central to organic chemistry, 13C-NMR plays an
important role in determining the structure of unknown organic molecules and the study of organic
reactions and processes.
The idea and theory behind 13C-NMR is the same as with 1H-NMR, just a different nucleus, so you
really do not have to learn anything new to understand and interpret 13C-NMR's to help you solve
structures of unknown organic compounds.
In particular, the13C-NMR spectrum of an organic compound provides information
concerning:

the # of different types of carbon atoms present in the molecule


the electronic environment of the different types of carbons
the number of "neighbors" a carbon has (splitting)

The major differences that you will notice in 13C-NMR in comparison to 1H-NMR spectra include:

No integration of carbon spectra


Wide range (0-200 ppm) of resonances for common carbon atoms (typical range for
protons 1-10 ppm)

SPEKTROSKOPI RMI

82

Splitting
Carbons couple with the hydrogen atoms that are directly attached to them. Thus, a methyl
group (-CH3) appears as a quartet in the 13C-NMR spectra.
A methylene group with two attached hydrogens appears as a triplet, a methine group (-CH)
appears as a doublet, and a quaternary carbon, with no hydrogens attached, appears as a singlet.
Carbon-13 will also couple with another directly bonded carbon-13 atom but the odds of this are
very low (.01%) in naturally occurring samples and this generally is not seen. With this coupling to
bound hydrogens, a 13C-NMR spectra can appear as a real jungle of lines.
To improve the spectra allowing easy counting of the number of carbons, the protons are often
"decoupled" from the carbons by irradiating them at a frequency that excites them and interrupts
their normal coupling. In the absence of coupling from the protons, the carbon resonances all
appear as singlets and such a spectrum is said to be "Proton Decoupled".
Proton decoupled 13C-NMR is probably the most widely used technique because it clarifies
the C-NMR spectrum making it easier to determine the number of carbon atoms. The student
should be aware that the proton coupled experiment does exist and can provide useful information
on how many hydrogen atoms are bound to a particular carbon.
13

Number of Different Carbons


4-Methyl-2-pentanone contains 6 carbons and some of them are different from each other.
For example, the carbon labeled A is attached to a carbonyl group and no other
carbons. Carbon B is the carbon of a ketone carbonyl group. Carbon C is a carbon
attached to both a carbonyl carbon and a methine (-CH-) carbon. Carbon D is
attached to three other sp3 carbons. The carbons labeled E are both attached to carbon
D.
Just like in 1H-NMR, every chemically distinct carbon or group of carbons will give a unique
resonance in the NMR spectra. You may want to use the model to the right to help you figure out
which carbons are the same or different. As mentioned, since common carbons resonate over
such a wide range (0-200 ppm) as compared to protons, it is unlikely that two carbons will
resonante exactly at the same place (which is not very true of protons). Therefore, one can tell
how many different carbons or groups of identical carbons exist in a molecule simply by
counting the number of resonances in the 13C NMR spectra.
Chemical Shift
Chemically different carbons in an organic molecule do not experiencethe same magnetic field.
Just like protons, electrons shield the nucleusthereby reducing the effective magnetic field and
requiring energy of alower frequency to cause resonance. On the other hand, when electrons
arewithdrawn from a nucleus, the nucleus is deshielded and feels a strongermagnetic field requiring
more energy (higher frequency) to cause resonance.Thus, NMR provides information about a
carbons electronic environment.
Generally, carbons attached to electron withdrawing groups tend to resonateat higher frequencies
(more downfield (to the left) from TMS, tetramethylsilane,a common NMR standard). The position
of where a particular carbon atomresonates relative to TMS is called its chemical shift. Again,
since carbonatoms resonate over such a wide range, learning some common chemical shiftswill
provide you with a tremendous advantage at solving structural problemsusing NMR.
For example carbonyl carbons resonate furthest downfield (typically160-200 ppm), aromatic
carbons (115-145 ppm) and saturated aliphatic carbons(5-40 ppm).
Typical Chemical Shifts in Carbon NMR Spectra
Structure
Chemical Shift (ppm)
Carbonyl (ketone)
205-220
Carbonyl (aldehyde)
190-200
SPEKTROSKOPI RMI

83

Carbonyl (ester, acid)


Aromatic
Alkenes

170-185
125-150
115-140

Implementation
13

C NMR has a number of complications that are not encountered in proton NMR. 13C NMR is
much less sensitive to carbon than 1H NMR is to hydrogen since the major isotope of carbon, the
12
C isotope, has a spin quantum number of zero and so is not magnetically active and therefore not
detectable by NMR. Only the much less common 13C isotope, present naturally at 1.1% natural
abundance, is magnetically active with a spin quantum number of 1/2 (like 1H) and therefore
detectable by NMR. Therefore, only the few 13C nuclei present resonate in the magnetic field,
although this can be overcome by isotopic enrichment of eg. protein samples. In addition, the
gyromagnetic ratio (6.728284 107 rad T-1 s-1) is only 1/4 that of 1H, further reducing the sensitivity.
The overall receptivity of 13C is about 4 orders of magnitude lower than 1H [1].

Vanillin C-13 NMR spectrum

SPEKTROSKOPI RMI

84

Another potential complication results from the presence of large one bond J-coupling constants
between carbon and hydrogen (typically from 100 to 250 Hz). In order to suppress these couplings,
which would otherwise complicate the spectra and further reduce sensitivity, carbon NMR spectra
are proton decoupled to remove the signal splitting. Couplings between carbons can be ignored due
to the low natural abundance of 13C. Hence in contrast to typical proton NMR spectra which show
multiplets for each proton position, carbon NMR spectra show a single peak for each chemically
non-equivalent carbon atom.
In further contrast to 1H NMR, the intensities of the signals are not normally proportional to the
number of equivalent 13C atoms and are instead strongly dependent on the number of surrounding
spins (typically 1H). Spectra can be made more quantitative if necessary by allowing sufficient time
for the nuclei to relax between repeat scans.
High field magnets with internal bores capable of accepting larger sample tubes (typically 10 mm
in diameter for 13C NMR versus 5 mm for 1H NMR), the use of relaxation reagents [2], for example
Cr(acac)3 (chromium (III) acetylacetonate, CAS number 21679-31-2), and appropriate pulse
sequences have reduced the time needed to acquire quantitative spectra and have made quantitative
carbon-13 NMR a commonly used technique in many industrial labs. Applications range from
quantification of drug purity to determination of the composition of high molecular weight
synthetic polymers.
13
C chemical shifts follow the same principles as those of 1H, although the typical range of
chemical shifts is much larger than for 1H (by a factor of about 20). The chemical shift reference
standard for 13C is the carbons in tetramethylsilane (TMS), whose chemical shift is considered to be
0.0 ppm.

Typical chemical shifts in 13C-NMR

SPEKTROSKOPI RMI

85

BAB VIII

DASAR-DASAR KROMATOGRAFI
A. Pendahuluan
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan
kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponenkomponen dari suatu campuran akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase
gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan
zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal.
Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.
Secara sederhana, kromatografi adalah sebuah cabang ilmu yang mempunyai fokus
terhadap pemisahan ion/logam/senyawa, baik teknik maupun applikasinya berdasarkan pada
struktur dan komposisinya dalam sample mixtures (campuran sampel). Salah satu defenisi yang
banyak diikuti orang, sebagaimana dikeluarkan oleh Commission on Analytical Nomenclature
of IUPAC mengatakan bahwa Chromatography is a physical method of separation in which
the components to be separated are distributed between two phases, one of which is stationary
(stationary phase) while the other (mobile phase) moves in a definite direction (IUPAC,
1993).

Gambar 8.1 Contoh hasil pemisahan tinta dengan kromatografi lapis tipis

Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponenkomponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini. Semua
kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan
fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa
komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda
bergerak pada laju yang berbeda.

B. Sejarah Kromatografi
Kromatografi sebagai salah satu teknik pemisahan, pertama kali diperkenalkan oleh
seorang ahli botanis dari rusia, Michael Tswett pada tahun 1906 yang membuktikan bahwa
klorofil daun tidak hanya terdiri dari satu macam warna tetapi terdiri dari tiga macam warna
utama (hijau kekuningan, kuning dan oranye). Dia mencoba melarutkan cairan hijau daun dari
perasan daun segar dalam pelarut organik lalu menuangkan cairan tersebut ke dalam kolom
gelas yang berisi tanah diatomea. Cairan klorofil tersebut terpisah menjadi tiga macam warna
yang terpisah membentuk pita-pita warna. Warna atau kromofor tersebut mengilhami Tswett
DASAR-DASAR KROMATOGRAFI

86

menggunakan istilah kromatografi sebagai suatu proses pemisahan yang menghasilkan zat
warna. Selanjutnya Tswett melakukan berbagai eksperimen dengan menggunakan kolom yang
berisi partikel zat lain yang berbeda jenis dan ukurannya serta melihat pengaruhnya terhadap
proses pemisahan yang dihasilkan. Hasil penelitian Tswett kemudian disempurnakan oleh
Zechmeister pada tahun 1937 yang berhasil memisahkan dua pigmen zat warna dari klorofil
yakni carotenoid dan xantofil. Pada tahun-tahun berikutnya penggunaan kromatografi kertas
dan lapis tipis telah banyak dikembangkan oleh para peneliti sebagai alternatif lain dari teknik
kromatografi. Pada tahun 1938, Tailor mengembangkan teknik kromatografi penukar ion untuk
memisahkan isotop lithium dan kalium dengan menggunakan resin zeolit. Tiga tahun
kemudian, Tiselius dan Cleisson memperkenalkan teknik pemisahan dengan gradien elusi
dimana komposisi cairan fase gerak divariasikan secara bertahap selama proses pemisahan
berlangsung. Selanjutnya pada tahun 1941, Martin dan Synge mengembangkan teknik
pemisahan asam amino yang terasetilasi dari hidrolisat protein dengan menggunakan campuran
pelarut organik (kloroform) dan air yang didasarkan pada perbedaan nilai koefisien partisi
dengan proses ekstraksi counter-current yang kemudian dikenal dengan istilah kromatografi
partisi. Tahun 1952, Martin dan James mulai mengembangkan kromatografi gas untuk
memisahkan campuran asam lemak dengan fase gerak gas nitrogen dan fase diam asam stearat.
Pada tahun 1953, Wheaton dan Bauman, menemukan prinsip kromatografi cairan secara
ekslusi yang kemudian dikenal dengan kromatografi gel filtrasi. Pada tahun 1967, kromatografi
afinitas mulai dikembangan oleh Porath, et.al., untuk memishkan campuran berbagai macam
protein.
Selanjutnya pada dekade tahun 80-an, kromatografi gas dengan matriks kolom silika
murni yang tahan temperatur tinggi serta modifikasi fase diam dengan teknik WTOC (Wall
coated open tubullar capillary column) mulai dikembangkan untuk mendapatkan resolusi
pemisahan yang lebih baik. Dekade berikutnya, perkembangan instrumen digital yang
ditunjang oleh mikroprocessor dan detektor spektroskopi massa telah menjadikan teknik
pemisahan dengan kromatografi gas menjadi jauh lebih berkembang bahkan untuk keperluan
identifikasi suatu analit. Sejalan dengan itu, pengembangan teknik analisa kromatografi cair
dengan bantuan tekanan tinggi dan kolom yang termodifikasi (normal phase dan reverse
phase) mulai banyak dikembangkan terutama untuk sampel yang bersifat termolabil dan tidak
dapat dipisahkan dengan teknik kromatografi gas.

C. Jenis Kromatografi
Berdasarkan perbedaan kemampuan interaksi molekul zat terlarut (solute) terhadap
fase diamnya, kromatografi dapat dibedakan menjadi kromatografi partisi dan kromatografi
adsorpsi. Kromatografi partisi mengacu kepada distribusi zat terlarut dalam dua pelarut/fase
yang tidak saling bercampur. Termasuk di dalamnya adalah ekstraksi langsung (direct
extraction) dengan menggunakan sistem dua pelarut, atau fase cair yang terimmobilisasi dalam
matriks padat seperti pada kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis (thin layer
chromatography) dan kromatografi gas-cair. Kromatografi adsorpsi merujuk kepada adanya
interaksi spesifik yang sifatnya reversibel antara molekul zat terlarut dengan sisi pengikatan
yang terdapat di permukaan matriks fase diamnya (misalnya resin penukar ion untuk
memisahkan komponen berdasarkan perbedaan kekuatan ionisasi molekul) atau kromatografi
afinitas (pemisahan molekul berdasarkan perbedaan interaksi dengan fase diam karena
perbedaan afinitasnya). Kromatografi adsorpsi banyak digunakan dalam pemisahan komponen
biomolekul seperti protein dan DNA.

DASAR-DASAR KROMATOGRAFI

87

Gambar 8.2. Pengelompokan metode kromatografi

Distribusi molekul zat terlarut diantara kedua fase yang tidak saling bercampur
bergantung kepada perbedaan tingkat kelarutan dan polaritasnya dan nilai ini dapat
dikuantisasikan melalui harga koefisien distribusi (KD). Persamaannya adalah :
KD =

CS
dimana :
CM

Cs = konentrasi solute dalam fase diam


CM = konsentrasi solute dalam fase gerak

Gambar 8.3. Dasar pemisahan dalam kromatografi (a) adsorpsi (b) partisi (c) penukar ion (d) filtrasi

D. Besaran-besaran umum Kromatografi


Sebelum melangkah lebih lanjut dalam analisa kromatografi, ada beberapa istilah dan
parameter-parameter umum yang sering digunakan dalam proses kromatografi. Istilah-istilah
tersebut antara lain :
DASAR-DASAR KROMATOGRAFI

88

Analit : substansi zat (ion/molekul/senyawa) yang akan dipisahkan/ dianalisa dengan


kromatografi.
Fase diam (stasionary phase): suatu zat/material padat atau zat cair yang terimobilisasi
dalam suatu matrik kolom dan memiliki sifat fisik tertentu (daya absortivitas, polaritas,
porositas dan afinitas). Misalnya silika gel, alumina.

Gambar 8.4 Beberapa tipe fase diam yang terimobilisasi dalam kolom

Kromatogram : output visual yang dihasilkan dari suatu proses kromatografi. Biasanya
muncul sebagai spot (planar chromatography) atau puncak-puncak (peaks) yang
terpisahkan satu sama lain (column chromatography) berdasarkan perbedaan sifat
fisikokimia dari masing-masing analit (polaritas, volatilitas, distribusi massa, densitas, dll.)

Gambar 8.5 Tipe kromatogram (a) peak (b) spot

Fase gerak (mobile phase) : material (zat cair atau campuran zat cair) atau gas yang
bergerak dengan jarak dan arah tertentu dalam suatu matrik kolom atau lapisan fase diam
selama proses kromatografi.
effluent : fase gerak yang meninggalkan kolom.
Waktu retensi (tR) : waktu yang dibutuhkan oleh suatu analit untuk melewati suatu sistem
kromatografi hingga terdeteksi oleh detektor dalam suatu kondisi tertentu.
Retention factor (Rf) : Perbandingan jarak yang ditempuh oleh suatu analit dari titik awal
dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut/fase gerak dalam kromatografi planar.
Faktor selektifitas () : faktor pemisahan yang merupakan rasio waktu retensi atau rasio
k dari kedua puncak kromatogram yang nilainya dipengaruhi oleh jenis fase diam dan luas
permukaan bahan pengisi kolom.

DASAR-DASAR KROMATOGRAFI

89

Resolusi (Rs) : ukuran efektifitas pemisahan yang diperoleh dari perbandingan jarak kedua
puncak kromatogram.
Jumlah plat teoritis (N) : ukuran meluasnya pita kromatogram atau melebarnya puncak
karena dipengaruhi jenis peralatan yang ada (panjang dan ukuran diameter kolom, luas
permukaan dan keseragaman bentuk fase diam serta kecepatan alir fase gerak)
HETP (H) : High Equivalent to Teoritical Plate, ukuran yang menunjukkan efisiensi
kolom dalam proses pemisahan. H = L/N, dimana L = panjang kolom.

Gambar 8.6 Besaran-besaran dalam kromatografi

Kita dapat mempelajari notas-notasi lainnya dari suatu peak kromatogram, misalnya dari ketiga
macam senyawa A, B dan C yang telah terpisahkan sebagaimana terlihat pada gambar di
bawah :

DASAR-DASAR KROMATOGRAFI

90

E. Teori Dasar Proses Kromatografi


Dalam sistem kromatografi, komponen suatu analit bermigrasi hanya apabila
komponen tersebut berinteraksi dengan fase geraknya. Kecepatan migrasi komponen adalah
fungsi dari konstanta distribusi (KD), dimana komponen yang lebih menyukai berada dalam
fase diam atau dengan nilai k lebih besar pada fase diam akan bermigrasi lebih lambat dari
komponen yang memiliki nilai k lebih besar pada fase gerak. Akibat dari perbedaan
kemampuan berinteraksi dengan fase diam dan fase gerak tersebut maka terjadi perbedaan
kecepatan migrasi. Inilah yang menjadi dasar dalam proses pemisahan dengan teknik
kromatografi.
Terdapat dua teori yang dapat dikemukakan untuk memahami proses kromatografi
sehingga dapat diramalkan kondisi-kondisi bagaimana yang harus dipenuhi agar pemisahan
dua atau lebih komponen dapat berlangsung dengan baik.
Kedua teori tersebut adalah :
Teori Pelat atau Teori Lempeng (Plate Theory)
Teori ini didasarkan pada model ekstraksi countercurrent menurut Craig. Walaupun
terdapat analogi anatara proses ekstraksi Craig dengan kromatografi elusi, sebenarnya terdapat
perbedaan pokok antara keduanya. Pada ekstraksi Craig terjadi kontak bertahap pada setiap kali
penyetimbangan, sedangkan pada kromatografi elusi, kontak antara fase diam dengan fase
gerak terjadi secara kontinyu. Akibatnya pada ekstraksi Craig terjadi kesetimbangan sejati (true
equilibrium) pada setiap tahapnya sdangkan pada kromatografi elusi prosesnya merupakan
proses bukan kesetimbangan (non equilibrium process).

