Sebuah duplex prosedur PCR dievaluasi untuk mendeteksi Clostridium

perfringens dalam makanan dan biologi sampel dan untuk identifikasi

strain enterotoksigenik. Metode ini menggunakan dua set primer yang
memperkuat dalam reaksi yang sama dua fragmen DNA yang berbeda
secara bersamaan: 283-bp C. perfringens fosfolipase C fragmen gen
dan 426-bp fragmen gen enterotoksin. primer internal dalam dua set
primer menegaskan kekhususan metode dengan hibridisasi DNA-DNA
dengan produk PCR. Tidak ada reaksi silang diamati dengan spesies
lain Clostridium atau dengan bakteri lainnya secara rutin ditemukan
dalam makanan. Tingkat deteksi adalah sekitar 105 C. perfringens sel
per gram tinja atau sampel makanan. Ketika budaya pengayaan
semalam itu digunakan, 10 C. perfringens sel per g terdeteksi pada 57
sampel makanan artifisial terkontaminasi. Dupleks PCR adalah metode
cepat, sensitif, dan dapat diandalkan untuk mendeteksi dan identifikasi
enterotoksigenik C. perfringens strain dalam sampel makanan. Sebuah
tes aglutinasi geser lateks juga dievaluasi sebagai, teknik sederhana
yang cepat untuk deteksi C. perfringens enterotoksin dalam sampel
tinja.

Clostridium perfringens tipe A tersebar luas di tanah, limbah, dan

saluran usus manusia dan hewan. enterotoksigenik yang strain adalah
penyebab umum dari keracunan makanan wabah di seluruh dunia (10,
14). Gejala, terutama diare dan sakit perut, muncul 6 sampai 24 jam
setelah konsumsi dari makanan yang terkontaminasi. Muntah dan
demam yang tidak biasa. Kematian terjadi sesekali di antara pasien
lemah, terutama lansia (13). Enterotoksigenik C. perfringens juga telah
dikaitkan dengan kasus sporadis diare dan dengan beberapa kasus
sindrom kematian bayi mendadak (3, 15, 19, 20). C. perfringens
enterotoksin (CPE), yang dihasilkan selama fase sporulasi,
menyebabkan gejala C. perfringens keracunan makanan (13, 17).
Penyakit ini disebabkan oleh konsumsi makanan yang mengandung
sejumlah besar (0,105 bakteri per g) dari vegetative enterotoksigenik
C. perfringens sel (24). The tertelan bakteri berkembang biak dan
bersporulasi, melepaskan CPE ke dalam usus. Sebuah C. perfringens
hitungan 0,106 sel / g dalam sampel tinja dari pasien merupakan
indikasi C. keracunan perfringens makanan (24). deteksi langsung dari
CPE dalam sampel tinja juga berharga teknik diagnostik (1, 2, 9).
Penyelidikan epidemiologi melibatkan pencacahan C. perfringens di
diduga makanan. Karakterisasi enterotoksigenik C. perfringens strain
tidak dilakukan secara rutin, karena C. perfringens sporulasi, yang
merupakan prasyarat untuk produksi CPE, terbatas dalam media kultur
biasa (17). CPE dan gen fosfolipase C urutan telah ditentukan (26, 28,
29). Fosfolipase C gen terletak pada DNA kromosom dalam semua jenis
C. perfringens toksin (4), sedangkan distribusi gen CPE dibatasi.
hibridisasi DNA-DNA percobaan menunjukkan bahwa hanya 6% dari C.

perfringens isolat dari berbagai asal-usul membawa gen CPE (28). Ini
persentase lebih tinggi (59%) di antara C. perfringens strain terisolasi
dari wabah dikonfirmasi keracunan makanan (30). Kami jelaskan di sini
PCR dupleks untuk deteksi cepat dan identifikasi enterotoksigenik C.
perfringens strain dalam makanan dan sampel tinja. Sebuah tes geser
aglutinasi untuk deteksi CPE dalam sampel tinja juga dievaluasi.