DASAR-DASAR KROMATOGRAFI

91

Martin dan Synge, memasukan pengertian pelat teori (theoritical plate) yang telah lama
digunakan dalam teori destilasi. Pelat teori adalah pelat imajiner dalam kolom yang tebalnya
sedemikian rupa, sehingga komponen dalam fase gerak yang keluar daripadanya mempunyai
komposisi yang sama dengan andaikata benar-benar telah terjadi kesetimbangan partisi antara
fase gerak dengan fase diam ditengah-tengah lapisan tersebut. Dengan demikian, maka pelat
teori dapat dianggap analog dengan satu tabung dari alat ekstraksi countercurrent Craig. Tebal
dari pelat imajiner tersebut dikenal sebagai High Equivalent of Theoritical Plate (HETP) atau
tinggi ekivalen pelat teoritis. Besarnya HETP mencerminkan efisiensi dari kolom.
HETP = L/N

dan

N = 16(tR/)2

Dimana L : panjang kolom dan N = jumlah pelat teoritis


Karena N mencerminkan jumlah kesetimbngan yang dapat terjadi di dalam suatu
proses kromatografi, maka HETP merupakan ukuran kemampuan kolom untuk memisahkan
komponen-komponen dari campurannya. Semakin kecil nilai HETP maka semakin besar
efisiensi dari kolom.
Teori Kecepatan (Rate Theory)
Suatu pendekatan teoritis lain, telah dikembangkan untuk memberikan pengertian yang
lebih baik mengenai faktor-faktor percobaan yang mempengaruhi kerja dan efisiensi kolom.
Pendekatan ini yang dikenal dengan teori kecepatan (rate theory) yang dipelopori oleh van
Deemter dan kawan-kawan. Sehingga teori ini sering disebut teori van Deemter.
Perbedaan pokok antara pendekatan yang dilakukan oleh van Deemter dengan
pendekatan menurut teori pelat adalah bahwa teori ini memandang prose-proses yang terjadi di
dalam kolom tidak atas dasar kesetimbangan, melainkan atas dasar aspek-aspek kinetika yang
menyangkut partisi komponen di dalam kolom. Toeri kecepatan ini khususnya mempelajari
faktor-faktor yang menyebabkan pelebaran pita (band broadening) bila sejumlah kecil
komponen dielusi di dalam kolom. Pelebaran pita ini akan menghasilkan kromatogram yang
lebar pula. Kromatogram/ puncak yang lebar bermakna bahwa besar yang berarti N kecil.
Bila N kecil berarti HETP akan besar. Jadi dengan kata lain, teori kecepatan mempelajari
faktor-faktor yang mempengaruhi HETP suatu kolom di bawah kondisi-kondisi yang berlaku.
Sebagai kesimpulannya disusun suatu persamaan yang menghubungkan HETP dengan tiga
faktor utama yang mempengaruhinya, yang dikenal dengan persamaan va Deemter :
HETP = A + B/ + C dimana = kecepatan linier fase gerak
Suku A disebut suku difusi Eddy yang mencerminkan reka-alur dari isi kolom. Fase
gerak dan komponen dapat bergerak melalui banyak jalur diantara butiran-butiran isi kolom.
Beberapa jalur lebih panjang dibandingkan jalur lainnya, sehingga sejumlah molekul
komponen memiliki gerakan yang lebih lambat di dalam kolom dibanding molekul lain dari
komponen yang sama. Hal ini akan menyebabkan pelebaran puncak kromatogram yang berarti
HETP menjadi lebih besar. Pengaruh difusi Eddy dapat dikurangi dengan menggunakan isi
kolom dengan butiran yang berbentuk sama, berukuran kecil dan disusun rapat serta rata di
dalam kolom.
Suku B/ atau difusi longitudinal merupakan gaya-gaya difusi molekul yang
menyebabkan molekul-molekul bergerak atau berdifusi dari bagian tengah pita ke kedua tepi
pita. Dari persamaan van Deemter terlihat bahwa semakin besar kecepatan linier fase gerak
semakin kecil pengaruh difusi longitudinal. Jadi dari sudut pengaruh difusi longitudinal, yang
besar adalah baik untuk efisiensi kolom.
Suku C atau suku pemindahan massa merupakan cerminan dari partisi komponen
antara fase diam dan fase gerak. Bila kecepatan linier fase gerak membesar maka tak cukup
waktu untuk mencapai kesetimbangan partisi, sehingga menyebabkan efisiensi optimal dari
kolom tak tercapai. Hal ini menyebabkan nilai HETP akan membesar. Agar faktor ini dapat
diperkecil maka harus diusahakan agar kesetimbangan partisi lebih cepat tercapai. Pada

DASAR-DASAR KROMATOGRAFI

92

kromatografi gas ini dapat dilakukan dengan menggunakan fase diam yang lebih tipis, suhu
yang lebih tinggi dan kekentalan fase diam yang lebih kecil.
Hubungan antara HETP dengan kecepatan linier fase diam dapat digambarkan sebagai
berikut :

Gambar 8.7. Hubungan HETP dengan kecepatan linier fase gerak

Dari kurva di atas dapat ditemukan kondisi kromatografi yang diharapkan memebrikan
nilai HETP yang kecil. Nilai A biasanya kecil jika kolom dipak dengan baik. Bila besar maka
suku B/ semakin kecil tetapi suku C semakin besar. Pada suatu nilai optimum pengaruh
ketiga suku setimbang satu sama lainnya dan nilai HETP menjaid minimum.

Gambar 8.8 Kurva HETP minimum

DASAR-DASAR KROMATOGRAFI

93

BAB IX

KROMATOGRAFI KERTAS & KLT


A. Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas adalah salah satu jenis kromatografi partisi dengan media elusi
berupa kertas berbentuk planar (datar). Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas
serap yang sangat seragam sedangkan fase geraknya adalah pelarut atau campuran pelarut yang
sesuai. Anda mungkin telah menggunakan kromatografi kertas sebagai salah satu cara yang
pernah anda kerjakan dalam bidang kimia untuk pemisahan, misalnya campuran dari pewarnapewarna yang menyusun warna tinta tertentu.
Anggaplah anda mempunyai tiga pena biru dan akan mencari tahu dari tiga pena itu,
yang mana yang digunakan untuk menulis sebuah pesan. Sampel dari masing-masing tinta
diteteskan pada garis dasar pinsil pada selembar kromatografi kertas. Beberapa pewarna larut
dalam jumlah yang minimum dalam pelarut yang sesuai, dan itu juga di teteskan pada garis
yang sama. Dalam gambar, pena ditandai 1, 2 dan 3 serta tinta pada pesan ditandai sebagai M.

Gambar 9.1. Penandaan tempat penotolan sampel

Kertas digantungkan pada wadah yang berisi lapisan tipis pelarut atau campuran
pelarut yang sesuai di dalamnya. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada dibawah garis
pada bercak diatasnya. Gambar berikutnya tidak menunjukkan terperinci bagaimana kertas di
gantungkan karena terlalu banyak kemungkinan untuk mengerjakannnya dan dapat
mengacaukan gambar. Kadang-kadang kertas hanya digulungkan secara bebas pada silinder
dan diikatkan dengan klip kertas pada bagian atas dan bawah. Silinder kemudian ditempatkan
dengan posisi berdiri pada bawah wadah.
Alasan untuk menutup wadah adalah untuk meyakinkan bahwa astmosfer dalam gelas
kimia terjenuhkan dengan uap pelarut. Penjenuhan udara dalam gelas kimia dengan uap
menghentikan penguapan pelarut sama halnya dengan pergerakan pelarut pada kertas.

Gambar 9.2. Jarak pelarut dari tempat penotolan sampel

KROMATOGRAFI KERTAS & KLT

94

Karena pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen yang berbeda dari
campuran tinta akan bergerak pada laju yang berbeda dan campuran dipisahkan berdasarkan
pada perbedaan bercak warna. Gambar menunjukkan apa yang tampak setelah pelarut telah
bergerak hampir seluruhnya ke atas.

Gambar 9.3. Kromatogram campuran tinta

Dengan sangat mudah dijelaskan melihat dari kromatogram akhir dari pena yang
ditulis pada pesan yang mengandung pewarna yang sama dengan pena 2. Anda juga dapat
melihat bahwa pena 1 mengandung dua campuran berwarna biru yang kemungkinan salah
satunya mengandung pewarna tunggal terdapat dalam pena 3.
Nilai Rf
Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan jarak yang ditempuh
pelarut; beberapa laiinya tetap lebih dekat pada garis dasar. Jarak tempuh relative pada pelarut
adalah konstan untuk senyawa tertentu sepanjang anda menjaga segala sesuatunya tetap sama,
misalnya jenis kertas dan komposisi pelarut yang tepat..
Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap senyawa berlaku rumus
sebagai berikut:
Rf =

jarak yang ditempuh oleh senyawa


jarak yang ditempuh oleh pelarut

Misalnya, jika salah satu komponen dari campuran bergerak 9.6 cm dari garis dasar, sedangkan
pelarut bergerak sejauh 12.0 cm, jadi Rf untuk komponen itu:

Dalam contoh kita melihat ada beberapa pena, tidak perlu menghitung nilai Rf karena anda
akan membuat perbandingan langsung dengan hanya melihat kromatogram.
Anda membuat asumsi bahwa jika anda memiliki dua bercak pada kromatogram akhir
dengan warna yang sama dan telah bergerak pada jarak yang sama pada kertas, dua bercak
tersebut merupakan senyawa yang hampir sama. Hal ini tidak selalu benar. Anda dapat saja
mempunyai senyawa-senyawa berwarna yang sangat mirip dengan nilai Rf yang juga sangat
mirip. Kita akan melihat bagaimana anda menemukan masalah itu pada penjelasan selanjutnya.
Bagaimana halnya jika substansi yang ingin diidentifikasi tidak berwarna?

KROMATOGRAFI KERTAS & KLT

95

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan membuat bercak menjadi tampak dengan


mereaksikannya dengan beberapa pereaksi yang menghasilkan produk yang berwarna. Contoh
yang baik yaitu kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino.
Anggaplah anda mempunyai campuran asam amino dan ingin memisahkan asam
amino tertentu yang terdapat dalam campuran. Untuk menyederhanakan, mari berasumsi
bahwa anda telah mengetahui kemungkinan campuran hanya mengandung lima asam amino
yang umum.
Setetes larutan campuran ditempatkan pada garis dasar kertas, dan dengan cara yang
sama ditempatkan asam amino yang telah diketahui diteteskan disampingnya. Kertas lalu
ditempatkan dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar,
campuran adalah M, dan asam amino yang telah diketahu ditandai 1 sampai 5.
Posisi pelarut depan ditandai dengan pinsil dan kromatogram lalu dikeringkan dan
disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan
senyawa berwarna, utamanya coklat atau ungu.

Gambar 9.4 Visualisasi kromatogram dengan pereaksi ninhidrin

Gambar di sebelah kiri menunjukkan kertas setelah dilalui pelarut hampir pada bagian
atas kertas. Bercak masih belum tampak. Gambar kedua menunjukkan apa yang mungkin
tampak setelah penyemprotan ninhidrin. Tidak diperlukan untuk menghitung nilai Rf karena
anda dengan mudah dapat membandigkan bercak dalam campuran dengan asam amino-asam
amino yang telah diketahui berdasarkan posisi dan warnanya.
Dalam contoh ini, campuran mengandung asam amino yang diberi tanda 1, 4 dan 5.
Bagaimana jika campuran mengandung asam amino lain selain dari asam amino yang
anda gunakan untuk perbandingan? Akan terdapat bercak dalam campuran yang tidak sesuai
dari asam amino yang telah diketahu. Anda harus mengulangi percobaan menggunakan asam
amino-asam amino lainnya sebagai bahan perbandingan.
Kromatografi kertas dua arah
Kromatografi kertas dua arah dapat digunakan dalam menyelesaikan masalah
pemisahan substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat serupa.
Kita akan kembali membicarakan tentang senyawa-senyawa berwarna karena lebih
mudah melihat apa yang terjadi. Ada dapat mengerjakannya secara sempurna hal ini dengan
senyawa-senyawa yang tidak berwarna - tetapi anda harus menggunakan banyak imajinasi
dalam menjelaskan apa yang terjadi !

KROMATOGRAFI KERTAS & KLT

96

Waktu ini kromatogram dibuat dari bercak tunggal dari campuran yang ditempatkan
kedepan dari garis dasar. Kromatogram ditempatkan dalam sebuah pelarut sebelum dan
sesudah sampai pelarut mendekati bagian atas kertas.
Dalam gambar, posisi pelarut ditandai dengan pinsil sebelum kertas kering. Posisi ini
ditandai sebagai SF1 yaitu pelarut depan untuk pelarut pertama. Kita akan menggunakan dua
pelarut yang berbeda

Gambar 9.5. Hasil pemisahan tahap pertama

Jika anda melihatnya lebih dekat, anda dapat melihat bahwa bercak pusat besar dalam
kromatogram sebagian biru dan sebagian hijau. Dua pewarna dalam campuran memiliki nilai
Rf yang hampir sama. Tentunya, nilai-nilai ini bisa saja sama, keduanya memiliki warna yang
sama; dalam hal ini anda tidak dapat mengatakan bahwa ada satu atau lebih pewarna dalam
dalam bercak itu.
Apa yang anda kerjakan sekarang adalah menunggu kertas kering seluruhnya, dan
putar 90o dan perlakukan kromatogram kembali dengan pelarut yang berbeda.
Hal yang sangat tidak dipercaya bahwa dua bercak yang membingungkan akan
memiliki nilai Rf dalam pelarut kedua sama halnya dengan pelarut yang pertama, dengan
demikian bercak-bercak akan bergerak dengan jumlah yang berbeda.

Gambar 9.6. Hasil pemisahan tahap kedua

Gambar berikutnya menunjukkan apa yang mungkin terjadi pada berbagai bercak pada
kromatogram awal. Posisi pelarut kedua juga ditandai.
Tentunya anda tidak dapat melihat bercak-bercak dalam posisi awal dan akhir; Bercakbercak telah bergerak! Kromatogram akhir akan tampak seperti ini:

KROMATOGRAFI KERTAS & KLT

97

Gambar 9.7 Hasil akhir pemisahan kromatografi 2 arah

Kromatografi dua arah secara seluruhnya terpisah dari campuran menjadi empat bercak yang
berbeda.
Jika anda akan mengidentifikasi bercak-bercak dalam campuran, secara jelas anda
tidak dapat melaksanakannya dengan perbandingan substansi pada kromatogram yang sama
seperti yang kita lihat pada contoh sebelumnya menggunakan pena atau asam amino-asam
amino. Anda dapat berakhir dengan kekacauan pada bercak-bercak yang tanpa arti.
Meskipun demikian, anda dapat bekerja dengan nilai Rf untuk setiap bercak-bercak
dalam pelarut-pelarut, dan kemudian membandingkan nilai-nilai yang anda telah ukur dari
senyawa yang telah diketahui pada kondisi yang tepat sama.
Bagaimana kromatografi kertas bekerja?
Meskipun kromatografi kertas sangat mudah pengerjaannya, tetapi sangat sulit
dijelaskan apabila membadingkannya dengan kromatografi lapis tipis. Penjelasannya
tergantung tingkatan pemilihan pelarut yang anda gunakan, dan beberapa sumber untuk
mengatasi masalah secara tuntas. Jika anda telah pernah melakukannya, ini sangat membantu
jika anda dapat membaca penjelasan bagaimana kromatografi lapis tipis bekerja.

Struktur dasar kertas


Kertas dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakan polimer dari gula sederhana, yaitu
glukosa.

Gambar 9.8 Struktur molekul selulosa

Sangat menarik untuk mencoba untuk menjelaskan kromatografi kertas dalam


kerangka bahwa senyawa-senyawa berbeda diserap pada tingkatan yang berbeda pada
permukaan kertas. Dengan kata lain, akan baik menggunakan beberapa penjelasan untuk
kromatografi lapis tipis dan kertas. Sayangnya, hal ini lebih kompleks daripada itu!.
Kompleksitas timbul karena serat-serat selulosa beratraksi dengan uap air dari atmosfer
sebagaimana halnya air yang timbul pada saat pembuatan kertas. Oleh karenanya, anda dapat
berpikir yakni kertas sebagai serat-serat selulosa dengan lapisan yang sangat tipis dari molekulmolekul air yang berikatan pada permukaan. Interaksi ini dengan air merupakan efek yang
sangat penting selama pengerjaan kromatografi kertas.

KROMATOGRAFI KERTAS & KLT

98

Kromatografi kertas menggunakan pelarut non polar


Anggaplah anda menggunakan pelarut non polar seperti heksana untuk mengerjakan
kromatogram. Molekul-molekul polar dalam campuran yang anda coba untuk pisahkan akan
memiliki sedikit atraksi antara akan memiliki sedikit atraksi untuk molekul-molekul air dan
molekul-molekul yang melekat pada selulosa, dan karena akan menghabisakan banyak
waktunya untuk larut dalam pelarut yang bergerak. Molekul-molekul seperti ini akan bergerak
sepanjang kertas diangkut oleh pelarut. Mereka akan memiliki nilai Rf yang relatif tinggi.
Dengan kata lain, molekul-molekul polar akan memiliki atraksi yang tinggi untuk
molekul-molekul air dan kurang untuk pelarut yang non polar. Dan karenanya, cenderung
untuk larut dalam lapisan tipis air sekitar serat lebih besar daripada pelarut yang bergerak.
Karena molekul-molekul ini menghabiskan waktu untuk larut dalam fase diam dan
kurang dalam fase gerak, molekul-molekul tidak akan bergerak sangat cepat pada kertas.
Kecenderungan senyawa untuk membagi waktunya antara dua pelarut yang tidak
bercampur (misalnya pelarut heksana dan air yang mana tidak bercampur) disebut sebagai
partisi. Kromatografi kertas menggunakan pelarut non-polar kemudian menjadi tipe
kromatografi partisi.
Kromatografi kertas menggunakan air dan pelarut polar lainnya
Waktu akan mengajarkan anda bahwa partisi tidak dapat dijelaskan jika anda
menggunakan air sebagai pelarut untuk campuran anda. Jika anda mempunyai air sebagai fase
diam, tidak akan sangat berbeda makna antara jumlah waktu substansi menghabiskan waktu
dalam campuran dalam bentuk lainnya. Seluruh substansi seharusnya setimbang kelarutannya
(terlarut setimbang) dalam keduanya.
Namun, kromatogram pertama yang telah anda buat mungkin merupakan tinta
menggunakan air sebagai pelarut. Jika air bertindak sebagai fase gerak selayaknya menjadi fase
diam, akan terdapat perbedaan mekanisme pada mekanisme kerja dan harus setimbang untuk
pelarut-pelarut polar seperti alkohol, misalnya. Partisi hanya dapat terjadi antara pelarut yang
tidak bercampur satu dengan lainnya. Pelarut-pelarut polar seperti alkohol rendah bercampur
dengan air.

B. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)


Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu tipe kromatografi partisi dengan
menggunakan sebuah lapisan tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng
gelas atau logam atau plastik yang keras.
Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis
tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar dalam sinar ultra violet.
Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Kromatogram
Kita akan mulai membahas hal yang sederhana untuk mencoba melihat bagaimana pewarna
tertentu dalam kenyataannya merupakan sebuah campuran sederhana dari beberapa pewarna.

KROMATOGRAFI KERTAS & KLT

99

Gambar 9.9. Skema perangkat kromatografi lempeng tipis

Sebuah garis menggunakan pensil digambar dekat bagian bawah lempengan dan
setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada
garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan
menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.
Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah
gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan
bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada.
Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam
gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas
kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh
dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.
Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda
dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai
perbedaan bercak warna.

Gambar 9.10. Proses pemisahan dalam kromatografi lempeng tipis

Gambar di atas menunjukkan lempengan setalah pelarut bergerak setengah dari lempengan.
Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan
pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari
pelarut dan fase diam.
Perhitungan nilai Rf
Jika anda ingin mengetahui bagaimana jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk
dari campuran, anda dapat berhenti pada bahasan sebelumnya. Namun, sering kali pengukuran
diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul.
Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh
bercak warna masing-masing.
Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas
kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.

KROMATOGRAFI KERTAS & KLT

100

Pengukuran berlangsung sebagai berikut:

Gambar 9.11. Dasar perhitungan nilai Rf

Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:


Rf=jarak yang ditempuh oleh komponen
jarak yang ditempuh oleh pelarut

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1.7 cm dari garis awal,
sementara pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna merah menjadi:

Jika anda dapat mengulang percobaan ini pada kondisi yang tepat sama, nilai Rf yang
akan diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama. Sebagai contoh, nilai Rf untuk warna
merah selalu adalah 0.34. Namun, jika terdapat perubahan (suhu, komposisi pelarut dan
sebagainya), nilai tersebut akan berubah. Anda harus tetap mengingat teknik ini jika anda ingin
mengidentifikasi pewarna yang tertentu. Mari kita lihat bagaimana menggunakan kromatografi
lapis tipis untuk menganalisis pada bagian selanjutnya.
Bagaimana halnya jika substansi yang ingin anda analisis tidak berwarna?
Ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel yang tidak berwarna.
Menggunakan pendar flour
Mungkin anda masih ingat apa yang telah saya sebutkan bahwa fase diam pada sebuah
lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya
menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika anda
menyinarkannya dengan sinar UV, akan berpendar.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun
bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa jika anda
menyinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan
posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.

KROMATOGRAFI KERTAS & KLT

101

Gambar 9.12. Visulisasi hasil KLT dengan sinar UV

Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, anda harus menandai posisi-posisi


dari bercak-bercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari daerah bercak-bercak itu.
Seketika anda mematikan sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.
Penunjukkan bercak secara kimia
Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak
dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna.
Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino.
Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin.
Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya
coklat atau ungu.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan


pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal
iodium.
Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat
dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak
sebagai bercak-bercak kecoklatan.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan
pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal
iodium.
Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat
dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak
sebagai
bercak-bercak
kecoklatan.
Penggunaan kromatografi lapis tipis untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa
Anggaplah anda mempunyai campuran asam amino dan ingin menemukan asam
amino-asam amino tertentu yang terkandung didalam campuran tersebut. Untuk sederhananya,
mari kira berasumsi bahwa anda mengetahui bahwa campuran hanya mungkin mengandung
lima asam amino.

KROMATOGRAFI KERTAS & KLT

102

Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercakbercak kecil yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada
disamping tetesan yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri
dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah
M dan asam amino yang telah diketahui ditandai 1-5.
Bagian kiri gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir mencapai bagian
atas dari lempengan. Bercak-bercak masih belum tampak. Gambar kedua menunjukkan apa
yang terjadi setelah lempengan disemprotkan ninhidrin.

Gambar 9.13. Visualisasi KLT asam amino dengan ninhidrin

Tidak diperlukan menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat


membandingkan bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari asam amino yang telah
diketahui melalui posisi dan warnanya.
Dalam contoh ini, campuran mengandung asam amino 1, 4 dan 5.
Bagaimana jika campuran mengandung lebih banyak asam amino daripada asam amino yang
digunakan sebagai perbandingan? Ini memungkinkan adanya bercak-bercak dari campuran
yang tidak sesuai dengan asam amino yang dijadikan perbandingan itu. Anda sebaiknya
mengulangi eksperimen menggunakan asam amino lain sebagai perbandingan.
Bagaimana kromatografi lapis tipis berkerja?
Fase diam-lapisan/gel silika
Gel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh
atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan gel silika, atom
silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada permukaan gel silika terdapat ikatan Si-O-H
selain Si-O-Si.
Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.

Gambar 9.14. Struktur molekul fase diam silika

KROMATOGRAFI KERTAS & KLT

103

Permukaan gel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der
Waals dan antaraksi dipol-dipol.
Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom
aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel
silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.
Apa yang memisahkan senyawa-senyawa dalam kromatogram?
Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan
senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa
akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan
pelarut.
Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung
pada:
Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada bagaimana besar
atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya gel silika. Hal ini tergantung pada
bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan jel silika.
Anggaplah bercak awal mengandung dua senyawa, yang satu dapat membentuk ikatan
hidrogen, dan yang lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der Waals yang
lemah.
Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih
kuat dibanding senyawa lainnya. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari
senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi
pada permukaan.
Penjerapan bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara
yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut. Dengan
jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut dalam
pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses penjerapan
berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa
dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.
Dalam contoh yang sudah kita bahas, senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen
akan menjerap lebih kuat daripada yang tergantung hanya pada interaksi van der Waals, dan
karenanya bergerak lebih jauh pada lempengan.
Bagaimana jika komponen-komponen dalam campuran dapat membentuk ikatan-ikatan
hidrogen?
Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut
dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara
senyawa dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang
penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar
dari permukaan silika.
Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan
baik ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu
dengan baik-termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.

KROMATOGRAFI KERTAS & KLT

104

BAB X

KROMATOGRAFI KOLOM (ADSORPSI,


PENUKAR ION DAN GEL FILTRASI)
A. Pendahuluan
Kromatografi kolom merupakan salah satu cara pemisahan dimana fase diam
ditempatkan dalam suatu matriks penyangga khusus berbentuk silinder/ kolom. Fase diam
dapat berupa zat padat yang ditempatkan dalam suatu kolom atau dapat juga berupa cairan
yang terserap (teradsorpsi) sebagai lapisan tipis pada permukaan butiran halus zat padat
pendukung (solid support material). Sejumlah kecil analit yang akan dipisahkan ditempatkan di
atas permukaan kolom yang kemudian dielusi oleh fase gerak yang dialirkan melewati kolom
sehingga terjadi pemisahan karena adanya perbedaan interaksi antara analit dengan fase diam
dan fase geraknya. Perbedan afinitas dan gaya interaksi dari setiap komponen ini akan
menyebabkan terjadinya perbedaan kecepatan migrasi masing-masing komponen sehingga kita
dapat memisahkan komponen tersebut dengan menampung setiap fraksi yang dihasilkan di
dasar kolom.

Kromatografi kolom berkerja berdasarkan skala yang lebih besar menggunakan


material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertikal. Kromatogragfi kolom banyak
dimanfaatkan untuk keperluan analisa senyawa-senyawa organik dan biomolekul seperti
protein, lipid asam amino dan asam nukleat.

B. Kromatografi Kolom Adsorpsi


Salah satu tipe kromatografi kolom yang paling sederhana adalah kromatografi kolom
adsorpsi. Teknik ini yang pertama kali ditemukan oleh Tsweet dalam pemisahan komponen
senyawa yang terdapat dalam klorofil dengan menggunakan adsorben tanah diatomit. Beberapa
adsorben lainnya yang biasa digunakan dalam kolom kromatografi adsorpsi dapat dilihat pada tabel
berikut :
Tabel 10.1 Beberapa macam adsorben dalam kromatografi kolom

Material adsorben
Alumina
Silica gel
Fluorisil (magnesium silikat)
Calcium phosfat

Aplikasi
Senyawa organik sederhana
Asam amino, lipid, karbohidrat
Lipid netral
Protein, polinukleotida, asam
nukleat

Ukuran partikel
20-50 mesh
20-100 mesh
100 200 mesh`
20 200 mesh

Berbagai ukuran kolom kromatografi digunakan dan jika anda membuka link pada halaman
Kimia Organik dari situs Universitas Colorado, anda akan menemukan foto dari bermacam-macam
kolom. Dalam laboratorium sederhana, seringkali dengan mudah digunakan buret biasa sebagai
kromatografi kolom.

KROMATOGRAFI KOLOM (ADSORPSI, PENUKAR ION DAN GEL FILTRASI)

105

Gambar 10.1 Gambar sederhana kromatografi kolom konvensional

Dalam kolom kromatografi adsorpsi, setiap komponen analit mengalami interaksi yang
spesifik dengan fase diam. Hal tersebut sangat tergantung pada sifat alamiah, bentuk, ukuran,
afinitas dan polaritas dari material adsorben tersebut. Beberapa material adsorben memiliki ukuran
dan bentuk yang tertentu bergantung pada kebutuhan dan tipe analit yang akan dipisahkan.
Biasanya matriks kolom tersebut disimpan dalam bentuk serbuk kering atau butiran-butiran halus
yang ditempatkan dalam suatu wadah berisi larutan buffer atau dalam pelarut organik. Alumnia,
silical gel, fluorisil termasuk jenis adsorben yang umum dan tidak memerlukan perlakuan khusus
sebelum digunakan.
Penyiapan kolom
Sebelum melakukan proses pemisahan, kolom dipak terlebih dahulu dengan cara
memasukan fase diam ke dalam tabung silinder, seperti terlihat pada gambar di bawah ini :

Gambar 10.2 (a) contoh kolom yang siap digunakan (b) proses aplikasi kolom
kromatografi, mulai elusi pelarut hingga fraksinasi komponen analit.

KROMATOGRAFI KOLOM (ADSORPSI, PENUKAR ION DAN GEL FILTRASI)

106

Selanjutnya tambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom, cegah sedapat mungkin
jangan sampai merusak material terpadatkan dalam kolom. Lalu buka kran, supaya pelarut
dapat mengalir melalui kolom, kumpulkan dalam satu gelas kimia atau labu dibawah kolom.
Karena pelarut mengalir kontinyu, anda tetap tambahkan pelarut baru dari bagian atas kolom
sehingga kolom tidak pernah kering.
Penjelasan tentang apa yang terjadi
Ini mengasumsikan bahwa anda telah membaca penjelasan tentang apa yang terjadi
pada kromatografi lapis tipis. Senyawa biru lebih polar daripada senyawa merah dan
memungkinkan mempunyai kemampuan berikatan dengan hidrogen. Anda dapat mengatakan
ini karena senyawa biru tidak bergerak secara sangat cepat melalui kolom. Itu berarti bahwa
senyawa biru harus dijerap secara kuat pada gel silika atau alumina dibanding dengan senyawa
merah. Karena kurang polar, senyawa merah berinteraksi lebih kuat dengan pelarut, sehingga
keluar dari kolom lebih cepat.
Proses pencucian senyawa melalui kolom menggunakan pelarut dikenal sebagai elusi.
Pelarut disebut sebagai eluen.
Apakah anda hanya ingin mengumpulkan senyawa biru saja?
Sudah waktunya untuk mencuci senyawa biru melalui kecepatan bergeraknya pada
waktunya! Namun, tidak ada alasan mengapa anda tidak dapat mengganti pelarut selama elusi.
Anggaplah anda menggantikan pelarut yang anda telah digunakan selama ini dengan
pelarut yang lebih polar, setelah seluruh senyawa kuning selesai terkumpulkan. Ini akan
mempunyai dua pengaruh, keduanya akan mempercepat senyawa biru melalui kolom.
Pelarut polar akan bersaing untuk mendapatkan ruang pada jel silika atau alumina
dengan senyawa biru. Beberapa ruang untuk sementara dipergunakan oleh molekul-molekul
pelarut pada permukaan fase diam, tidak menyediakan molekul-molekul biru untuk melekat
dan ini akan cenderung menjaga pergerakannya dalam pelarut. Akan ada atraksi yang lebih
besar antara molekul-molekul pelarut polar dan molekul biru yang polar. Kecenderungan ini
akan menarik molekul-molekul biru menempel pada fase diam kembali pada larutan.
Pengaruh total yaitu dengan bertambahnya kepolaran pelarut, senyawa biru akan
menghabiskan waktu dalam larutan dan karenanya akan bergerak lebih cepat. Lalu mengapa
tidak menggunakan alternatif ini dalam tempat pertama? Jawabannya adalah jika senyawasenyawa dalam campuran bergerak secara sangat cepat melalui kolom dari awal, anda mungkin
tidak akan mendapatkan pemisahan yang baik

Bagaimana jika campuran yang anda miliki tidak berwarna?


Jika anda akan menggunakan kromatografi kolom untuk memurnikan produk organik,
mungkin produk yang anda harapkan akan menjadi produk yang tidak berwarna, meskipun satu
atau lebih dari pengotor berwarna. Mari kita berasumsi kasus terburuk yaitu segala sesuatunya
tidak berwarna.
Bagaimana anda bisa mengetahui bahwa substansi yang anda diinginkan telah
mencapai bagian bawah kolom?
Ini bukan merupakan pekerjaan yang cepat dan mudah! Apa yang akan anda
kumpulkan dan apa yang keluar dari bawah kolom dalam seluruh rangkaian pipa yang berlabel.
Bagaimana besar setiap sampel akan jelas tergantung pada bagaimana besar kolom yaitu-anda
mungkin mengumpulkan 1 cm3 atau 5cm3 sampel atau apapun itu besarnya yang sesuai. Anda
kemudian akan mengambil setetes dari setiap larutan dan membuatnya ke dalam kromatografi
lapis tipis. Anda menempatkan tetesan pada garis dasar bersama dengan setetes senyawa murni
dari senyawa yang sementara anda buat. Dengan mengulangi pekerjaan ini, anda dapat
KROMATOGRAFI KOLOM (ADSORPSI, PENUKAR ION DAN GEL FILTRASI)

107

mengidentifikasi sampel yang mana yang dikumpulkan pada bawah kolom yang mengandung
produk yang diinginkan.
Metode Identifikasi yang dipakai sangat bergantung pada sifat alamiah zat yang ingin
dideteksi. Molekul-molekul seperti lipid, asam amino dan karbohidrat dapat dideteksi melalui
kolom kromatografi lapis tipis dengan penambahan pereaksi warna atau dengan metode
spektrofotometri ultraviolet pada panajang gelombang yang spesifik (280 dan 260 nm).
Kelebihan dan kekurangan kromatografi kolom adsorpsi
Kekurangan kromatografi kolom adsorpsi umumnya masih bersifat konvensional
dimana proses pemisahannya hanya didasarkan pada gaya gravitasi yang relative lambat
sehingga membutuhkan waktu yang lama, tidak reproducible dan resolusi pemisahan yang
rendah serta tidak dapat digunakan untuk analisa kuantitatif disamping itu juga metode deteksi
yang masih bersifat manual.
Namun demikian keunggulan dari metode ini adalah pengerjaan yang relative
sederhana, tidak membutuhkan biaya yang mahal dan sangat baik untuk pekerjaan pendahuluan
juga dapat digunakan dalam skala besar. Pemisahan yang baik dapat ditingkatkan dengan
preparasi kolom dan pemilihan fase gerak yang sesuai.

C. Kromatografi Penukar Ion


Kromatografi penukar ion adalah salah satu bentuk kromatografi adsorpsi yang
didasarkan pada interaksi elektrostatik reversible antara komponen analit dengan fase diam
yang berbeda muatan. Kromatografi penukar ion menggunakan mekanisme pertukaran ion
untuk memisahkan komponen analit. Kolom penukar ion dipaking dengan fase diam yang
terdiri dari resin sintetik yang diikatkan dengan gugus fungsi ionic (bermuatan). Kromatografi
penukar ion terdiri dari dua tipe berdasarkan jenis fase diamnya yaitu resin penukar kation dan
resin penukar anion. Ilustrasi sederhana prinsip dari kromatografi penukar ion dapat dilihat
pada gambar berikut :

Gambar 10.3 Tahapan kromatografi penukar ion


KROMATOGRAFI KOLOM (ADSORPSI, PENUKAR ION DAN GEL FILTRASI)

108

Pada tahapan pertama, penambahan buffer ke dalam kolom (misal kolom resin penukar
anion yang bermuatan positif) sehingga matriks resin akan dikelilingi oleh ion dari larutan
buffer yang bermuatan negartif. Pada tahap selanjutnya, loading sampel (missal protein/asam
amino) yang terdiri dari campuran komponen yang akan dipisahkan dimana satu sama lainnya
memiliki range pH isoelektrik yang berbeda.). Kekuatan interaksi ionic tersebut sangat
bergantung pada ukuran dan densitas muatan (jumlah muatan per unit volume dari suatu
molekul). Komponen yang memiliki densitas muatan yang tinggi (lebih bermuatan negative)
akan lebih lama tertahan dibanding komponen dengan densitas muatan rendah (lebih bermuatan
positif/netral). Ikatan antara molekul analit dengan fase diam selanjutnya dilepaskan melalui
penambahan/elusi dengan larutan buffer dengan kenaikan pH. Peningkatan keuatan ionic dari
larutan buffer tersebut akan menggeser interaksi antara analit dengan matriks kolom sehingga
masing-masing komponen akan terpisahkan berdasarkan perbedaan kekuatan interaksi ionic
dari masing-masing komponen.
Karakter Resin Penukar Ion
Resin penukar ion dibuat dari suatu bahan yang tidak larut, membentuk matriks tiga
dimensi dan secara kimia mengandung suatu gugus bermuatan yang terikat pada permuakaan
matriks tersebut. Biasanya resin penukar ion ini dibuat dari polistiren, resin akrilik atau suatu
polisakarida (dekstran atau selulosa). Resin yang mengandung gugus bermuatan negative
disebut resin penukar kation sedangkan resin yang mengandung gugus bermuatan positif
disebut resin penukar anion.
Beberapa tipe resin penukar ion dikelompokan berdasarkan fungsi dan jenis gugus
fungsi yang terikat. Selain itu juga dapat diklasifikasikan berdasarkan kuat lemahnya interaksi
ionic yang terjadi seperti terlihat pada table berikut :
Tabel 10.2. Tipe resin penukar ion
Nama
Resin Penukar Anion
AG1
AG3
DEAE_selulosa
PEI-selulosa
DEAE-Sephadex
QAE-Sephadex
Resin Penukar Kation
AG50
Bio-Rex 70
CM-Selulosa
P-Selulosa
CM-Sephadex
SP-Sephadex

Gugus fungsi

Matriks

Interaksi

Tetrametilammonium
Tertiary amine
Dietilaminoetil
Polietileneimine
Dietilaminoetil
Dietil-(2-hidroksil-profil)aminoetil.

Polistiren
Polistiren
Selulosa
Selulosa
Dekstran
Dekstran

Kuat
Lemah
Lemah
Lemah
Lemah
Kuat

Asam sulfonat
Asam Karboksilat
Karboksimetil
Phosfat
Karboksimetil
Sulfopropil

Polistiren
Akrilat
Selulosa
Selulosa
Dextran
Dextran

Kuat
Lemah
Lemah
Sedang
Lemah
Kuat

Pemilihan Resin
Sebelum melakukan proses pemisahan dan memilih jenis resin penukar ion yang cocok,
terlebih dahulu kita perlu memahami sifat dan karakteristik molekul yang akan dipisahkan.
Untuk molekul yang relative kecil dan lebih stabil (asam amino, lipid, nukleotida dan pigmen),
resin yang berbahan dasar polistiren lebih efektif karena resin tersebut memiliki kapasitas
pengikatan cross-linking yang relative tinggi hingga ke bagian dalam molekul resin. Sedangkan
untuk pemisahan molekul yang relative lebih besar (protein, asam ukleat dan polisakarida juga
makromolekul lain lebih tepat digunakan resin penukar ion berbasis selulosa atau dekstran
dengan kapasitas pengikatah cross-linking yang lebih kecil.

KROMATOGRAFI KOLOM (ADSORPSI, PENUKAR ION DAN GEL FILTRASI)

109

Pemilihan jenih resin penukar ion (kation/anion) sangat bergantung pada jenis ion dari
molekul komponen analit. Jika molekul yang akan dipisahkan memiliki satu jenis muatan, akan
sangat mudah untuk menentukannya. Tetapi jika molekul bersifat amfoter (misalnya protein
atau asam amino) maka pH isoelektriknya perlu diperhatikan, karena pada pH isoelektrik,
molekul yang bersangkutan tidak akan memiliki muatan sehingga tidak akan terikat pada jenis
resin penukar ion manapun. Oleh karena itu penggunaan range pH perlu diperhatikan agar
molekul yang akan dipisahkan tidak mengendap atau terdenaturasi.