BAHAN DAN METODE

strain bakteri. Semua strain bakteri yang digunakan dalam penelitian
ini tercantum dalam Tabel 1. strain Clostridium ditumbuhkan dalam
medium TYG bawah anaerobic kondisi dengan menggunakan botol
anaerobik yang mengandung 95% H2 dan 5% CO2; media ini
terkandung Trypticase (30 g / liter), ekstrak ragi (20 g / liter), glukosa
(5 g / liter), dan sistein HCl (0,5 g / liter), dan pH-nya adalah 7,2.
metode bakteriologi standar. Untuk analisis bakteriologis makanan dan
tinja sampel, 10-g sampel ditimbang secara aseptik, ditempatkan ke
stomacher steril tas, dan dihomogenisasi selama 2 menit di 90 ml air
pepton. Satu-mililiter aliquot 1:10 pengenceran suspensi dicampur
dengan 9 ml SPS agar, yang berisi tryptone (15 g / liter), ekstrak ragi
(10 g / liter), sitrat besi (0,5 g / liter), natrium sulfit (0,5 g / liter),
natrium thioglycolate (0,1 g / liter), Tween 80 (0,005 g / liter),
polimiksin B sulfat (0,001 g / liter), disodium sulfadiazine (0.12 g /
liter), dan agar (14 g / liter) dan memiliki pH 7. Setelah 18 jam
anaerobic inkubasi pada 46 C, sel Clostridium sulfit-mengurangi
dihitung. Koloni dikelilingi oleh endapan hitam karakteristik
diidentifikasi secara biokimia (Dengan menggunakan fermentasi
laktosa, reduksi nitrat, produksi gelatinase, dan tes motilitas).
imunoglobulin anti-CPE. CPE dimurnikan dari C. perfringens 8-6, dan
kelinci antibodi anti-CPE dibuat seperti yang dijelaskan sebelumnya
(21). Anti- imunoglobulin CPE dimurnikan oleh prosedur immunoaffinity.
CPE (3 sampai5 mg) ditambah dengan 1 g sianogen bromida-diaktifkan
Sepharose 4B (Pharmacia, Paris, Prancis) sesuai dengan instruksi dari
produsen. Kelinci anti-CPE serum (5 ml) melewati kolom
immunoaffinity. kolomdicuci dengan phosphate-buffered saline (PBS)
sampai tidak ada protein lebih lanjut adalah terdeteksi di eluat
tersebut. Antibodi anti-CPE kemudian dielusi dengan 1 M asetat AC id.
Fraksi-fraksi (200 ml) dikumpulkan dalam tabung yang berisi 100 ml 3
M Tris-HCl (pH 8). Fraksi mengandung dimurnikan imunoglobulin antiCPE yang didialisis PBS. Persiapan manik-manik lateks. Coating manikmanik lateks (Bacto Latex 0,81; Difco, Detroit, Mich.) Dilakukan seperti
yang dijelaskan sebelumnya (24). Lateks suspensi (2 sampai 5 ml)
diencerkan dalam 15 ml glisin penyangga (0,1 M glisin, 0,15 M NaCl;
pH 8.2) yang mengandung 200 mg dimurnikan imunoglobulin anti-CPE

dan homogeny selama 1 menit pada suhu kamar. Volume yang sama
dari PBS-0,1% bovine serum albumin (BSA) kemudian ditambahkan,
dan campuran vortexed dan disimpan pada 4 C. Sebuah kontrol
lateks negatif disiapkan dengan cara yang sama dengan menggunakan
nonimmune imunoglobulin G (Sigma, Paris, Prancis).

TABLE 2. Sequences of the primers and probes used in the PCR

Oligonucleotide
Sequence (59-39) Position
PL3 AAG TTA CCT TTG CTG CAT AAT CCCa 16761699b
PL7 ATA GAT ACT CCA TAT CAT CCT GCT 14181440b
PLC TCA AAA GAA TAT GCA AGA GGT 15911611b
P145 GAA AGA TCT GTA TCT ACA ACT GCT GGT CC 472500c
P146 GCT GGC TAA GAT TCT ATA TTT TTG TCC AGTa 868897c
EntA GAA CGC CAA TCA TAT AAA TTT CCA GCT GGGa 783812c