Pemilihan Buffer
Pemilihan larutan buffer akan sangat berpengaruh terhadap efisiensi hasil pemisahan
karena pemisahan yang baik tidak hanya diperoleh dari substransi larutan buffer tetapi juga
karena pH yang tepat dan kekuatan ioniknya. Pemilihan buffer denga mutan yang berlawanan
dengan matriks resin akan berkompetisi dengan komponen analit untuk terikat sehingga akan
mengurangi kapasitas kolom. Pemilihan pH untuk larutan buffer bergantung pada (1) stabilitas
makromolekul yang akan dipisahkan dan (2) kekuatan ionic dari larutan b uffer agar tidak
terjadi kompetsisi anatar komponen analit dengan larutan buffernya. Buffer dengan konsentrasi
0.05 sapai 0.1 M umumnya sering direkomendasikan.
Penyiapan Resin Penukar Ion
Beberapa supplier resin biasanya telah menyediakan instruksi dan cara preparasi matriks
kolom secara mendetail dalam bentuk catalog/manual. Kesalahan preparasi resin penukar ion
pada saat pertama kali akan digunakan akan mempengaruhi kinerja kolom dan mengurangi
efisiensi/resolusi pemisahan. Misalnya untuk preparasi resin penukar ion berbasis selulosa,
sebagian besar disediakan dalam bentuk powder (bubuk kering) sehingga harus direndam
dalam larutan tertentu untuk mengaktifkan gugus fungsi ioniknya. Contoh : dietilaminoetil
DEAE-selulosa atau karboksimetil-selulosa, sebagai langkah awal preparasi, sebanyak 100 g
matriks resin dilarutkan dlam 1 L HCl 0,5 M dan distired 30 menit. Selanjutnya matriks resin
disaring dan dicuci dengan aquades sampai diperoleh pH netral. Perlakuan ini dimaksudkan
untuk menjaga performance kolom, selanjutnya resin disimpan dalam suasana basa untuk dapat
mengkonversi bentuk-bentuk ion yang penting selama pemisahan. Tahapan berikutnya adalah
pemisahan komponen ion logam/pengotor dengan cara mengendapkannya agar tidak
mengganggu proses pemisahan atau degradasi biomolekul bisanya dilakukan dengan
penambahan larutan EDTA 0,01 M. Resin yang sudah dicuci dan bebas ion logam selanjutnya
siap untuk dipakai dalam proses pemisahan. Kesetimbangan akan tercapai pada saat
penambahan larutan buffer yang dilakukan secara bertahap.
Penyimpanan Resin
Kebanyakan resin penukar ion dibuat dalam bentuk kering dan biasanya stabil selama
beberapa tahun. Resin penukar ion yang berada dalam bentuk cairan (butiran yang direndam
dalam cairan) masih bisa digunakan selama beberapa bulan. Namun demikian penyimpanannya
harus dijaga dari kontaminasi oleh mikroba. Khususnya untuk matrik resin berbahan dasar
selulosa dan dekstran. Sebelum disimpan sebaiknya ke dalam resin tersebut ditambahkan zat
antimikroba, misalnya natrium azida 0.02% untuk resin penukar kation dan garam
phenilmerkuri 0.01% untuk resin penukar ion.

D. Kromatografi Gel Filtrasi


Beberapa jenis kromatografi yang didiskusikan sebelumnya kebanyakan merujuk pada
interaksi antara komponen analit dengan fase diam yang didasarkan pada perbedaan polaritas,
volatilitas dan perbedaan muatan. Dalam hal ini, kromatografi gel filtrasi (juga sering disebut
kromatografi eksklusi atau gel permeation chromatography) lebih merujuk kepada perbedaan
sifat fisik berupa ukuran/bobot molekul dari komponen analit. Atau dengan kata lain
KROMATOGRAFI KOLOM (ADSORPSI, PENUKAR ION DAN GEL FILTRASI)

110

kromatografi gel filtrasi adalah metode kromatografi dimana pemisahan yang terjadi
disebabkan oleh perbedaan bentuk dan ukuran molekul (BM) dari setiap komponen analit yang
terdapat dalam suatu campuran Teknik kromatografi gel filtrasi mampu memisahkan molekul
dari ukuran 100 Da hingga 150.000 kDa. Kromatografi gel filtrasi menjadi alat yang penting
dalam proses pemurnian dari ribuan jenis protein, asam nukleat, enzim, polisakarida dan
makrobiomolekul lainnya. Selain itu, teknik ini juga dapat diguanakn untuk analisa kuantitatif
terutama dalam penentuan BM suatu senyawa dan interaksi biomolekul.
Prinsip dasar dari kromatografi gel filtrasi adalah seperti terlihat pada gambar berikut :

Gambar 10.4. Tahapan kromatografi gel filtrasi

Fase diam terdiri dari partikel inert yang memiliki ukuran pori-pori tertentu.
Pengamatan secara mikroskopis terhadap partikel fase diam yang digunakan dalam gel filtrasi
memiliki pola yang mirip dengan spon pembersih. Larutan yang terdiri dari campuran analit
dengan berbagai ukuran BM dan fase geraknya dilewatkan kedalam kolom yang mengandung
partikel berpori tersebut. Komponen dengan ukuran molekul yang lebih besar dari ukuran pori
tidak mampu terserap ke bagian dalam fase diam sehingga akan terelusi lebih cepat, sebaliknya
komponen yang ukurannya lebih kecil dari pori-pori fase diam akan masuk dan terdifusi di
dalam matriks fase diam sehingga waktu elusinya semakin lama. Sedangkan molekul dengan
ukuran sedang akan bermigrasi dengan kecepatan antara ukuran besar dan kecil. Dengan
demikian perbedaan kecepatan elusi ini akan menyebabkan masing-masing komponen dapat
terfraksinasi dan terpisah satu sama lin sesuai dengan ukuran BM-nya.
Karaktersiasi sifat fisik gel filtrasi
Beberapa sifat fisik yang penting dalam proses kromatografi gel filtrasi antara lain :
1. Limit Ekslusi : istilah ini menunjukan ukuran dari massa molekul terkecil dari suatu
komponen analit yang tidak mampu berdifusi ke dalam pori-pori fase diam. Semua
molekul dengan bobot molekul di atas limit ekslusi akan bergerak cepat dalam suatu zona
KROMATOGRAFI KOLOM (ADSORPSI, PENUKAR ION DAN GEL FILTRASI)

111

pemisahan yang bersifat linier. Misalnya, limit ekslusi dari Sephadex G-50 adalah 30.000
Da.
2. Fractional range : Sephadex G-50 memiliki range pemisahan antara 1500 30.000 Da.
Komponen yang masuk dalam range ini akan terpisah dengan baik dalam suatu fraksifraksi pemisahan yang linier.
3. Water regain and bed volume : Gel yang sering digunakan dalam kromatografi ekslusi
kebanyakan berada dalam bentuk terdehidrasidan harus dilarutkan dalam air sebelum
digunakan. Berat air yang digunakan untuk melarutkan 1 g gel kering dikenal dengan water
regain. Untuk G-50, nilainya adalah 5.0 + 0.3 g. Sedangkan bed volume merujuk pada
jumlah volume akhir ketika 1 g gel kering dilarutkan dalam air. Misalnya untuk G-50 nilai
bed volume adalah 9-11 mL/g berat gel kering.
4. Gel particle shape and size : Idealnya partikel gel harus memiliki ukuran dan bentuk yang
seragam dengan densitas pori-pori yang relative tinggi. Ukuran partikel pori biasanya
ditulis dalam satuan mesh atau diameter pori (m). Derajat resolusi yang dihasilkan dari
suatu pemisahan di dalam kolom bergantung pada ukuran gel particle tersebut. Ukuran
partikel yang besar (50 sampai 100 mesh) menghasilkan waktu pemisahan yang singkat
tetapi resolusinya rendah. Sebaliknya ukuran gel particle yang kecil (400 mesh) akan
menghasilkan resolusi yang tinggi tetapi pemisahan berlangsung lama. Ukuran yang efektif
tetapi tetap menghasilkan resolusi yang baik umumnya berkisar anatara 100 sampai 200
mesh.
5. Elution volume : ukuran volume larutan buffer yang digunakan untuk mengelusi komponen
analit hingga keluar dri kolom.
Karakteristik Kimia Gel
Beberapa tipe gel yang biasa digunakan antara lain: dekstran, poliakrilamid, agarosa dan
kombinasi antara poliakrilamid-dekstran. Gel berbasis dekstran tidak dapat dibuat dengan limit
ekslusi lebih dari 600.000 Da, karena ikatan silang yang terbentuk tidak cukup kuat untuk
mecegah terjadinya pemecahan gel akibat ukuran molekul analit yang lebih besar. Namun
demikian kombinasi dekstran dengan N,N-methylene bis akrilamid dapat digunakan untuk
fraksi molekul yang lebih besar. Poliakrilamid yang dihasilkan dari kopolimerisasi akrilamid
dengan agen cross linker N,N-methylene bis acrilamide tersedia dalam ukuran yang lebih
banyak dengan limit ekslusi 1800 400.000 Da. Di sisi lain, gel agarosa memiliki keunggulan
untuk pemisahan molekul yang lebih besar dan lebih bersifat inert. Struktur gel distabilkan oleh
adanya ikatan hydrogen. Agarose gel yang umum dipasaran diproduksi oleh supplier Bio-Rad
dengan merk (Bio-Gel A) dan Pharnmacia LKB dengan merk Sepharose dan Superose.
Beberapa tipe gel lain dan fractional range-nya dapat dilihat pada table berikut :
Tabel 10.3 Karakteristik media gel filtrasi
Nama
Dextran (sephadex)
G-10
G-15
G-25
G-50
G-200
Polyacrilamide (Bio-Gel)
P-2
P-4
P-10

Fractional range
(Daltons)

Water regain
(mL/g dry gel)

Bed volume
(ml/g dry gel)

0-700
100-1500
1000-5000
1500-30.000
5000-600.000

1.0 + 0.1
1.5 + 0.2
2.5 + 0.2
5.0 + 0.3
20 + 2.0

2-3
2.5-3.5
4-6
9-11
30-40

100-1800
800-4000
1500-20.000

1.5
2.4
4.5

3.0
4.8
9.0

KROMATOGRAFI KOLOM (ADSORPSI, PENUKAR ION DAN GEL FILTRASI)

112

P-100
P-300
Agarose
Sepharose 6B
Sepharose 2B
Superose 6 HR
Bio-Gel A-0.5
Bio-Gel A-50
Dextran-polyacrilamide
(Sephacryl)
S-200 HR
S-300 HR
S-400 HR

5000-100.000
60.000-400.000

7.5
18.0

15.0
36.0

10.000-4000.000
70.000-40.000.000
5.000 5000.000
10.000-500.000
100.000-50.000.000

5000-250.000
10.000-1500.000
20.000-8.000.000

Preparasi gel dan penyimpanan


Gel dekstran dan akrilamid diproduksi dalam bentuk terdehidrasi. Sebelum digunakan
perlu diredam dalam air terlebih dahulu. Lamanya perendaman berbeda untuk setiap gel. waktu
tersingkat adalah 3 sampai 4 jam pada suhu 20oC. Sedangkan untuk mendapatkan cross linking
yang sempurna sebaiknya gel direndam selama 72 jam khususnya untuk tipe P-300 atau G-200.
Perendamana dapat dipersingkat jika digunakan air panas.Gel agarose dan kombinasi agarosepoliakrilamide tidak memerlukan perendaman. Namun demikians sebelum digunakan
sebaiknya dibiarkan terlebih dahulu dalam ruang terbuka dan diaerasi. Untuk memisahkan
komponen/partikel pengotor yang lebih kecil bias dilakukan dalam tabung silinder dan dicuci 2
atau 3 kali volume gel dengan air hingga partikel tersebut terlepas darui matriks gel. Preparasi
khusus dengan menggunakan pompa vakum dan water aspirator juga bias dilakukan untuk
menghiolangkan gelembung/ gas pengotor (buiasanya 1 samapai 2 jam). Penambahan anti
microbial juga perlu dilakukan sebelum prose penyimpanan terutama untuk hydrated gel,
misalnya dengan penambahan Na-azida 0.02%.
Ukuran kolom
Untuk keperluan fraksinasi, biasanya digunakan kolom dengan panjang tidak lebih dari
100 cm. Rasio bed length to width antara 25 100. Untuk pemisahan kelompok, dapat
digunakan kolom yang lebih pendek dengan rasio bed length to width 5 10.
Aplikasi kromatografi gel filtrasi
Beberapa aplikasi dari kromatografi gel filtrasi antara lain adalah sebagai berikut :
1. Desalting dan pemurnian : pemisahan garam-garam anorganik, pelarut organic dan
mineral-mineral berukuran kecil dalam purifikasi makromolekul (protein/asam nukleat)
dapat dilakukan dengan teknik yang sederhana, cepat dan ekonomis dengan kromatografi
gel filtrasi.
2. Penentuan BM : Volume elusi untuk beberapa komponen analit dalam suatu campuran
dapat ditentukan secara proporsional dan nilainya berbanding lurus dengan ukuran
molekul. Untuk menetukan nilai BM suatu senyawa, biasanya digunakan molekul standar
sebagai pembanding lalu dibuat kurva kalibrasi dengan memetakan log Mi (BM) dengan
volume elusi. Selanjutnya larutan yang ingin ditentukan BM-nya dielusi dan dibandingkan
volume elusinya dengan standar.

KROMATOGRAFI KOLOM (ADSORPSI, PENUKAR ION DAN GEL FILTRASI)

113

BAB XI

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI


A. Pendahuluan
Kromatografi merupakan salah satu teknik pemisahan yang dapat memisahkan setiap
komponen dalam suatu campuran. Pemisahan ini didasarkan pada perbedaan migrasi setiap
komponen yang disebabkan karena perbedaan sifat interaksi dari setiap komponen pada fase
diam dan fase gerak. Berdasarkan fase geraknya metode kromatografi terbagi menjadi
kromatografi cair dan kromatografi gas. Salah satu contoh dari pengembangan metode
kromatografi cair adalah kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau HPLC (High
Performance Liquid Chromatography).
HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase
diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukurannya sempit
(kolom) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan
memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu
yang relatif singkat.
Resolusi adalah pengukuran secara fisik parameter suatu pemisahan. Resolusi dapat
ditingkatkan dengan mengoptimasi paremeter-parameter HPLC yaitu retensi, selektivitas, dan
efisiensi. Secara praktis parameter-parameter tersebut dapat dioptimalkan dengan mengubah :
1. komposisi dari fase gerak
2. laju alir
3. sifat kimia daru fase gerak
4. jenis kolom yang digunakan

Gambar 11.1 Gambaran resolusi suatu permisahan

Dibandingkan dengan metode kromatografi cair konvensional, HPLC memiliki


beberapa keunggulan antara lain :
1. Resolusi pemisahan cukup tinggi.
2. Waktu yang dibutuhkan relatif singkat.
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

114

3. Sensitifitas tinggi (mampu mengukur analit dalam jumlah relatif kecil < 1 ppm).
4. Parameter efesiensi pemisahan bisa dikontrol sehingga reprodusibilitasnya lebih baik.

B. Tipe Pemisahan dalam HPLC


Ada dua tipe pemisahan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari
pelarut dan fase diam.
a. Fase normal HPLC (normal phase)
Dalam tipe ini kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non
polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan
mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Senyawa-senyawa polar
dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding
degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan
lebih cepat melewati kolom.
b. Fase terbalik HPLC (reverse phase)
Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar
melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik
berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air
dan alkohol seperti metanol.
Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar
dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara
rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar
dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan
waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi
dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini
juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen
sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau
metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam
larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan
bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan
dalam HPLC.

C. Sistem Instrumentasi HPLC


Sistem instrumentasi HPLC secara umum digambarkan sebagai berikut :
Pompa bertekanan
tinggi

Autosampler/
Manual Injector

Column

Detector

Guard
Column

Data System/PC

Pelarut/Fase gerak
Gambar 11.2 Sistem instrumentasi HPLC

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

115

Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana
mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama
halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).

Gambar 11.3 Autosampler injector dalam alat HPLC

Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel
diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa
senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
komposisi yang tepat dari pelarut
temperatur pada kolom
Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi
sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.
Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode
umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet. Banyak
senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda
menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi
yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang
diserap.

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

116

Gambar 11.4 Skema kerja detektor UV pada alat HPLC

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang
melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan
tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan
menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.
Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada
gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut,
anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk
mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.
Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing
puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.
Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah
mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.
Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuanti?tas dari
senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.
Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah
diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari
senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan
puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor,
dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai
bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang
berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya?
Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode
pendeteksinya.

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

117

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah
puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena
Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini
mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya
memberikan puncak yang kecil.

D. Isocratic flow vs Gradient elution


Istilah isokratik merujuk kepada penggunaan fase gerak dimana komposisinya dibuat
tetap konstan selama proses pemisahan. Sedangkan istilah gradient elution menunjukan
penggunaan fase gerak dengan komposisi yang tidak tetap atau dengan kata lain dibuat gradient
konsentrasi selama proses pemisahan. Misalnya pemisahan dengan menggunakan campuran
fase gerak methanol : air. Komposisi awal methanol 10% dan komposisi akhir 90% setelah 20
menit. Perbedaan komposisi ini akan mengakibatkan terjadinya proses pemisahan dimana
terjadi interaksi yang spesifik antara komponen analit yang akan dipisahkan dengan fase gerak
dan fase diam yang berbeda polaritasnya.
Dalam mode isokratik, lebar peak meningkat seiring dengan lamanya waktu retensi
sehingga nilai N semakin kecil. Hal ini menyebabkan peak yang muncul belakangan akan
terlihat lebih pendek dan melebar. Sedangkan dengan gradient elution akan menurunkan
retensi dari peak yang muncul belakangan, sehingga komponen analit akan terelusi lebih cepat,
peak yang dihasilkan lebih tinggi dan ramping serta mode ini dapat meningkatkan resolusi
pemisahan dan menghindari terjadinya peak tailing atau peak broading. Namun demikian
perbedaan jenis fase gerak yang digunakan juga dapat menghasilkan proses pemisahan yang
berbeda tingkat resolusinya.
Salah satu contoh model HPLC yang ada di Laboratorium pangan PLT adalah HPLC
Series-200 dengan sistem Autosampler, UV & fluorosence detector spec kolom :C-18 25cm,
4.5 mm, 2,6m, Produksi Perkin Elmer.

Gambar 11.5 HPLC Series-200 Perkin Elmer

E. Jenis-jenis detector
UV Vis detector
UV detectors are the most commonly used detector. They measure the ability of a
sample to absorb light. This can be accomplished at one or several wavelengths. A variable
wavelength UV detector, capable of monitoring from 190 to 460-600 nm will be found suitable
for the detection of the majority of samples.
Refractive Index Detector

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

118

The detection principle involves measuring of the change in refractive index of the column
effluent passing through the flow-cell. The greater the RI difference between sample and
mobile phase, the larger the imbalance will become.
Fluorescence Detector
Very sensitive, but very selective. It is possible to detect even a presence of a single
analyte molecule in the flow-cell. Fluorescence occurs when compounds having specific
functional groups are excited by shorter wavelength energy and emit higher wavelength
radiation.
Radiochemical Detector
Radiochemical detection involves the use of radio-labeled material, usually Tritium or
Carbon-14. It operates by detection of fluorescence associated with beta-particle ionization,
and it is most popular in metabolite research.
Electrochemical Detector
Very sensitive, but very selective. It is based on the measurements of the current resulting
from an oxidation/reduction reaction of the analyte at a suitable electrode. The level of the
current is directly proportional to the analyte concentration.
Light Scattering Detector
Evaporative light scattering detectors involve nebulization of the column effluent to an
aerosol, followed by solvent vaporization to produce small solute droplets, and then these
droplets are detected in the light scattering cell.
Mass Spectroscopy Detector
The sample compound is ionized, it is passed through a mass analyzer, and the ion current
is detected.
Nuclear Magnetic Resonance Detector
Certain nuclei with odd numbered masses spin about an axis in a random fashion.
However, when placed between poles of a strong magnet, the spins are aligned either parallel
or anti-parallel to the magnetic field. The nuclei are then irradiated with electromagnetic
radiation that is absorbed and then the parallel nuclei are placed into a higher energy state;
consequently, they are now in "resonance" with the radiation. Each atom will produce a
different spectra depending on their location and adjacent molecules, or elements in the
compound.

F. Sistem Operasional
Sistem operasional HPLC series 200 Perkin Elmer adalah sebagai berikut :

Injeksi sample dilakukan secara automatic (autosampler) dengan vial sample 100 buah.
Masing-masing komponen instrumen (autosampler, pump, detector) dihubungan melalui
interface secara on line dengan PC dan printer sehingga bisa dilakukan control secara
automatic (external control).
Setiap kali loading sample selesai, harus dilakukan pencucian (washing) terhadap kolom
dengan menggunakan pelarut murni (Ex. Methanol pro Chromatography).
Jika alat HPLC lama tidak digunakan perlu dilakukan preconditioning agar pengukuran
tidak menyimpang/lebih akurat.
Untuk memudahkan operational alat dan analisa digunakan software TotalChrom dengan
basis Microsof windows 2000.
Cara menggunakan TotalChrom:

Window navigator memunculkan fungsi yang umum pada TotalChrom software.


KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

119

Baris judul dan menu berada di atas.


Panel pemilihan instrument berada di sebelah kiri.
Tombol-tombol setiap fungsi berada di tengah window navigator.
Baris status berada di bawah.

Preparasi Sample
1. Sebelum dilakukan loading sample yang akan diinjeksikan ke dalam kolom HPLC, perlu
diketahui kriteria sampel yang akan dianalisa (jenis zat, sifat kimia, polaritas, interaksi
dengan adsorben, dsb).
2. Sampel padat dilarutkan terlebih dahulu dalam pelarut (aquabides/metanol) bergantung
pada polaritas senyawa tersebut.
3. Untuk analisis kuantitatif, diperlukan standard sebagai pembanding dan dilakukan
analisis standard terlebih dahulu hingga diperloh kurva standar (Calibration curve)
melalui tahapan analisis sebagai berikut :
Membuat Method
1. Klik pada icon method.
2. setelah muncul start up window, pilih create new method.
3. Pada window instrument selection, pilih instrumen yang akan digunakan, lalu tekan Ok.
4. Pada windows instrumen note, di menu Template pilih jenis alat yang terpasang.
5. Pada window Data Acquisition di halaman Data Channels, isikan semua data yang
diperlukan.
6. Pada window Data Acquisition juga tetapi di halaman Real Time Plot, tentukan nilai
Offset dan fullscale dari kromatogram saat observasi lalu tekan Ok.
7. Lalu klik Next sebanyak 5 kali.
8. Klik File lalu pilih save. Buat nama method khusus, save lalu close.
9. Pada Global Paramater, pada kolom Instrument, tentukan instrument yang
dipergunakan, kemudian klik Vial by Vial.
Pada Window Append New Cycle di halaman Identification, tuliskan jenis sampel pada
Type, nama sampel pada Name dan tentukan metode yang digunakan pada method. Files
di data files tentukan nama kromatogram yang akan disimpannya. Klik Add.
Ulangi Langkah di atas untuk setiap standar dan sampel yang akan dianalisa. Jika telah
semua standar dan sampel dimasukkan maka klik close.
10. Klik File lalu pilih Save, pda documentation tuliskan deskkripsi ataupun keterangan dari
sequence tersebut. Lalu klik Ok. Pada window TotalChrom File Save-as di File Name
tuliskan nama sequence yang akan disimpan.
Loading Sampel
1. Tempatkan standard dan sample pada autosampler Vial sesuai yang ditulis pada
sequence.
2. Klik Instrument Setup.
3. Klik Sequence.
4. Pada baris sequence, tentukan nama sequence yang akan dipergunakan.
5. Klik Supress report/plots pada Processing.
6. Klik Start run when ready pada Run, lalu klik Ok.
Membuat Report Format Editor
1. Klik icon Method.
2. Pada window Method Editor, klik icon Others lalu pilih Report format editor.
3. Jika ingin mengubah nama judul, klik pada judulnya lalu ketik judul yang diinginkan,
lalu klik Ok.
4. Utuk menampilkan data apa saja yang ingin ditampilkan, klik icon Report kemudian pilih
data yang ingin ditampilkan.
5. Klik Option, lalu klik pada Print replot with Report. Ok.
6. Klik File lalu pilih Save kemudian Close.
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

120

Membuat Sequence
1. Pada window TotalChrom Navigator, pilih Build Sequence.
2. Pada Start up, pilih Create New Sequence.
Pembuatan kurva kalibrasi
1. Klik Build Method, tentukan method yang akan dikalibrasi, lalu Ok.
2. Klik icon Others, lalu pilih Graphic Editor.
3. Pada File Name, pilih chromatogram standard yang akan diolah.
4. Pada icon Calibration, pilih Edit Component.
5. Pilih peak yang akan diberi nama.
6. Pada baris Name, tentukan nama/component dari peak tersebut.
7. Klik Update Calibration.
8. Pada level, ketik tingkat standard dari chromatogram tersebut. (Standard 1, 2, 3... dst.).
Masukkan angkanya saja.
9. Masukkan nilai konsentrasi dari komponen yang dimaksud pada baris Amount.
10. Pada Calibration Type pilih Replace lalu klik Next.
11. Ulangi langkah 2 10 hingga semua peak telah diberi nama.
12. Klik icon return.
13. Klik Calibration lalu pilih Calibrate. Pada Calibration level, pilih tingkat standard dari
chromatogram tersebut. (Standard 1, 2, 3 dst.) klik Replace lalu Ok.
14. Klik icon File, lalu Save.
15. Untuk standard berikutnya, klik icon File lalu pilih New Data File. Tentukan
chromatogram standard berikutnya lalu ulangi langkah 2 14 hingga semua standard
telah selesai dikalibrasi.
16. Klik File lalu pilih Save, kemudian Exit.
17. Klik Build Method. Pada icon Component pilih edit component. Pada halaman
Calibration, kolom Calibration Type, pilih use curve, lalu tekan Ok.
18. Klik icon Others, kemudian pilih Fit Analysis untuk melihat kurva kalibrasinya.
Melihat dan Mencetak Hasil Analisa
1. Pada window Graphic Editor, klik File lalu pilih new data file.
2. Tentukan nama Chromatogram dari sample yang telah diinjeksikan, lalu tekan Ok.
3. Klik pada display, pilih Peak Report.
4. Jika ingin mencetak, klik pada Print lalu Ok.

G. Aplikasi HPLC
HPLC telah banyak digunakan untuk berbagai keperluan dalam bidang pemisahan dan
analisa suatu spesi kimia. Analisa yang dilakukan dapat bersifat kualitatif maupun kuantitatif
dimana untuk analisa kuantitaif biasanya digunakan senyawa baku sebagai pembanding.
1.

2.
3.
4.

Beberapa aplikasi dari HPLC antara lain adalah sebagai berikut:


Analisa kualitas lingkungan (analisa kandungan ion anorganik dalam sampel air, analisa
senyawa organic dalam air/atmosfer, analisa mikrosistin dan komponen sianogen dalam
bakteri, dll).
Analisa klinis dan biomedis (analisa komposisi obat, analisa farmakokinetik dan aktifitas
enzim/hormone).
Analisa di bidang industri kimia (analisa polimer, polivinil klorida, lubricant, antioksidan,
surfaktan, dll.)
Analisa bahan pangan (analisa vitamin, koenzim, protein/karbohidrat, enzim dan
komponen zat aditif atau mikrotoksin).

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

121

Gambar 11.6 Contoh hasil analisa HPLC untuk beberapa senyawa phenol

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

122

BAB XII

KROMATOGRAFI GAS

A. Pendahuluan
Pada kromatografi gas, komponen-komponen suatu cuplikan yang berupa uap difraksionasi
sebagai hasil distribusi atau partisi komponen-komponen tersebut antara fase gerak berupa gas
dann fase diam yang berada dalam kolom. Berdasarkan wujud fase diamnya, kromatografi gas
dibagi menjadi dua jenis yaitu kromatografi gas-padat dengan fase diam suatu padatan dan
kromatografi gas-cair dengan fase diam berupa cairan yang dilekatkan pada suatu media padat.
Pada kromatografi gas padat, partisi komponen cuplikan didasarkan atas fenomena adsorpsi
pada permukaan zat padat yang berfungsi sebagai fase diam. Jenis kromatografi ini penggunaannya
sangat terbatas karena kurva elusi yang dihasilkan atau puncak-puncak kromatogram yang
diperoleh umumnya tidk simetris.
Pada kromatografi gas cair, fase diam yang merupakan cairan dilapiskan dengan ketebalan
tertentu pada suatu media padat yang disebut zat padat pendukung (supporting materials). Metode
kromatografi gas-cair merupakan jenis kromatografi kolom yang penggunaannya sangat luas.
Peralatan kromatografi jenis ini pula yang merupakan peralatan pertama kromatografi yang
dikomersilkan. Saat ini terdapat kira-kira 30 produsen peralatan kromatografi yang menawarkan
tidak kurang dari 130 model yang berbeda dengan harga 15.000 USD hingga 80.000.USD. Dengan
komersialisai kromatografi gas-cair, berbagai pemisahan yang sebelumnya tidak dapat dipisahkan
dengan penyulingan bertingkat, dapat dipisahkan dengan alat kromatografi gas yang sederhana dan
tidak membutuhkan waktu yang lama serta keterampilan yang tinggi.

Gambar 12. 1 Gas Chromatography Instrument

B. Prinsip dasar Kromatografi Gas


Seluruh bentuk kromatografi terdiri dari fase diam dan fase gerak. Sebagainmana dalam
kromatografi gas-cair, fase gerak adalah gas seperti helium atau hidrogen dan fase diam adalah
cairan yang mempunyai titik didih yang tinggi diserap pada padatan.
KROMATOGRAFI GAS

123

Bagaimana kecepatan suatu senyawa tertentu bergerak melalui mesin, akan tergantung
pada seberapa lama waktu yang dihabiskan untuk bergerak dengan gas dan sebaliknya melekat
pada cairan dengan jalan yang sama.
Diagram alir kromatografi gas

Gambar 12.2. Skema kerja alat kromatografi gas

Injeksi sampel
Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis diinjeksikan pada mesin menggunakan semprit
kecil. Jarum semprit menembus lempengan karet tebal (Lempengan karet ini disebut septum) yang
mana akan mengubah bentuknya kembali secara otomatis ketika semprit ditarik keluar dari
lempengan karet tersebut.
Injektor berada dalam oven yang mana temperaturnya dapat dikontrol. Oven tersebut
cukup panas sehingga sampel dapat mendidih dan diangkut ke kolom oleh gas pembawa misalnya
helium atau gas lainnya.
Bagaimana kerja kolom?
Material padatan
Ada dua tipe utama kolom dalam kromatografi gas-cair. Tipe pertama, tube panjang dan
tipis berisi material padatan; Tipe kedua, lebih tipis dan memiliki fase diam yang berikatan dengan
pada bagian terdalam permukaannya.
Untuk menyederhanakan, kita akan melihat pada kolom terpadatkan. Kolom biasanya
dibuat dari baja tak berkarat dengan panjang antara 1 sampai 4 meter, dengan diameter internal
sampai 4 mm. Kolom digulung sehingga dapat disesuakan dengan oven yang terkontrol secara
termostatis. Kolom dipadatkan dengan tanah diatomae, yang merupakan batu yang sangat berpori.
Tanah ini dilapisi dengan cairan bertitik didih tinggi, biasanya polimer lilin.
Temperatur kolom
Temperatur kolom dapat bervariasi antara 50 oC sampai 250 oC. Temperatur kolom lebih
rendah daripada gerbang injeksi pada oven, sehingga beberapa komponen campuran dapat
berkondensasi pada awal kolom.
Dalam beberapa kasus, seperti yang anda akan lihat pada bagian bawah, kolom memulai
pada temperatur rendah dan kemudian terus menerus menjadi lebih panas dibawah pengawasan
komputer saat analisis berlangsung.
KROMATOGRAFI GAS

124

Bagaimana pemisahan berlangsung pada kolom?


Ada tiga hal yang dapat berlangsung pada molekul tertentu dalam campuran yang
diinjeksikan pada kolom:
1. Molekul dapat berkondensasi pada fase diam.
2. Molekul dapat larut dalam cairan pada permukaan fase diam
3. Molekul dapat tetap pada fase gas
Dari ketiga kemungkinan itu, tak satupun yang bersifat permanen.
Senyawa yang mempunyai titik didih yang lebih tinggi dari temperatur kolom secara jelas
cenderung akan berkondensasi pada bagian awal kolom. Namun, beberapa bagian dari senyawa
tersebut akan menguap kembali dengan dengan jalan yang sama seperti air yang menguap saat
udara panas, meskipun temperatur dibawah 100 oC. Peluangnya akan berkondensasi lebih sedikit
selama berada didalam kolom.
Sama halnya untuk beberapa molekul dapat larut dalam fase diam cair. Beberapa senyawa
akan lebih mudah larut dalam cairan dibanding yang lainnya. Senyawa yang lebih mudah larut
akan menghabiskan waktunya untuk diserap pada fase diam: sedangkan senyawa yang suka larut
akan menghabiskan waktunya lebih banyak dalam fase gas.
Proses dimana zat membagi dirinya menjadi dua pelarut yang tidak bercampurkan karena
perbedaan kelarutan, dimana kelarutan dalam satu pelarut satu lebih mudah dibanding dengan
pelarut lainnya disebut sebagai partisi. Sekarang, anda bisa beralasan untuk memperdebatkan
bahwa gas seperti helium tidak dapat dijelaskan sebagai pelarut. Tetapi, istilah partisi masih dapat
digunakan dalam kromatografi gas-cair.
Anda dapat mengatakan bahwa substansi antara fase diam cair dan gas. Beberapa molekul
dalam substansi menghabiskan waktu untuk larut dalam cairan dan beberapa lainnya menghabiskan
waktu untuk bergerak bersama-sama dengan gas.
Waktu retensi
Waktu yang digunakan oleh senyawa tertentu untuk bergerak melalui kolom menuju ke
detektor disebut sebagi waktu retensi. Waktu ini diukur berdasarkan waktu dari saat sampel
diinjeksikan pada titik dimana tampilan menunujukkan tinggi puncak maksimum untuk senyawa
itu.
Setiap senyawa memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk senyawa tertentu, waktu
retensi sangat bervariasi dan bergantung pada:
Titik didih senyawa. Senyawa yang mendidih pada temperatur yang lebih tinggi daripada
temperatur kolom, akan menghabiskan hampir seluruh waktunya untuk berkondensasi sebagai
cairan pada awal kolom. Dengan demikian, titik didih yang tinggi akan memiliki waktu retensi
yang lama.
Kelarutan dalam fase cair. Senyawa yang lebih mudah larut dalam fase cair, akan mempunyai
waktu lebih singkat untuk dibawa oleh gas pembawa.. Kelarutan yang tinggi dalam fase cair
berarti memiiki waktu retensi yang lama.
Temperatur kolom. Temperatur tinggi menyebakan pergerakan molekul-molekul dalam fase
gas; baik karena molekul-molekul lebih mudah menguap, atau karena energi atraksi yang
tinggi cairan dan oleh karena itu tidak lama tertambatkan. Temperatur kolom yang tinggi
mempersingkat waktu retensi untuk segala sesuatunya di dalam kolom.
Untuk memberikan sampel dan kolom, tidak ada banyak yang bisa dikerjakan
menggunakan titik didih senyawa atau kelarutannya dalam fase cair, tetapi anda dapat mempunyai
pengatur temperatur.
Semakin rendah temperatur kolom semakin baik pemisahan yang akan anda dapatkan,
tetapi akan memakan waktu yang lama untuk mendapatkan senyawa karena kondensasi yang lama
pada bagian awal kolom! Dengan kata lain, menggunakan temperatur tinggi, segala sesuatunya
akan melalui kolom lebih cepat, tetapi pemisihannya kurang baik. Jika segala sesuatunya melalui
KROMATOGRAFI GAS

125

kolom dalam waktu yang sangat singkat, tidak akan terdapat jarak antara puncak-puncak dalam
kromatogram.
Jawabannya dimulai dengan kolom dengan suhu yang rendah kemudian perlahan-lahan
secara teratur temperaturnya dinaikkan.
Pada awalnya, senyawa yang menghabiskan lebih banyak waktunya dalam fase gas akan
melalui kolom secara cepat dan dapat dideteksi. Dengan adanya sedikit pertambahan temperatur
akan memperjelas perlekatan senyawa. Peningkatan temperatur masih dapat lebih `melekatan`
molekul-molekul fase diam melalui kolom.

C. Cara memilih kolom


Terdapat dua macam kolom kromatografi gas yang lazim digunakan yakni kolom terbuka dan
kolom yang dipak. Kolom terbuka merupakan tabung terbuka yang permukaan dalamnya dilapisi
dengan cairan fase diam. Jenis kolom seperti ini mempunyai beberapa keunggulan, diantaranya adalah
karena tekanan yang dibutuhkan rendah jadi kolom dapat dibuat panjang, namun jumlah cuplikan harus
sedikit karena kapasitas kolom seperti ini kecil sedangkan kolom packing, fase diamnya di-packing di
dalam suatu tabung kaca atau logam.
Dalam menyiapkan kolom packing, zat padat pendukung dan fase diam yang akan digunakan
harus memiliki karakteristik tertentu agar dapat digunakan untuk keperluan pemisahan yang
diinginkan.
Pemilihan zat padat pendukung yang ideal adalah :
1. Bulat, merata, kecil (20-40m) dengan kekuatan mekanis yang baik
2. Inert pada suhu tinggi
3. Mudah dibasahi oleh fase cair dan membentuk lapisan merata.
Sedangkan fase diam yang ideal adalah yang :
1. Tidak mudah menguap (td>200oC) tau lebih tinggi dari suhu operasi kolom.
2. Memiliki kestabilan termal yang tinggi
3. Inert secara kimia
Berdasarkan ukurannya terdapat 3 jenis kolom kromatografi gas yaitu kolom konvensional
(diameter 1/8 -1/4) dengan panjang 6 20 kaki dan kolom preparatif (diameter dengan panjang
>10 kaki) serta kolom kapiler. Salah satu contoh kolom yang banyak dipakai dalam kromatografi gascair adalah kolom kapiler yang berdiameter 0.1 0.5 mm dengan panjang 10 100 m. Secara skematis
jenis-jenis kolom yang yang dapat digunakan dalam kromatografi gas adalah ebagai berikut :

Gambar 12.3. Beberapa tipe kolom kromatografi gas (a) 1/8 packed column (b) kolom tipis WCOT (c) kolom
WCOT tebal (d) 1/16 micropacked column (e) PLOT column (f) SCOT column

KROMATOGRAFI GAS

126

Untuk mengetahui informasi mengenai spesifikasi kolom sesuai dengan keperluan analisis
dapat dilakukan melalui katalog dari berbagai supplier produk kolom kromatografi gas seperti J&W
atau Restex. Dari spesifikasi produk yang ditawarkan dapat diperoleh informasi menegnai harga, limit
temperatur, cara injeksi, jenis fase diam yang digunakan dan bahkan seringkali dilengkapi dengan data
kromatogram hasil dari pemisahan komponen yang diinginkan serta hasil optimasi kondisi analisa
percobaan. Salah satu contoh adalah sebagai berikut :

Gambar 12.4. Kromatogram hasil pemisahan asam lemak dengan kolom CBP20

Pertimbangan pertama dalam memilih kolom adalah memilih produsen/merk yang benar
dengan mempertimbangkan : konsistensi dari kualitas yang tinggi dalam memproduksi kolom.
Pertimbangan kedua memilih kolom yang ideal untuk suatu analisis yang spesifik yaitu :
- Pemilihan fase diam yang benar
- Diameter kolom
- Tebal lapisan fase diam dan
- Panjang kolom.