SLAT untuk deteksi CPE. Sebuah tes geser lateks aglutinasi

(SLAT) adalah dilakukan pada slide kaca dengan menggunakan
25 ml lateks dilapisi dan 25-ml porsi 10-kali lipat pengenceran
serial sampel di PBS-0,5% BSA. Setiap campuran itu lembut
diputar, dan aglutinasi yang tercatat setelah 3 menit. Kehadiran
CPE di C. perfringens strain dipantau oleh SLAT dengan
menggunakan cairan supernatant budaya tumbuh di sporulasi
menengah Duncan-Kuat (30). spesimen tinja diencerkan 1:10
dalam PBS-0,5% BSA, dihomogenisasi dengan vortexing, dan
disentrifugasi pada 15.000 3 g selama 3 menit. Cairan
supernatan diklarifikasi dianalisis dengan SLAT tersebut. Primer
yang digunakan dalam duplex PCR. enam oligonukleotida yang
digunakan untuk PCR amplifikasi dan hibridisasi dalam penelitian
ini tercantum dalam Tabel 2. PL3 dan PL7 telah dijelaskan
sebelumnya (26), PLC berasal dari C. perfringens gen alphatoksin (26), dan P145, P146, dan probe Enta berasal dari gen
enterotoksin (29). Primer yang dipilih dengan menggunakan
Gene PC (IntelliGenetics, Geel, Belgia) menurut kriteria berikut:
tidak ada cross-hibridisasi dengan lainnya diketahui enterotoksin
atau fosfolipase C gen, konten G1C tinggi pada 39 akhir, dan
pembentukan dimer terbatas dan diri saling melengkapi. Semua
oligonukleotida yang disintesis secara kimia dengan synthesizer
asam nukleat (model 380B; Terapan Biosystems, Inc., Foster City,
California.). Duplex PCR dengan budaya kaldu. Salah satu mililiter
budaya pengayaan adalah disentrifugasi pada 12.000 3 g selama
3 menit, dan pelet dicuci dalam 2 ml suling air, disentrifugasi,
dan diinkubasi pada 56 C selama 30 menit dengan 200 ml

Instagene matrix (Bio-Rad, Paris, Prancis). Campuran itu

kemudian vortex selama 10 detik, diinkubasi pada 100 C
selama 8 menit, penuh semangat vortexed, dan disentrifugasi
pada 12.000 3 g untuk 2 menit. PCR dilakukan dengan model
PTC-100 programmable termal controller (MJ Research, Inc.,
Watertown, Mass.) dengan menggunakan 5 ml supernatant
cairan. Masing-masing tabung reaksi berisi 50 ml 10 mM Tris-HCl
(pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1 mg gelatin per ml,
masing-masing
deoksinukleotida
(Boehringer,
Mannheim,
Jerman) pada konsentrasi 200 mM, masing-masing primer di
konsentrasi 0,5 mM, dan sampel DNA. Penguapan dalam tabung
dicegah dengan penambahan 100 ml minyak mineral (Sigma, St
Louis, Mo). Itu Campuran reaksi diinkubasi pada 94 C selama 5
menit untuk denaturasi DNA, dan 2,5 U Taq polymerase
(Boehringer) kemudian ditambahkan ke masing-masing tabung.
PCR melibatkan 30 siklus yang terdiri dari profil termal berikut
dioptimalkan: 30 s dari denaturasi pada 94 C, 30 s primer
annealing pada 55 C, dan 30 s primer ekstensi pada 72 C.
Setelah siklus 30, ekstensi primer dilanjutkan untuk tambahan 10
menit pada 72 C untuk memastikan bahwa akhir langkah
ekstensi selesai. percobaan kontrol negatif dilakukan dengan
semua reagen kecuali DNA Template. persiapan sampel, PCR
amplifikasi, dan elektroforesis dilakukan di tiga kamar yang
berbeda untuk menghindari kontaminasi.
Duplex PCR dengan sampel tinja. sampel tinja (0,1 g) ditimbang
secara aseptik, ditempatkan ke dalam tabung steril, dan
dihomogenisasi dengan 0,9 ml air dan kemudian diobati dengan
Instagene (Bio-Rad) dan PCR diamplifikasi seperti dijelaskan di
atas. Duplex PCR dengan sampel makanan. sampel makanan (10
g) dihentikan pada 90 ml air pepton dan homogen dalam tas
stomacher selama 2 menit. Dalam makanan buatan percobaan
kontaminasi, 1 ml mengandung 102 C. perfringens 8-6 sel adalah
ditambahkan ke 100 ml dari suspensi makanan; ini diwakili
tingkat kontaminasi 10 C. perfringens sel per gram makanan.
Suspensi makanan diinkubasi di bawah kondisi anaerob pada
suhu 37 C selama 18 jam. Salah satu mililiter budaya
pengayaan kemudian diobati dengan Instagene (Bio-Rad), dan
urutan DNA yang diperkuat oleh PCR seperti dijelaskan di atas.
Analisis produk PCR. Agarosa gel elektroforesis, transfer ke nilon
membran, dan hibridisasi dengan probe digoksigenin-label
semua dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (8).

HASIL
C. perfringens duplex PCR kekhususan dan karakterisasi strain
enterotoksigenik. Spesifisitas PCR dupleks dengan dua set primer
berasal dari fosfolipase C dan gen CPE dinilai dengan spesies
Clostridium yang berbeda dan strain bakteri lain yang sering
dikaitkan dengan makanan (Tabel
1).283-bp diperkuat fragmen dari 24 C. perfringens strain diuji
diamati dengan elektroforesis gel agarosa (Tabel
1). Produk PCR ini memiliki ukuran yang diharapkan dari
fosfolipase yang gen C fragmen DNA diperkuat dengan PL3 dan
PL7, dan hibridisasi dengan primer internal yang Plc. Bakteri
lainnya strain diuji, termasuk Clostridium bifermentans
ketegangan, yang menghasilkan fosfolipase terkait dengan C.
perfringens (27) (Tabel 1), tidak menghasilkan diperkuat fragmen
dengan PL3 dan PL7 atau dengan P145 dan P146. Tujuh dari 24
C. perfringens strain diuji menghasilkan tambahan produk PCR
426-bp, produk memiliki diprediksi ukuran untuk fragmen DNA
gen CPE diperkuat dengan P145 dan P146. produk PCR 426-bp ini
hibridisasi dengan Enta primer terletak pada urutan DNA CPE
antara P145 dan P146 (29), tapi tidak dengan Plc. Dupleks PCR
Data prosedur menunjukkan bahwa C. perfringens 8-6 adalah
enterotoksigenik (Tabel 1). Data-data ini konsisten dengan fakta
bahwa strain ini diproduksi CPE, sebagaimana ditentukan oleh
cytoxicity Vero sel, mematikan mouse, dan immunoprecipitation
(22). The perfringens strain lainnya C. tidak diuji untuk produksi
CPE, karena mereka tidak bersporulasi di bawah eksperimental
kondisi digunakan. Sensitivitas duplex PCR dengan budaya kaldu.
Itu duplex PCR dilakukan langsung dengan enterotoksigenik

C. perfringens 8-6 budaya kaldu untuk menentukan sensitivitas

teknik. Bakteri dalam sampel kultur dihitung mikroskopis dalam
ruang Petrov. Sesedikit 50 bakteri di campuran reaksi
menghasilkan hasil positif yang ditentukan oleh elektroforesis gel
agarosa. sensitivitas ini meningkat 10- lipat oleh Southern
blotting digoksigenin-label internal yang probe Enta dan Plc.
Penerapan PCR duplex untuk sampel tinja. Dua puluh tiga sampel
tinja dikumpulkan setelah diduga C. perfringens makanan wabah
keracunan di restoran sekolah dan dianalisis dengan baik duplex
metode PCR dan standar metode. Delapan belas dari sampel ini
terkandung enterotoksigenik C. perfringens yang ditentukan oleh