D. Karakteritik kolom
KROMATOGRAFI GAS

127

Kepolaran
Kepolaran menunjukkan bagaimana komponen-komponen contoh berinteraksi dengan fase diam.
Fase non-polar memisahkan komponen-komponen terutama berdasarkan titik didih. Fase sedikit
polar (intermediately polar phase) meretensi komponen-komponen berdasarkan titik didih dan
komponen dipol tereduski atau melalui ikatan hidrogen. Fase polar dan sangat polar meretensi
lebih kuat senyawa polar dibanding senyawa non-polar akibat interaksi dipol-dipol antar gugus
fungsi dari komponen dengan fase diam.
Kestabilan thermal
Secara umum jika polaritas kolom meningkat, maka kestabilan thermal menurun. Kestabilan
thermal yang baik dapat diperoleh dengan menggunakan fase diam yang berikatan silang
terimmobilisasi. Namun ikatan silang selain merubah sifat fisik juga dapat merubah sifat kimia dari
fase diam.
Ketebalan lapisan fase diam
Lapisan yang tebal akan meretensi komponen lebih lama dan memerlukan suhu yang lebih tinggi
untuk mengelusi komponen pada nilai k yang sama. Pada lapisan yang tits, komponen akan
terelusi lebih cepat dan hanya membutuhkan suhu yang tidk terlalu tinggi. Secara umum lapisan
yang tebal digunakan pada komponen bertitik didih rendah untuk meningkatkan interaksinya
dengan fase diam, sehingga meningkatkan rsolusi pemisahn. Dengan meebalnya lapisan fase diam,
resolusi dari dua komponen yang terelusi secara berurutan juga akan meningkat. Namun lapisan
tebal jika digunakan untuk senyawa-senyawa polar dapat menurunkan resolusi atau menyebabkan
perubahan orde elusi dari beberapa komponen.
Panjang kolom
Untuk analisis isotermal, besaran plat teoritis dan waktu analisis berhubungan secara proporsional
dengan panjang kolom. Jika panjang kolom diperbesar dari 30m ke 60m, resolusi akan meningkat
kira-kira 40% dan waktu anlisis meningkat kira-kira dua kalinya. Detektor sensitif memerlukan
column bleed (temperatur degradasi fase diam) yang rendah pada penggunaan temepratur yang
tinggi. Column bleed yang rendah juga memungkinkan kuantisasi komponen-komponen dengan
titik didih tinggi dan mencegah kontaminasi pada detektor. Suatu kolom harus memiliki permukaan
yang benar-benar inert agar komponen renik dapat terelusi sempurna di dalam kolom. Indeks
retensi dari kolom juga perlu diperhatikan karena indeks retensi dari analit adalah suatu kunci
dalam mengidentifikasi suatu komponen. Keboleh ulangan indeks retensi dari suatu kolom harus
baik atau mempunyai kisaran rentang yang sempit.

E. Pemrograman Temperatur
Temperatur kolom merupakan variabel penting yang harus terkontrol dengan baik untuk
memperoleh hasil analisis yang baik. Kebergantungan retensi komponen dalam kolom pad
atekanan uap dari masing-masing komponen yang akan dipisahkan, menyebabkan suatu campuran
yang terdiri dari berbeagai komponen dengan titik didih yang sangat bervariasi tidak mungkin
dipisahkan dengan sempurna jika menggunakan sistem elusi isotermal. Komponen yang mudah
menguap mungkin dapat dipisahkan dengan baik, tetapi komponen dengan titik didih tinggi akan
terelusi dengan waktu retensi yang besar dan disertai dengan gejala pelebaran puncak yang nyata.
Sebaliknya jika digunakan tempertaur yang tinggi maka komponen dengan titik didih tinggi akan
terelusi dengan baik namun komponen-komponen yang mudah menguap akan menunjukan resolusi
yang kurang baik bahkan terdapat kemungkinan komponen tersebut terelusi bersama-sama.

KROMATOGRAFI GAS

128

Untuk menghindari hal di atas, maka temperatur kolom dinaikkan secara bertahap selama
analisis berlangsung. Cara ini dikenal dengan istilah pemrograman temperatur. Dalam
pemrograman temperatur, faktor-faktor yang harus diperhatikan anatara lain :
- Variasi kelarutan dari komponen
- Perubahan keboleh-penguapan dari komponen
- Kstabilan thermal
- Perubahan laju alir gas pembawa
- Kestabilan fase diam.

F. Detektor
Ada beberapa tipe detektor yang biasa digunakan. Detektor ionisasi nyala (flame ionization
detector) yang dijelaskan pada bagian bawah penjelasan ini, merupakan detektor yang umum dan
sering digunakan dalam anilasis kromatografi gas. Jenis-jenis detektor lainnya antara lain :
- Detektor daya hantar paas (Thermal Conductivity Detector, TCD)
- Detektor penangkapan elektron (Electron Capture Detector, ECD)
- Detector fotoionisasi (Photo Ionization Detector, PID)
- Detektor Emisi Atom (Atomica Emission Detector, AED)
- Electrolytic Conductivity Detector, ELCD)
Detektor ionisasi nyala (Flame Ionization Detector/ FID)
Dalam mekanisme reaksi, pembakaran senyawa organik merupakan hal yang sangat
kompleks. Selama proses, sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dihasilkan dalam nyala.
Kehadiran ion dan elektron dapat dideteksi. Seluruh detektor ditutup dalam oven yang lebih panas
dibanding dengan temperatur kolom. Hal itu menghentikan kondensasi dalam detektor.

Gambar 12.5. Skema kerja detektor FID

KROMATOGRAFI GAS

129

Jika tidak terdapat senyawa organik datang dari kolom, anda hanya memiliki nyala hidrogen yang
terbakar dalam air. Sekarang, anggaplah bahwa satu senyawa dalam campuran anda analisa mulai
masuk ke dalam detektor.
Ketika dibakar, itu akan menghasilkan sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dalam
nyala. Ion positif akan beratraksi pada katoda silinder. Ion-ion negatif dan elektron-elektron akan
beratraksi pancarannya masing-masing yang mana merupakan anoda. Hal ini serupa dengan apa
yang terjadi selama elektrolisis normal.
Pada katoda, ion positif akan mendatangi elektron-elektron dari katoda dan menjadi
netral. Pada anoda, beberapa elektron dalam nyala akan dipindahkan pada elektroda positif; ion-ion
negatif akan memberikan elektron-elektronnya pada elektroda dan menjadi netral.
Kehilangam elektron-elektron dari satu elektroda dan perolehan dari elektroda lain, akan
menghasilkan aliran elektron-elektron dalam sirkuit eksternal dari anoda ke katoda. Dengan kata
lain, anda akan memperoleh arus listrik.
Arus yang diperoleh tidak besar, tetapi dapat diperkuat. Jika senyawa-senyawa organik
lebih banyak dalam nyala, maka akan banyak juga dihasilkan ion-ion, dan dengan demikian akan
terjadi arus listrik yang lebih kuat. Ini adalah pendekatan yang beralasan, khususnya jka anda
berbicara tentang senyawa-senyawa yang serupa, arus yang anda ukur sebanding dengan jumlah
senyawa dalam nyala.
Kekurangan detektor ionisasi nyala
Kekurangan utama dari detektor ini adalah pengrusakan setiap hasil yang keluar dari
kolom sebagaimana yang terdeteksi. Jika anda akan mengrimkan hasil ke spektrometer massa,
misalnya untuk analisa lanjut, anda tidak dapat menggunakan detektor tipe ini.
Penerjemahan hasil dari detektor
Hasil akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili satu senyawa
dalam campuran yang melalui detektor. Sepanjang anda mengontrol secara hati-hati kondisi dalam
kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang
tampak-tentu saja anda atau seseorang lain telah menganalisa senyawa murni dari berbagai
senyawa pada kondisi yang sama.

Area dibawah puncak sebanding dengan jumlah setiap senyawa yang telah melewati
detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui komputer yang dihubungkan dengan
monitor. Area yang akan diukur tampak sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar yang
disederhanakan.
Perlu dicatat bahwa tinggi puncak tidak merupakan masalah, tetapi total area dibawah
puncak. Dalam beberapa contoh tertentu, bagian kiri gambar adalah puncak tertinggi dan memiliki
area yang paling luas. Hal ini tidak selalu merupakan hal seharusnya..

KROMATOGRAFI GAS

130

Mungkin saja sejumlah besar satu senyawa dapat tampak, tetapi dapat terbukti dari kolom
dalam jumlah relatif sedikit melalui jumlah yang lama. Pengukuran area selain tinggi puncak dapat
dipergunakan dalam hal ini.

Detektor Penangkapan Elektron (Electron Capture Detector)


Detektor ini bekerja berdasarkan prinsip terjadinya penagkapan electron oleh komponenkomponen cuplikan yang mempunyai afinitas terhadap electron bebas. Komponen-komponen
tersebut dapat berupa senyawa-senyawa yang memiliki unsure atau gugus yang mempunyai
keelektronegatifan yang tinggi. BIla dikenai electron berenergi rendah, maka senyawa-senyawa
tersebut cenderung untuk mengkap electron sehingga terbentuk ion-ion negative.
Secara sederhana kontruksi detector pengkapan electron dapat digambarkan sebagai
berikut :

Gambar 12.6. Kontruksi detektor penangkapan electron

Bila suatu senyawa dengan keelktronegatifan tinggi masuk ked lam ruang detector yang
berisi awan electron, maka senyawa tersebut akan beraksi dengan electron membentuk ion molekul
bermuatan negative. Partikel-partikel yang bermuatan negative ini akan dibawa keluar dari
ruangan detector oleh aliran gas pembawa. Akibatnya untuk setiap partikel yang dibawa keluar
akan menghasilkan pengurangan satu electron oleh system. Pengurangan ini menyebabkan arus
yang sebelumnya mengalir dengan konstan dari detector akan berkurang. Perubahan arus inilah
yang dicatat oleh rekorder sebagai puncak-puncak kromatogram.

KROMATOGRAFI GAS

131

BAB XIII

KROMATOGRAFI GAS SPEKTROSKOPI MASSA


(GCMS)

A. Prinsip dasar GCMS


Kromatografi Gas Spektroskopi Massa atau sering disebut GCMS (Gas
Chromatography Mass Spectrometry) adalah teknik analisis yang menggabungkan dua metode
analisis, yaitu Kromatografi Gas dan Spektroskopi Massa.
Kromatografi Gas adalah metode analisis, dimana sample terpisahkan secara fisik
menjadi bentuk molekul-molekul yang lebih kecil (hasil pemisahan dapat dilihat berupa
Kromatogram). Sedangkan spektroskopi massa adalah metode analisis, dimana sample yang
dianalisis akan diubah menjadi ion-ion gas-nya, dan massa dari ion-ion tersebut dapat diukur
berdasarkan hasil deteksi berupa Spektrum Massa).
Pada GC hanya terjadi pemisahan untuk mendapatkan komponen yang diinginkan,
sedangkan bila dilengkapi dengan MS (berfungsi sebagai detector) akan dapat mengidentifikasi
komponen tersebut, karena bisa membaca Spectrum Bobot Molekul pada suatu komponen,
juga terdapat LIBRARY (reference) pada software.

B. Proses Pemisahan pada GCMS


Pemisahan komponen senyawa dalam GCMS terjadi didalam kolom (kapiler) GC dengan
melibatkan dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam adalah zat yang ada didalam
kolom, sedangkan fase gerak adalah gas pembawa (Helium ataupun Hidrogen dengan
kemurnian tinggi, yaitu 99,995%).
Proses pemisahan dapat terjadi karena terdapat perbedaan kecepatan alir dari tiap
molekul didalam kolom. Perbedaan tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan afinitas antar
molekul dengan fase diam yang ada didalam kolom. Selanjutnya komponen-komponen yang
telah dipisahkan tersebut masuk ke dalam ruang MS yang berfungsi sebagai detektor Secara
intrumentasi, MS adalah detektor bagi GC.

Gambar 13.1. Model proses pemisahan pada GCMS

Keterangan:
Kurva dengan warna garis hitam adalah kromatogram. Dan garis-garis berwarna merah adalah
spectrum massa.

KROMATOGRAFI GAS SPEKTROSKOPI MASSA

132

Sample-sample yang dapat dianalisis dengan menggunakan GCMS, harus memenuhi


beberapa syarat, diantaranya:

Dapat diuapkan hingga suhu ~400oC;


Secara termal stabil (tidak terdekomposisi pada suhu ~400oC);
Sample-sample lainnya dapat dianalisis setelah melalui tahapan preparasi yang khusus.

1. Instrumentasi GCMS
Bagian-bagian dari instrumen GC adalah sebagai berikut:

Pengatur aliran gas (Gas Flow Controller);


Tempat injeksi sample (Injector);
Kolom (tempat terjadinya pemisahan);
Lalu dihubungkan pada interface (fungsi interface adalah sebagai penghubung antara GC
dan MS).

Sedangkan bagian-bagian dari MS adalah sebagai berikut:

Tempat masuk sample (melalui interface);


Sumber ion (Ion Source);
Pompa vakum (Vacuum Pump);
Penganalisis Massa (Mass Analyzer);
Detektor (Electron Multiplier Detector).
Sistem Pengolah Data (Personal Computer)

Setelah data tedeteksi, lalu data dikirimkan ke Sistem Pengolah Data (pada Personal
Computer) untuk diolah sesuai dengan tujuan analisis.

Gambar 13.2. Bagian-bagian Instrumen GCMS QP2010

C. Kegunaan bagian-bagian instrument


1. Pengatur Aliran Gas (Gas Flow Controller);
Untuk mengatur aliran gas didalam GC. Pada GCMS QP 2010, menggunakan GFC
elektrik. Kelebihannya bila dibandingkan dengan yang manual adalah:

Lebih mudah penggunaannya;

KROMATOGRAFI GAS SPEKTROSKOPI MASSA

133

Mengurangi kesalahan yang mungkin terjadi dalam pengaturan manual, misal Split
Ratio;
Meningkatkan keakuratan pengulangan analisis.

2. Injektor (Sample Injector);


Sebagai tempat injeksi sample. Adapun fungsi secara mendetail adalah:

Menguapkan sample (pelarut dan analat);


Mencampurkan sample dengan gas pembawa;
Menyalurkan campuran gas tersebut ke dalam kolom.

3. Kolom (Column);
Umumnya GC menggunakan kolom kapiler (capillary column). Fungsi kolom adalah
sebagai tempat terjadinya pemisahan molekul-molekul dalam sample.
Macam-macam kolom :

Wall Coated Open Tubular (WCOT), adalah kolom yang dilapisi oleh lapisan tipis
polimer pada dinding kolom bagian dalamnya;
Porous Layer Open Tubular (PLOT), adalah kolom yang dilapisi oleh partikel padat
yang berrongga/porous pada dinding kolom bagian dalam;
Packed Capillary, adalah kolom yang diisi penuh oleh partikel padat didalam kolom.

Zat pengisi kolom (WCOT) pada umumnya adalah: Polysiloxane, atau Polyethyleneglycol.
Ukuran kolom :

Panjang: Biasanya berkisar dari 30~60 m.


Diameter bagian dalam (i.d): Biasanya 0,25mm (narrow bore), 0,32mm (semi wide
bore), atau 0,53mm (wide bore).
Ketebalan fase diam: Biasanya berkisar dari 0,1~3 mikron.

4. GCMS Interface
GCMS interface memiliki fungsi untuk mengirimkan sample dari GC ke MS dengan
meminimalkan kehilangan sample saat pengiriman. Untuk instrumen GCMS QP2010,
menggunakan interface sambungan langsung (direct interface). Artinya kolom langsung
masuk ke dalam alat MS. Model interface seperti ini memiliki kelebihan dalam
penyesuaian suhu yang lebih cepat, dari dingin ke panas atau sebaliknya.
5. Sumber Ion (Ion Source)
Memiliki fungsi untuk mengionkan sample yang berbentuk gas sebelum dianalisis di
Penganalisis Massa (Mass Analyzer). Ada tiga macam ionisasi yang dapat dilakukan oleh
GCMS QP2010, yaitu:

(EI) Electron Impact Ionization,


(P)CI ((Positive) Chemical Ionization), dan
NCI (Negative Chemical Ionization).

Sedangkan gambaran secara singkatnya adalah sebagai berikut:

EI adalah teknik ionisasi dengan menggunakan elektron energi tinggi, yaitu sebesar 70
eV. Memiliki kelebihan bila digunakan untuk identifikasi senyawa, karena pemisahan
molekul yang terjadi cukup baik.
(P)CI adalah teknik ionisasi dengan menggunakan gas pembantu (reagent gas). Gas
yang dapat digunakan antara lain adalah metana (CH4), isobutana (C4H10), atau
Amoniak (NH3). Digunakan untuk proses ionisasi yang lebih ringan (dibandingkan
dengan EI). Menghasilkan ion gas positif yang akan bereaksi dengan analat/sample.

KROMATOGRAFI GAS SPEKTROSKOPI MASSA

134

NCI adalah teknik ionisasi dengan menggunakan gas pembantu (reagent gas) sama
dengan PCI. Perbedaannya terletak pada ion gas yang dihasilkan, yaitu menghasilkan
ion gas negatif. Bersifat selektif, sehingga sangat sensitif (karena meminimalisir noise
pada Spektrum Massa). Dalam analisis biasa digunakan untuk senyawa dengan
kandungan unsur halogen.
Selain itu, dalam mode NCI juga terdapat mode pilihan lain yaitu SEI (Simulated EI), dan
SCI (Simulated CI). Kepekaan SEI dan SCI tidaklah sama seperti EI, dan (P)CI. Kedua
mode itu memiliki fungsi untuk melakukan analisis secara EI dan CI dalam mode NCI,
tanpa mengubah Sumber Ion secara fisik.
6. Sistem Vakum (Vacuum System)
a. Dua tipe vakum yang dimiliki oleh GCMS QP2010, yaitu:
Pompa vakum tinggi, memiliki fungsi untuk mengurangi dan mempertahankan tekanan
pada MS saat analisis. Tekanan tinggi yang dipertahankan itu juga dapat menambah
sensitivitas pada proses analisis Spektrum Massa pada MS.
Pompa vakum tinggi pada GCMS PQ2010 terdiri dari dua buah Turbo Molecular Pump
dengan spesifikasi berbeda (260 L/s dan 65 L/s).
Pompa vakum rendah, memiliki fungsi untuk mengurangi tekanan udara luar didalam MS.
b. System vakum diperlukan karena:

Ion-ion sample harus berjalan dari sumber ion menuju detektor tanpa, atau dengan
sedikit tumbukan dengan partikel-partikel lainnya.
Mengurangi reaksi-reaksi ion-molekular
Mengurangi gangguan (background interference) dan meningkatkan sensitivitas
Memperpanjang umur filamen

7. Penganalisis Massa (Mass Analyzer)


Mass analyzer terdiri dari empat batang logam yang dapat diberikan muatan
(Quadrupole), baik positif ataupun negatif. Berfungsi secara selektif dengan mengatur
sendiri voltase dari muatan batangan logam untuk berbagai massa ion. Sehingga ion-ion
yang dapat melewatinya hanya ion-ion yang sesuai dengan voltase dan massa ion yang
diinginkan.
Quadrupole memisahkan ion-ion berdasarkan stabilitas osilasi ion-ion didalam ruang
Quadrupole.

Gambar 13.3. Sistematika Kerja Quadrupole

8. Detektor
Ion-ion yang keluar dari penganalisis massa dideteksi dan jumlahnya diukur oleh
detektor. Dalam GCMS QP2010 menggunakan Electron Multiplier Detector. Kelebihan
KROMATOGRAFI GAS SPEKTROSKOPI MASSA

135

dari detektor macam ini adalah sensivitasnya yang lebih baik dari detektor biasa. Dibantu
oleh lensa tambahan (overdrive lens), detektor akan mendapat hasil yang lebih akurat
karena partikel-partikel noise (seperti molekul-molekul netral) dihilangkan.

D. Faktor-faktor yang harus dipertimbangkan sebelum memulai analisis


a. Karakter sampel, kondisi dan tujuan analisis :
-

Sample: memenuhi persyaratan, yaitu mudah menguap dan stabil secara termal.
Kondisi sample: gas, cairan, padatan, sumber biologis, keperluan analisis lingkungan.
Tujuan analisis: kualitatif, dan kuantitatif.

b. Memilih Mode Ionisasi


-

EI: Spektrum massa yang standar dapat diperoleh; library dari spectrum massa dijual
secara komersial; dapat mengidentifikasi komponen-komponen.
CI: Digunakan untuk memperoleh data kualitatif tentang Bobot Molekul suatu
senyawa, yang tidak dapat dilakukan oleh mode EI.
NCI: Digunakan untuk analisis senyawa-senyawa yang memiliki afinitas besar
terhadap electron. Misal, senyawa-senyawa halogen, pestisida yang mengandung
organochlorine.

c. Memilih Kolom Untuk Analisis


-

Memiliki resolusi yang baik. (Kolom kapiler memiliki resolusi yang lebih baik
daripada kolom kemas (packed column).
- Fase diam, apakah polar atau non-polar. Senyawa yang polar akan lebih terpisahkan
dengan fase diam yang polar, begitupun sebaliknya. Polar atau tidaknya suatu kolom
tergantung dari fase diamnya.
- Ketebalan Fase Diam (Pengisi Kolom)
- Fase diam yang semakin tebal akan menahan sample lebih banyak, dan sebaliknya.
Contoh kasus penggunaan: sample yang sangat mudah menguap, membutuhkan fase diam
yang lebih tebal. Dan sample yang memiliki titik uap tinggi membutuhkan fase diam yang
lebih tipis.
d. Panjang Kolom
Pada umumnya panjang kolom kapiler berkisar dari 30~60 m. Semakin panjang maka
semakin mahal harganya.

2. Sistem Opersional GCMS


Salah satu contoh GCMS yang ada di Laboratorium Pangan PLT adalah GCMS Merk
Shimadzu, QP 2010 dengan sistem operasional sebagai berikut :
a. Menyalakan dan mengkondisikan alat:

Dibuka gas regulator 1x putaran 900 berlawanan arah jarum jam.


Pada regulator, penunjuk di sebelah kanan menunjukkan isi gas pada tabung
sebenarnya (antisipasi gas habis minimal tekanan 5000 Psi).
Pada regulator, penunjuk di sebelah kiri menunjukkan volume gas yang keluar dari
tabung.
Dihubungkan ke stop kontak seluruh kabel yang berhubungan dengan alat GC, MS, PC
dan printer.
Nyalakan alat GC, dengan menekan tombol kanan bawah pada bagian depan GC, tekan
tombol flow, kemudian tekan tombol PF3 (On).
Tekan tombol MS pada bagian belakang kiri bawah.
Nyalakan computer

KROMATOGRAFI GAS SPEKTROSKOPI MASSA

136

Gambar 13.4. Instrumen GCMS yang langsung terhubung dengan PC.

Klik GCMS Real Time Analysis. Ketikkan Password. Tunggu hingga terhubung.
Klik Top, Klik Vacuum control, Auto Start Up, tunggu hingga ada tulisan Completed.
Prosesnya bisa dilihat di bagian Advanced. Bila selesai klik Close.
Klik Tuning, lihat daftar Low Vacuum harus < 15 Pa dan High Vacuum < 1,5 .10-3 Pa,
Isikan kondisi alat yang diinginkan, detector 0.7 KV.
Bila telah memenuhi persyaratan, klik filament, lihat keadaan peak M/Z 18 harus lebih
besar dari M/Z 28. (Rasio perbandingannya adalah maksimal 18/28 = 2/1)
Save parameter

b. Leak Test (tes kebocoran)


# Monitor group: water air, detector: 0,5 kV, Filamen ON
Pada Start Auto Tuning , keadaannya harus:
Peak 69 > 502 >219
Peak pengotor < 50 %
Selisih FWHM 0,1 dari yang terkecil hingga terbesar.
Ratio M/Z 502 > 2%
Column Flow = 1.1 ml/min
c. Cara meng-inject sample

Vacuum-kan GC MS.
Tekan Data Acquisition.
Masuk ke parameter (tab) GC, MS, dan Sampler (diatur sesuai keperluan analisis).
Tekan File, Save Method File.
Tekan Sample Log In.
Isi parameter yang ada (opsi Tuning File, bila dikosongkan akan memanggil file
autotuning terakhir).
Tekan Standby.
Tekan Start.

d. Cara meng-inject sample lebih dari satu

Vacuumkan GC MS.
Tekan Batch Processing.
Tekan Wizard (atur parameter sesuai keperluan analisis) =>
-auto increment = akan otomatis setelah inject 001 jadi 002
-auto average = dirata-ratakan setiap 2 x injeksi.
Tekan OK.

KROMATOGRAFI GAS SPEKTROSKOPI MASSA

137

Tekan Standby.
Tekan Start.

e. Mengolah Data

f.

Klik GC MS Post Run Analysis


Tampilkan data yang ingin diolah
Bila ingin tahu waktu Retensi , klik TICS, Peak Integration
Slope , contoh = 1000, maka slope berbanding terbalik dgn sensitivitas.
Width = lebar tinggi
Width (saat tinggi peak)

Klik Qualitative, Qualitative Parameter, diatur similarity search, double klik,


posisikan kursor pada peak yang dicari, klik similarity search.
1. Split Ratio, contoh = 100, maka yang masuk ke kolom = 1/100 nya
2. Split = sample mengalami proses splitting pada injector, dengan rasio split diatur
pada Split Ratio.
3. Splitless = sample mengalami proses splitting pada injector setelah melewati waktu
yang ditentukan sampling time. Sebelumnya, seluruh sample masuk ke dalam
injector.
4. Solvent Cut Time = setelah di-inject, sample ditahan selama xx detik sebelum
masuk ke dalam kolom.
5. ACQ mode = mengubah Scan menjadi SIM dan sebaliknya.
6. SCAN = akan mendeteksi dari m/z start sampai M/Z end
7. SIM = mendeteksi hanya pada m/z tertentu saja , sehingga lebih akurat.

Analisa Kuantitatif

GC MS Post Run Analysis, panggil data Standar


Top, Create Compound Table, Peak Integration (atur parameter), OK
Qualitative, Qualitative parameter, Similarity Search, pilih Wiley7 sebagai library, OK
Qualitative Table, delete data yang ada di spectrum process, TIC, blok fase yang akan
diintegrasikan, edit, select all, register process table, edit, select, similarity search,
search column, similarity search, search table.
Klik wizard, next 6 x
Beri check list, external standar, of calib. Level ( deret standar), unit : ppm, masukkan
[ ] standar, type : target, target ion di blok , Save compound table.
Calibration curve, klik data yes, file save as, top, panggil method yang akan dijadikan
standar, ke directory data, ditarik ke level, Peak Integration for All data, file save
method file.
Top, Quantitative, panggil data sample, load method.
Qualitative parameter, panggil sample yang akan dihitung, load method, standar open
yang sudah bikin kurva kalibrasi, Quantitative, Peak Integrate for IDs, lihat Result,
Print, OK.

g. Report Data
Klik Peak yang akan di integrasikan , Peak Integration for TIC
Mematikan GCMS QP2010 :
KROMATOGRAFI GAS SPEKTROSKOPI MASSA

138

Close, TOP, Vacuum control, Pilih Auto Shutdown, Matikan PC, matikan MS, Matikan
Tombol Power pada GC.

3. Teknik Preparasi Sampel


Ada beberapa teknik sampling & memasukkan sample yang dikenal dalam analisis
dengan menggunakan instrumen GCMS.
Diantaranya adalah:
Injeksi untuk sample berupa zat cair;
Melalui alat khusus Direct Inlet Probe;
Teknik Headspace;
Pirolisis;
Purge & Trap.
Injeksi sample berupa cairan adalah teknik memasukkan sample yang paling umum.
Sample langsun dimasukkan/di-injeksi setelah mendapat preparasi.
Direct Inlet Probe, digunakan untuk sample memiliki titik uap yang lebih tinggi dari
kemampuan injector GC; atau untuk analisis sample yang tidak stabil secara termal. Sample
langsung dimasukkan ke dalam MS tanpa melalui GC.
Teknik Headspace, digunakan untuk sample hasil ekstraksi dari senyawa-senyawa
organic yang mudah menguap. Senyawa-senyawa tersebut terdapat di dalam produk berbentuk
cair atau padat. Misal, senyawa yang mudah menguap di dalam air, aroma di dalam produk
makanan, dan sebagainya.
Sample dimasukkan ke dalam wadah khusus, lalu diinkubasi. Setelah terjadi
ekuilibrium, gas yang berada diatas diambil oleh syringe. Lalu sample dimasukkan ke dalam
GC. Teknik sampling ini menggunakan alat khusus yang terpisah dari instrumen GCMS
QP2010.
Pirolisis, digunakan untuk sample yang tidak dapat diuapkan oleh injector GC,
misalnya polimer-polimer. Sample pertama kali diuraikan terlebih dahulu oleh pemanasan
dalam alat khusus. Hasil dekomposisi dapat dianalisis oleh GC.
Purge & Trap, digunakan untuk sample hasil ekstraksi dari senyawa-senyawa
organic yang mudah menguap. Zat yang mudah menguap (zat volatil) pertama kali dikeluarkan
dari sample dengan menggunakan gas inert. Kemudian zat volatile tersebut diabsorb oleh zat
khusus untuk meng-absorb, seperti Karbon aktif. Lalu absorben dipanaskan untuk melepaskan
senyawa yang diinginkan ke dalam GC untuk dianalisis.

4. Perawatan dan Pemecahan Masalah


1. Langkah-Langkah Pencegahan :

Selalu menggunakan peralatan dengan cara yang benar;


Melakukan perawatan pada seluruh bagian alat secara teratur;
Bersihkan debu yang ada, karena debu dapat menyebabkan hantaran listrik;
Jangan menggunakan peralatan yang kotor/sudah tidak layak dipakai;
Pastikan tabung gas yang dipakai disimpan di tempat yang aman (suhu jangan lebih
dari 40oC);
Menggunakan gas yang memiliki kemurnian yang tinggi ( 99,995%)
Instrumen jangan dinyalakan secara tiba-tiba, setelah sebelumnya baru dimatikan
(ditunggu 60 menit);
Menggunakan kain yang bebas dari serat untuk penggantian sumber ion (jangan
menggunakan bahan dari karet/plastik);
Penggantian komponen alat selain sumber ion dan kolom, harus dilakukan oleh teknisi
dari Shimadzu untuk mencegah kerusakan;

KROMATOGRAFI GAS SPEKTROSKOPI MASSA

139

Ketika tidak dipakai untuk waktu yang lama, maka kolom yang ada didalam GC
sebaiknya dicopot

2. Perawatan
a. Injector
Item yang diperiksa:
Septum; setiap analisis menggunakan septum yang sudah dikondisikan (direndam
didalam pelarut organik, seperti heksana)
Glass insert dan O-ring; menggunakan glass insert yang inaktif / sudah dideaktifasi. O-ring diganti bila glass insert diganti. Glass insert dapat aktif apabila
sample memiliki komponen asam/basa; dilarutkan oleh asam/basa; ataupun
tergores. Glass insert yang aktif dapat menyebabkan berkurangnya jumlah sample
dari jumlah yang sebenarnya, sehingga hasil yang diperoleh tidak akurat.
Langkah Preventif

Pembilasan setelah analisis dengan pelarut dilakukan untuk membersihkan


komponen-komponen non-volatil.
Mengurangi backflash dengan meng-inject volume sample sesedikit mungkin.
CATATAN: perawatan dilakukan bila injeksi sample < 50oC.

b. Kolom
Sample GC yang dapat dengan cepat mengurangi kepekaan / mengotori kolom:
Cairan-cairan biologis; Jaringan-jaringan biologis; Tanah; Lumpur; Air limbah.
Umumnya, bagian kolom yang paling mudah kotor adalah bagian ujungnya.
Bila kolom kotor, maka akan menimbulkan banyak masalah dalam data yang
dihasilkan (misal, noise yang lebih banyak). Untuk membersihkan bagian yang kotor
dapat dilakukan dengan memotong sedikit bagian ujung kolom, dengan menggunakan
cutter khusus untuk kolom. Setelah dipotong, dilihat hasil potongannya dengan kaca
pembesar 20 kali. Jika hasilnya bagus, maka dapat langsung dipakai. Bila tidak, kolom
dipotong lagi.

c. Sumber ion (Ion


source)

Gambar 13.5 Cara perawatan kolom, pemotongan bagian ujung


dan pengaturan panjang kolom.

Dengan mengikuti instruksi yang ada pada manual / help file dalam software
GCMS (Real Time An., Postrun An.), proses perawatan (penggantian atau
pembersihan) sumber ion dapat dilakukan. Bila melakukan analisis dengan sample
yang tidak bersih atau berkonsentrasi tinggi, proses perawatan perlu dilakukan.

KROMATOGRAFI GAS SPEKTROSKOPI MASSA

140

Gambar 13.6. Cara membuka filamen dan pengganttian ion source

Indikasi-indikasi dari kotornya sumber ion antara lain adalah sebagai berikut:
o Hasil Auto Tuning menunjukkan sensitivitas yang rendah, tingginya noise pada
spectrum massa, sinyal yang lemah dari ion-ion bermassa atom tinggi (m/z 502,
m/z 614);
o Yang terburuk adalah tidak bisa dilakukan Auto Tuning.

System vakum

Hal-hal yang harus diperhatikan adalah sebagai berikut:


o Persediaan oli dalam pompa rotari (diservis setiap 12 bulan sekali);
o Memanggil teknisi ketika waktu penggunaan turbo molecular pump ~25000 jam;
o Cek pompa ketika muncul suara-suara yang tidak biasa.
Dengan menggunakan tools berikut ini, kesalahan-kesalahan dalam analisis dapat
dideteksi sebelum analisis dimulai.
Tools: Test kebocoran (Leak test); dan Standard Tuning (men-tes kondisi vakum alat)
Bila terjadi kebocoran saat Leak Test, ada dua sebab yang dapat dicurigai, yaitu:

Gas pembawa GC mengalami kebocoran (gas pembawa keluar dari system


instrumen)
Vakum MS mengalami kebocoran (udara masuk ke dalam system instrumen)

Pada umumnya kebocoran dapat diatasi dengan memperhatikan faktor-faktor


penyebabnya, seperti mengencangkan skrup. Troubleshooting lebih mendetail dapat
dilihat di file Help yang ada pada software.

KROMATOGRAFI GAS SPEKTROSKOPI MASSA

141

Glossary of Chromatographic Terms


Liquid Chromatography
Adsorption
The process of interaction between the solute and the surface of an adsorbent. The forces involved can
be strong (for example, hydrogen bonds) or weak (van der Waals forces). For silica gel, the silanol group
is the driving force for adsorption, and any solute functional group that can interact with this group can be
retained by liquid-solid chromatography on silica.
Affinity Chromatography
A technique in which a biospecific adsorbent is prepared by coupling a specific ligand (such as an
enzyme, antigen, or hormone) for the macromolecule of interest to a solid support or carrier. This
immobilized ligand will interact only with molecules that can selectively bind to it. Molecules that will not
bind elute unretained. The retained compound can later be released in a purified state. Affinity
chromatography is not a chromatographic technique as such, but is actually selective filtration.
Anion Exchange Chromatography
The ion exchange procedure used for the separation of anions. Both resins and bonded phases are
available for this mode. The tetraalkylammonium group is a typical strong anion exchange functional
group. An amino group on a bonded or coated stationary phase would be an example of a weak anion
exchanger.
Asymmetry
Factor describing the shape of a chromatographic peak. Theory assumes a Gaussian shape and that
peaks are symmetrical. The peak asymmetry factor is the ratio (at 10% of the peak height) of the distance
between the peak apex and the back side of the chromatographic curve to the distance between the peak
apex and the front side of the chromatographic curve. A value > 1 is a tailing peak, while a value < 1 is a
fronting peak.
Backpressure
The pressure required to pump the mobile phase through the column. It is related to mobile phase
viscosity (h), flow rate (F), column length (L) and diameter (dc), and particle size (dp) by the following
equation:

Band Broadening
The dilution of the chromatographic band as it moves down the column. The measure of band broadening
is band width, tw, or more correctly, the number of theoretical plates in the column, N.
Band Width (tw)
The width of the chromatographic band during elution from the column. It is usually measured at the
baseline by drawing tangents to the sides of the Gaussian curve representing the peak. Small band
widths usually represent efficient separations. Also referred to as peak width.
Capacity Factor (k)
Expression that measures the degree of retention of an analyte relative to an unretained peak, where tR
is the retention time for the sample peak and to is the retention time for an unretained peak. A
measurement of capacity will help determine whether retention shifts are due to the column (capacity
factor is changing with retention time changes) or the system (capacity factor remains constant with
retention time changes).

Cation Exchange Chromatography


The ion exchange procedure used for the separation of cations. Both resins and bonded phases are
available for this mode. The sulfonic acid group is a typical strong cation exchange functional group. A
carboxylic acid group on a bonded or coated stationary phase would be an example of a weak cation
exchanger.
Chain Length
The length of carbon chain bonded to a reversed phase packing. It is expressed as the number of carbon
atoms (e.g., C8, C18).
Chromatogram
A plot of detector signal output versus time or elution volume during the chromatographic process.
Counterion
In an ion exchange process, the ion in solution used to displace the ion of interest from the ionic site. In
ion pairing, it is the ion of opposite charge added to the mobile phase to form a neutral ion pair in solution.
Coverage
Refers to the amount of bonded phase on a silica support. Coverage is usually described in mol/m2 or
% Carbon.
Dead Volume (Vd)
The volume outside of the column packing itself. The interstitial volume (intraparticle volume +
interparticle volume) plus extra column volume (contributed by injector, detector, connecting tubing, and
end fittings) all combine to create the dead volume. This volume can be determined by injecting an
unretained compound (i.e. a compound that does not interact with the column packing). Also abbreviated
Vo or Vm.
Degassing
The process of removing dissolved gas from the mobile phase before or during use. Dissolved gas may
come out of solution in the detector cell and cause baseline spikes and noise. Dissolved air can affect
electrochemical detectors (by reaction) or fluorescence detectors (by quenching).
Efficiency (N)
Also number of theoretical plates. A measure of peak band spreading determined by various methods,
some of which are sensitive to peak asymmetry. The most common are shown here, with the ones most
sensitive to peak shape shown first:

Eluate
Combination of mobile phase and solute exiting column; also called effluent.
Eluent
Mobile phase used to carry out a separation.