teknik duplex PCR (Tabel 3) dan menghasilkan dua fragmen

diperkuat dari ukuran diprediksi untuk fosfolipase C dan gen CPE
fragmen DNA diperkuat dengan PL3-PL7 dan P145-P146 dan
hibridisasi dengan primer internal Plc dan Enta, masing-masing.
Jumlah sulfit-mengurangi bakteri yang ditentukan oleh standar
Metode berkisar dari, 104-107 bakteri per g. lima kotoran sampel
tidak mengandung enterotoksigenik C. perfringens yang
ditentukan oleh duplex teknik PCR dan Southern blotting. The
jumlah bakteri yang sesuai sulfit-mengurangi kurang dari 104
bakteri per g selama tiga sampel dan antara 105 dan 2 3 105
bakteri per g untuk dua sampel lainnya (Tabel 3). CPE SLAT
dengan sampel tinja. CPE terdeteksi pada 18 dari 23 sampel tinja
dengan SLAT (Tabel 3). Enterotoksigenik C. perfringens
diidentifikasi di 17 ini tinja 18 SLAT-positif sampel oleh duplex
PCR. Satu bangku sampel (Tabel 3, sampel 4) yang terkandung
enterotoksigenik C. perfringens yang ditentukan oleh dupleks
PCR tetapi tidak oleh SLAT tersebut. Rendahnya jumlah sulfitmengurangi bakteri dalam sampel ini (, 104 bakteri per g)
menyarankan bahwa CPE tidak hadir. Sampel SLAT-positif lainnya
terkandung setidaknya 104 sulfit-mengurangi bakteri per g (Tabel
3). CPE terdeteksi pada satu sampel tinja oleh SLAT (Tabel 3,
sampel 11), tapi sampel ini adalah negatif sebagaimana
ditentukan oleh dupleks PCR. Ada 105 sulfit-mengurangi bakteri
per g dalam sampel ini. Analisis lebih lanjut dari 20 C.
perfringens klon dari sampel ini tumbuh di domba agar darah
mengidentifikasi mereka

sebagai enterotoksigenik C. perfringens klon yang ditentukan

oleh PCR (data tidak ditampilkan). Penerapan PCR dupleks secara
alami dan buatan terkontaminasi sampel makanan. Makanan di
restoran sekolah bertanggung jawab atas wabah keracunan
makanan yang terkandung enterotoksigenik C. perfringens
sebagaimana ditentukan oleh duplex PCR dilakukan tanpa
pengayaan budaya. Yang sesuai sulfite- mengurangi jumlah
bakteri adalah 105 bakteri per g, dan CPE tidak terdeteksi oleh
SLAT tersebut. Sensitivitas dari metode duplex PCR diselidiki
dengan menggunakan sampel makanan alami dan buatan
terkontaminasi. Batas deteksi adalah 105 C. perfringens sel per g
(data tidak ditampilkan). Sensitivitas teknik ini ditingkatkan
dengan
pengayaan budaya semalam. Dari 59 alami
terkontaminasi sampel makanan, 2 terdapat 5 3 105 dan 103 C.
perfringens sel per g seperti yang ditentukan dengan metode
standar dan memberi positif hasil sebagaimana ditentukan oleh
PCR duplex (Tabel 4). 57 makanan sampel yang tidak
mengandung sulfit-mengurangi bakteri artifisial terkontaminasi

(10 C. perfringens sel per g). Semua memberi hasil positif yang
ditentukan oleh dupleks PCR setelah pengayaan budaya (Tabel
4).

DISKUSI
Kami mengembangkan PCR duplex untuk mendeteksi C.
perfringens dan mengidentifikasi yang strain enterotoksigenik.
Sepasang primer (PL3 dan PL7) berasal dari C gen fosfolipase
hadir di semua strain C. perfringens (7). Pasangan lain (P145 dan
P146) berasal dari gen enterotoksin terutama ditemukan di C.
perfringens strain terkait dengan wabah keracunan makanan (29,
30). Produk PCR dianalisis dengan hibridisasi DNA-DNA dengan
menggunakan probe khusus untuk gen fosfolipase C (PLC) dan
CPE (Enta). Spesifisitas duplex PCR dikonfirmasi dengan
mempelajari

24 C. perfringens strain, 27 spesies Clostridium yang berbeda,

dan 20 strain bakteri yang biasa ditemukan pada sampel
makanan. Identifikasi enterotoksigenik C. perfringens isolat
dengan metode imunologi membutuhkan di sporulasi vitro untuk
memperoleh tingkat terdeteksi CPE, dan karena C. perfringens
sporulasi buruk di media kultur, teknik ini tidak memuaskan (6,
21). Duplex PCR dan DNA-DNA metode hibridisasi adalah yang
cepat, teknik sederhana untuk identifikasi enterotoksigenik C.
perfringens isolat (12, 23, 27, 30). PCR dan analisis hibridisasi
juga telah dilaporkan berguna metode untuk C. perfringens