Eluotropic Series
A series of solvents with an increasing or decreasing degree of polarity, generally used to explain solvent
strength in liquid-solid or adsorption chromatography. A nonpolar solvent such as pentane would be at
one end of the scale; dichloromethane would be an intermediate solvent; a strongly polar solvent, such as
water, would be at the other end of the scale. Thus, when developing a method or running a gradient, an
eluotropic series is useful for selecting solvents.
Elution Volume (VR)
Refers to the volume of mobile phase required to elute a solute from the column at maximum
concentration (apex). VR = F o tR, where F is flow rate in volume/time and tR is the retention time for the
peak of interest.
Exclusion Limit
In SEC, the upper limit of molecular weight (or size) beyond which molecules will elute at the same
retention volume, called the exclusion volume. Many SEC packings are referred to by their exclusion limit.
Frit
The porous element at either end of a column that serves to contain the column packing. It is placed at
the very ends of the column tube or, more commonly, in the end fitting. Frits are made from stainless steel
or other inert metal or plastic, such as porous PTFE or polypropylene.
Gaussian Curve
A standard error curve, based on a mathematical function, which is a symmetrical, bell shaped band or
peak. Most chromatographic theory assumes a Gaussian peak.
Gel Filtration Chromatography (GFC)
Size exclusion chromatography carried out with aqueous mobile phases. Generally refers to separations
carried out on soft gels such as polydextrans. Most gel filtrationseparations involve biopolymers.
Gel Permeation Chromatography (GPC)
Size exclusion chromatography carried out with organic mobile phases. Used for the separation and
characterization of polymers. SEC with aqueous mobile phases is referred to as aqueous GPC, or GFC.
Gradient Elution
Technique for decreasing separation time by increasing mobile phase strength over time during the
chromatographic separation. Other gradients include temperature, pH, salt, and flow rates.
HETP
Height equivalent to a theoretical plate. A carryover from distillation theory: a measure of a column's
efficiency. For a typical well-packed HPLC column with 5 m particles, HETP (or H) values are usually
between 0.01 and 0.03 mm.

where L is column length in millimeters and N is the number of theoretical plates.


Hydrophilic
"Water loving": refers both to stationary phases that are compatible with water and to water soluble
molecules in general.

Hydrophobic
"Water hating": refers both to stationary phases that are not compatible with water and to molecules in
general that have little affinity for water. Hydrophobic molecules have few polar functional groups: most
are hydrocarbons or have high hydrocarbon content.
Ion Exchange Chromatography (IEC)
A mode of chromatography in which ionic substances are separated on cationic or anionic sites of the
packing. The sample ion (and usually a counterion) will exchange with ions already on the ionogenic
group of the packing. Retention is based on the affinity of different ions for the site and on a number of
other solution parameters (pH, ionic strength, counterion type, etc).
Ion Exchange Capacity
The number of ionic sites on the packing that can take part in the exchange process. Exchange capacity
is expressed in mEq/g.
Isocratic
Use of a constant composition mobile phase in liquid chromatography.
Linear Velocity
The flow rate normalized by the column cross section. This effects column performance and is directly
related to column pressure. Linear velocity is given by the following equation where L is column length
and to is the breakthrough time of an unretained peak:

Mass Transfer
The process of solute movement into and out of the stationary phase or mobile phase. The C-term of the
van Deemter equation is referred to as the mass transfer term. The faster the process of mass transfer,
the better the efficiency of the column. In HPLC, mass transfer is the most important factor affecting
column efficiency. It is increased by the use of small particle packings, thin layers of stationary phase, low
viscosity mobile phases, and high temperatures.
Mobile Phase
The solvent that moves the solute through the column.
Modifier
Additive that changes the character of the mobile phase. For example, in reversed phase, water is the
weak solvent; methanol, the strong solvent, is sometimes called the modifier.
N (Number of Theoretical Plates)
See Efficiency.
Octadecylsilane (ODS or C18)
The most popular reversed phase packing in HPLC. Octadecylsilane phases are bonded to silica or
polymeric supports. Both monomeric and polymeric phases are available.
Overload
The mass of sample injected onto the column at which efficiency and resolution begin to be affected if the
sample size is further increased.

Partition Coefficient (K)


The amount of solute in the stationary phase relative to the amount of solute in the mobile phase.
Peak Shape
Describes the profile of a chromatographic peak. Theory assumes a Gaussian peak shape (perfectly
symmetrical); peak asymmetry factor describes shape as a ratio. See Asymmetry.
Pore Volume
The total volume of the pores in a porous packing; usually expressed in mL/g.
Porosity
For a porous adsorbent, the ratio of the volume of the interstices to the volume of the solid particles. The
pore volume is also used as a measure of porosity.
Recovery
The amount of solute (sample) that elutes from a column relative to the amount injected. Most often used
with protein separations in which proteins irreversibly bind to active sites on the packing in certain
columns.
Residual Silanols
The silanol (-Si-OH) groups that remain on the surface of a packing after a phase is chemically bonded
onto its surface. These silanol groups may not be accessible to the reacting bulky organosilane (e.g.,
octadecyl-dimethylchlorosilane) but may be accessible to small compounds. Often they are removed by
end-capping with a small organosilane such as trimethylchlorosilane.
Resolution (Rs)
Ability of a column to separate chromatographic peaks. Resolution can be improved by increasing column
length, decreasing particle size, increasing temperature, changing the eluent or stationary phase. It can
also be expressed in terms of the separation of the apex of two peaks divided by the tangental width
average of the peaks:

Retention Time (tR)


The time between injection and the appearance of the peak maximum.
Retention Volume (VR)
The volume of mobile phase required to elute a substance from the column: VR = F o tR.
Reversed Phase Chromatography (RPC)
The most common HPLC mode. Uses hydrophobic packings such as octadecyl- or octylsilane phases
bonded to silica or neutral polymeric beads. Mobile phase is usually water and a water-miscible organic
solvent such as methanol or acetonitrile. There are many variations of RPC in which various mobile
phase additives are used to impart a different selectivity.
SAX
Strong anion exchanger.
SCX
Strong cation exchanger.

Selectivity (alpha)
A thermodynamic factor that is a measure of relative retention of two substances, fixed by a certain
stationary phase and mobile phase composition. Where k1 and k2 are the respective capacity factors.

Silanol
The Si-OH group found on the surface of silica gel. There are different strengths of silanols, depending on
their location and relationship to each other. The strongest silanols are acidic and often lead to
undesirable interactions with basic compounds during chromatography.
Siloxane
The Si-O-Si bond. A principal bond found in silica gel or for attachment of a silylated compound or
bonded phase. Stable except at high pH value.
Size Exclusion Chromatography (SEC)
A noninteractive technique which separates solutes according to their molecular size in solution.
Solid Phase Extraction (SPE)
A sample preparation technique that uses a solid phase packing contained in a small plastic cartridge.
The solid stationary phases are the same as HPLC packings; however, the principle is different from
HPLC. The process, as most often practiced, requires four steps: conditioning the sorbent, adding the
sample, washing away the impurities, and eluting the sample in as small a volume as possible with a
strong solvent.
Solute
The dissolved component of a mixture that is to be separated in the chromatographic column.
Solvent Strength
Refers to the ability of a solvent to elute a particular solute or compound from a column. See eluotropic
series.
Stationary Phase
The immobile phase involved in the chromatographic process.
Tailing
The phenomenon in which the normal Gaussian peak has an asymmetry factor > 1. Tailing is most often
caused by sites on the packing that have a stronger than normal retention for the solute.
Tailing Factor (T)
A measure of the symmetry of a peak, given by the following equation where W0.05 is the peak width at
5% height and f is the distance from peak front to apex point at 5% height. Ideally, peaks should be
Gaussian in shape or totally symmetrical.
T = W0.05/2f
Theoretical Plate
Relates chromatographic separation to the theory of distillation. Measure of column efficiency. Length of
column relating to this concept is called height equivalent to a theoretical plate (HETP). See HETP.
van Deemter Equation
An equation used to explain band broadening in chromatography. The equation represents the height

equivalent of a theoretical plate and has three terms. The A term is used to describe eddy diffusion, which
allows for the different paths a solute may follow when passing over particles of different sizes. The B
term is for the contribution caused by molecular diffusion or longitudinal diffusion of the solute while
passing through the column. The C term is the contribution of mass transfer and allows for the finite rate
of transfer of the solute between the stationary phase and mobile phase. n is the reduced velocity of the
mobile phase as it passes through the column.

Void
The formation of a space, usually at the head of the column, caused by a settling or dissolution of the
packing. A void in the
column leads to decreased efficiency and loss of resolution.
Void Time (tm or t0)
The time for elution of an unretained peak.
Void Volume (V0)
The total volume of mobile phase in the column: the remainder of the column is taken up by packing
material. Can be determined by injecting an unretained substance that measures void volume plus extra
column volume.
WAX
Weak anion exchanger.
WCX
Weak cation exchanger.s and Equations

Gas Chromatography
Adjusted Retention Time (tR')
An analyte's retention time (tR) minus the elution time of an unretained peak (tm).
tR'= tR-tm
Adjusted retention time is also equivalent to the time the analyte spends in the stationary phase.
Capacity Factor (k)
Expression that measures the degree of retention of an analyte relative to an unretained peak, where tR
is the retention time for the sample peak and tm is the retention time for an unretained peak. A
measurement of capacity will help determine whether retention shifts are due to the column (capacity
factor is changing with retention time changes) or the system (capacity factor remains constant with
retention time changes).

Thus the higher the capacity factor, the longer the retention time.
Column Efficiency (N)
See Theoretical Plate Number.
Column Evaluation
An application on Thermo GC instruments that measure a column's resistance to flow, accurately
controlling gas linear flow rates to ensure consistent retention times.
Detectors
See ECD, FID, FPD, NPD, PID and TCD.
Distribution Constant
A ratio of concentration of solute in the stationary phase versus the mobile phase. Also known as partition
co-efficient.
Effective Theoretical Plates (Neff)
A measure of a column performance that accounts for the effects of unretained elution time, where t'R is
the adjusted retention time and s is the standard deviation of the peak.

This value also remains constant as retention gaps and guards are used. Depending on the method of
peak width calculation, different efficiencies can be reported. This leads to two popular measures:

Where W is the tangential peak width (13.4% peak height).

Where W is the width measured at half height (50% peak height).


ECD
Electron Capture Detector. Uses electron emitting source to ionize the carrier gas. Any electron-deficient
analyte will reduce this level of ionization. The ECD detector is sensitive to any analyte with
electronegative functionality (e.g. Cl-).
FID
Flame Ionization Detector. A "universal" detector for all carbon-containing compounds. A high
temperature hydrogen flame ionizes the sample, causing an increase in current through an electrode,
proportional to the amount of carbon passing through the flame.

FPD
Flame Photometric Detector. Analytes are passed through a hydrogen rich flame which is monitored by
photocells. FPDs are usually used as a specific detector for sulphur- or phosphorous-containing
compounds.
Flow Rate
The volumetric flow in mL/min of the carrier gas; this is different from the linear velocity.
Fronting
Distorted peak where the asymmetry of the peak is towards the front; the peak tailing factor is < 1.
Heartcutting (2D GC)
A method of using two columns of different selectivity to gain more information on a sample. In
heartcutting, only a selected portion of eluant from the first column is passed onto the second.
HEEP (Heff)
Height Equivalent to an Effective Plate.

Where L is the column length. The smaller the Neff, the more efficient the column's performance.

HETP (H)
Height Equivalent to a Theoretical Plate is a measure of column efficiency where L is the column length
and N is the number of theoretical plates:

HETP is based on actual (tR) rather than adjusted retention times (t'R).
Hold Up Time (tm)
The time for an injected substance, which is not retained on the stationary phase, to pass through the
column and reach the detector. Hold Up Time is usually measured by injection of a compound such as
methane.
Kovat's Index
A value that expresses the retention of a sample compared to two standards eluting before and after it.
The Kovat's Index uses simple alkanes. The value is derived by allotting the alkanes a value of 100 times
their carbon number and giving the sample a value equivalent to a hypothetical alkane eluting at the
same time.
Leak Test
Process to establish the gas tight nature of all connections. This is an automated test on Thermo GC
instruments.
Linear Velocity (u)
Mobile phase flow rate expressed in cm/s and is expressed as

Where L is the column length and to is the breakthrough time of an unretained peak
Mass Distribution Ratio [k(Dm)]
Alternative to Capacity Factor. Described as the ratio between the fraction of an analyte in the stationary
phase and mobile phase.
NPD
Nitrogen Phosphorus Detector. Selective to the presence of nitrogen or phosphorus in the sample. NPD
is often used in environmental studies.
On-Column Injection
Method of injection where the syringe needle enters and delivers the sample onto the top of the column.
Partition Co-efficient
See Distribution Constant.
Peak Width (W)
There are a number of ways to measure peak width. Most common are:
1. Tangential width: measures the baseline between two tangents taken from the peak inflection points
and the baseline.
2. Width at half-height: measures width between the peak measured at 50% peak height
Peak width can be expressed in time or volume.
Phase Ratio (beta)
The ratio of a column's volume of stationary phase to mobile phase. An important value when changing
the column dimensions of a method.

PID
Photo Ionization Detector. Photons from the detector UV source ionize solutes passing through the
detector. The presence of an analyte increases the signal.
PLOT
Porous Layer Open Tubular column. Capilliary column that has a fine adsorbent bonded to it. PLOT is
most often used for very volatile liquids or permanent gases.
Purged Splitless Injection
This is the most common splitless method where the injector is set in split mode for a set time but then
the split vent is opened to flush any remaining sample.
Resolution
A measure of the separation of two peaks taking into account both the difference in elution time and the
peak widths.

Where t2 and t1 are the two retention times, and W1 and W2 are baseline peak widths.
Retention Index
A value that expresses the retention of a sample compared to two standards that elute before and after it.
See Kovat's Index.
Retention Time (tR)
Total time from injection to elution. This takes no account of dead volume or tm.
Retention Volume
Total volume from injection to elution.
SCOT
Support Coated Open Tubular column. A capilliary column where the liquid stationary phase is supported
on a solid substrate coating the capillary column walls.
Selectivity (alpha)
The relative retention of two adjacent peaks. Selectivity can be calculated using capacity factor or
retention volumes.

Separation Factor
See Selectivity.
Sensitivity
An estimation of the smallest analyte signal that can be detected by the method. Sensitivity is usually
specified as a signal-to-noise ratio of 2.
Septum
A small disc usually made of rubber or silicone material that is used to seal the injector from the
atmosphere. The syringe needle passes through the septum.
Septum Bleed
Compounds generated form the septum by the effect of temperature on the septum material. The
compounds released lead to contamination of the injector and noisy baselines.
Split Injection
Method of introducing a sample onto the column. In split injection most of the sample, once vaporized,
passes out of the injector to waste with only a small portion entering the column head.
Splitless Injection
Method of introducing a sample onto the column where the purge valve is closed for a period of time
allowing all sample to enter the column. The purge valve is then opened to flush the injector.

Theoretical Plate Number


A measure of efficiency of the whole system. There are a number of ways to calculate efficiency because
the calculation includes a term for peak width. Depending on the method of peak width calculation used,
different efficiencies can be reported. Also known as Column Efficiency.
TCD
Thermal Conductivity Detector. Heated elements form the arms of a wheatstone bridge. Analytes passing
through one chamber change the temperature and therefore the resistance which is monitored. It is a
universal, non-destructive detector.
Trennzahl Number
A value to describe a separation. The Trenzahl number is calculated from the resolution between two
consecutive homologous hydrocarbons. The Trennzahl number represents the number of peaks that can
be included between the two hydrocarbon peaks.

van Deemter Equation


This is a relationship that considers the effect of linear velocity on the HETP or h, where A accounts for
eddy currents, B describes the diffusion in the mobile phase term, C refers to the resistance to transfer
from the stationary to mobile phase and u is the velocity of the mobile phase.

WCOT
Wall Coated Open Tubular column. Column where the stationary phase is bonded to the inside wall of the
capillary column. WCOT is the most commonly used column.

Solid Phase Extraction


Analyte
Compound to be isolated and measured in a sample preparation scheme
Column Volume
The sum of the interstitial volume plus the pore volume of the sorbent within the column
Bonded Phase
An organic functionality covalently bonded to a chromatoghraphic support.
Breakthrough
Lack of analyte retention which occurs when the total mass of the solutes (analytes + interferences)
exceeds the capacity of the sorbent or the solute is weakly retained
Buffer
A solution of a weak acid and its salt or a weak base and its salt which can resist pH change upon
addition of small amounts of strong acid or base

Capacity
Total quantity of solutes (analytes & interferences) which can be retained from a specific sample matrix
solution by a given mass of sorbent
Conditioning
The preparation of the extraction column to receive the sample. For reversed phase columns, this
involves the application of a solvent such as methanol, followed by a similar volume of water. Normal
phase columns are conditioned with a solvent similar to the sample solvent. Ion exchange columns are
conditioned with a buffer of appropriate pH and ionic strength.
Counter Ion
The ionic species which pairs or associates with the ionic functional group of opposite charge on an ionexchange sorbent. To be retained, a charged analyte must displace the counter ion associated with the
ion exchanger group.
Eluent
Solvent or solvent mixture used for the removal of the solutes from the sorbent bed.
Elution Volume
The volume of solvent required to elute an analyte quantitatively.
Endcapping
A technique used to remove unwanted silanol groups on the surface of the silica which might otherwise
undergo secondary interactions with the solutes.
Extraction
Transfer of the analytes from one phase to another
Frit
The porous element which contains the media within an SPE column. The frits are typically
manufactured from porous polyethylene or polypropylene
Hydrophilic
"Water loving": Refers both to stationary phases that are compatible with water and to water soluble
molecules in general
Hydrophobic
"Water hating": Refers both to stationary phases that are not compatible with water and to molecules in
general that have little affinity for water. Hydrophobic molecules have few polar functional groups: most
are hydrocarbons or have high hydrocarbon content.
Interference
Substance in the sample or separation system which may influence retention of the analyte on the
sorbent or may co-elute with the analyte and influence analytical determination
Ion Exchange Chromatography
A chromatographic mode in which ions are retained by oppositely charged groups covalently bonded to a
solid support. The analyte ions are retained by displacing counterions associated with the bonded
functional group.
Liquid / Liquid Extraction (LLE)
A purification technique whereby the sample is first dissolved in a solvent and then agitated with a second
immiscible solvent . Solutes that partition preferentially with the second solvent are extracted and
effectively purified.
Matrix

All components of the sample including the solvent, but excluding the analytes
Mobile Phase
The solvent that moves the solute through the column
Non-Polar Molecule
Molecule with a symmetric distribution of charge
Normal Phase
A mode of chromatography whereby retention on a sorbent bed increases with the polarity of the sorbent.
Sorbents used in this mode include silica, florisil and aminopropyl.
pKa
The pH value at which fifty percent of the ionisable groups of an ionic analyte are ionized and fifty percent
are in the molecular form
Polar Molecule
Molecule with an unsymmetric distribution of charge
Pore Size
The average diameter of the porous openings on the surface of a sorbent particle
Reversed Phase
A chromatographic mode in which non-polar to moderately polar analytes are extracted from a polar
solution using a non-polar sorbent
SAX
Strong anion exchanger
SCX
Strong cation exchanger
Solid Phase Extraction
Solid Phase Extraction (SPE) is a broad term used to describe the separation technique where liquids
contact modified solid surfaces and a component of the liquid adheres to the solid. In a separate step,
the solid releases the component. The solid usually consists of an inert core covered with unique "hooks"
that remove the targeted material from the starting liquid.These active solids are packed into containment
devices such as plastic columns through which the matrix and subsequent wash & elution solvents
are passed to produce a purified material.
Sorbent
Bonded phase silica or adsorbent used as the stationary phase in SPE
Surface Area
The surface area on the surface and wthin the pores of a chromatographic sorbent. This is normally
2
expressed as m /g

Anda mungkin juga menyukai