mengetik (5, 18). Hasil kami menunjukkan bahwa PCR

merupakan teknik yang berguna untuk analisis sampel biologis
dan makanan. Enterotoksigenik C. Perfringens terdeteksi secara
langsung di 18 dari 23 sampel tinja dari pasien yang menderita
keracunan makanan. Hasil ini konsisten dengan hasil yang
diperoleh dengan menggunakan metode standar menghitung
bakteri sulfit-mengurangi dengan deteksi CPE oleh SLAT, kecuali
dalam dua kasus. Satu sampel tinja yang mengandung 105 sulfitmengurangi bakteri per g dan CPE positif ditentukan oleh SLAT
memberi hasil negatif dengan dupleks PCR. Namun, C.
perfringens klon yang diisolasi dari kotoran ini sampel yang
kemudian diidentifikasi sebagai enterotoksigenik C. Perfringens
dengan menggunakan duplex PCR. Hasil negatif mungkin
memiliki sedianya akan inhibitor PCR dalam sampel, dan lebih
tepat metode ekstraksi DNA bisa digunakan. Itu sampel tinja lain
yang terkandung 104 bakteri sulfit-mengurangi per g dan tidak
ada CPE terdeteksi sebagaimana ditentukan oleh SLAT tapi itu
positif sebagaimana ditentukan oleh teknik duplex PCR. Dupleks
PCR adalah teknik diagnostik yang sensitif; enterotoksigenik C.
perfringens terdeteksi dalam sampel tinja pada konsentrasi 104105 bakteri per g. Sejak kotoran pasien yang menderita C.
perfringens keracunan makanan pelabuhan 106 atau lebih
bakteri per gram (2, 24), duplex PCR adalah alat diagnostik yang
tepat. SLAT ini juga sensitif, dapat diandalkan, dan teknik
diagnostik cepat untuk deteksi CPE (deteksi batas, 0,1 ng dari
CPE per ml [data tidak ditampilkan]). Menggunakan dari SLAT
dan lateks aglutinasi pada microplates untuk spesifik deteksi CPE
telah dijelaskan sebelumnya (1, 16). tingkat pemantauan C.
kontaminasi perfringens makanan penting dalam industri
makanan untuk mencegah keracunan makanan. Metode standar
yang digunakan secara rutin mendeteksi sulfit-mengurangi
bakteri, termasuk C. perfringens strain dan Clostridium lainnya
strain. duplex metode PCR dilaporkan di sini adalah khusus untuk
C. perfringens dan mendiskriminasikan alunan enterotoksigenik
dari spesies ini. Sensitivitas metode ini (10 C. Perfringens sel per
g) dengan pengayaan budaya sampel makanan kompatibel
dengan tingkat deteksi yang diperlukan untuk pengujian
makanan. Tanpa pengayaan budaya, 105 C. perfringens sel per g
adalah terdeteksi oleh duplex PCR. Sejak sampel makanan
bertanggung jawab untuk C. perfringens keracunan biasanya
mengandung lebih dari 105 bakteri per g (24), PCR dupleks
dapat digunakan secara langsung dalam contoh pertama ketika

C. keracunan perfringens makanan diduga. Metode PCR seperti

dijelaskan di sini dapat digunakan untuk cepat skrining untuk C.
perfringens dalam pengujian rutin makanan tapi tidak tidak
memberikan hasil kuantitatif. Sebuah teknik deteksi kuantitatif
berdasarkan metode yang paling-mungkin-nomor, yang terdiri
dari inokulasi pengenceran serial sampel makanan ke pengayaan
menengah dan melakukan PCR dengan budaya masing-masing
pengenceran, memiliki telah diusulkan untuk penghitungan
Clostridium botulinum (11) dan dapat digunakan untuk C.
perfringens pencacahan. Kesimpulannya, metode duplex PCR
adalah cepat, sensitif Metode deteksi untuk enterotoksigenik C.
perfringens hadir di sampel tinja dan dalam makanan yang
terkontaminasi. Untuk makanan rutin tes, pengayaan budaya
diperlukan untuk memperoleh deteksi yang tingkat 10 C.
perfringens sel per g. Deteksi CPE di bangku oleh SLAT
memungkinkan diagnosis dini C. perfringens keracunan dan
menegaskan produksi toksin oleh enterotoksigenik C. perfringens
yang dideteksi oleh duplex PCR.