Tugas Teknologi Reproduksi

PEMBEKUAN EMBRIO VITRIFIKASI BLASTOCYST

Mayanda Khoirini
1302101010075

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS SYIAH KUALA
BANDA ACEH
2015
Pembekuan Embrio dan Vitrifikasi Blastocyst

Secara teoritis, kriopreservasi berasal dari kata krio yang berarti beku, dan
preservasi yang berarti penyimpanan pada temperatur rendah. Jadi kriopreservasi
adalah teknik penyimpanan materi genetik dalam keadaan beku pada temperatur
rendah atau suatu teknik penyimpanan sel hewan, tumbuhan dan materi genetika
lainnya (termasuk semen dan oosit) dalam keadaan beku melalui reduksi aktivitas
metabolisme tanpa mempengaruhi organel-organel di dalam sel, fungsi fisiologi,
biologi, dan morfologi.
Kriopreservasi adalah suatu proses penghentian untuk sementara kegiatan
hidup dari sel tanpa mematikan fungsi sel, dimana proses hidup dapat berlanjut
setelah pembekuan dihentikan.Teknik kriopreservasi pada berbagai sel, jaringan, dan
organ telah banyak dilakukan, demikian juga dengan kriopreservasi embrio. Salah
satu cara penyediaan embrio yang telah banyak dilakukan adalah pengawetan dengan
metode freezing atau pembekuan dengan cara slow freezing, rapid freezing, dan ultra
rapid freezing. Namun, saat ini telah dikembangkan pembekuan embrio dengan
metode vitrifikasi yang lebih mudah dilakukan dan jauh lebih sederhana.
Secara umum, mekanisme kriopreservasi merupakan perubahan bentuk fisik
timbal balik dari fase cair ke padat dan kembali lagi ke fase cair. Mekanisme fisika
kriopreservasi meliputi penurunan temperatur pada tekanan normal disertai dengan
dehidrasi sampai tingkat tertentu dan mencapai temperatur jauh di bawah 0 oC (-196
o

C). Proses ini harus reversibel ke kondisi fisiologis awal. Tujuan kriopreservasi

adalah mempertahankan sesempurna mungkin sifat-sifat material biologis terutama

viabilitasnya.

Prinsip Pembekuan

Pengeluaran sebagian besar air dari sel-sel sebelum terjadinya pembekuan,

sehingga terjadi penurunan volume air dalam sel, perubahan air menjadi es, dan
peningkatan konsentrasi larutan di dalam dan di luar sel .

Metode Pembekuan
Secara umum terdapat dua metode pembekuan yang telah dikembangkan,

yaitu metode kriopreservasi konvensional dan metode vitrifikasi.

1. Metode konvensional
Metode konvensional sangat menekankan pada pembekuan lambat,
sehingga berpeluang besar terbentuk kristal es. Metode ini memerlukan alat
pembekuan terprogram untuk mengatur proses dehidrasi sel dan kecepatan
pembekuan.
- Step by step freezing method (SLOW FREEZING)
Tahap pemaparan krioprotektan, baik pada waktu penambahan
krioprotektan pra pembekuan maupun pada saat pembekuan dan
-

pembilasan dilakukan secara bertahap .

Two step freezing method
Tahap pemaparan dilakukan bertahap sama seperti step by step
method, tetapi penurunan suhu langsung dari suhu kamar ke suhu
pluging ( - 35 oC) selama 10 menit selanjutnya benamkan dalam suhu

196 oC
Rapid freezing method
Tahap pemaparan sama dengan metode step by step, tetapi
suhu dari suhu kamar di turunkan ke 4 oC, kemudian dinginkan pada
kabut nitrogen selama 10 menit, selanjutnya celupkan dalam lart.
nitrogen cair ( -196 oC)

Ultrapid freezing method

Tahap pemaparan sama dengan metode step by step, tetapi
suhu dari suhu kamar di turunkan ke 4 oC selama 10 20 menit ,
kemudian langsung dicelupkan dalam lart. nitrogen cair ( -196 oC)

2. Metode vitrifikasi
Metode vitrifikasi, pembekuan embrio dilakukan secara cepat pada
temperatur -196 oC dengan menggunakan krioprotektan konsentrasi tinggi
sehingga dapat menghindari terbentuknya kristal es yang dapat merusak
membran sel saat pembekuan. Pembekuan embrio dengan metode ini dapat
dilakukan dengan lebih murah (tidak diperlukan peralatan yang mahal),
prosedur yang mudah, dan cepat
Prosedur Vitrifikasi
Equilibrasi dan pemaparan embrio dengan medium krioprotektan intraselluler
- Medium krioprotektan intraselluler mengandung 10% gliserol 20%
1.2. propanodiol dalam PBS. Embrio dipapar dalam medium tersebut
pada temperatur kamar selama 10 menit equilibrasi
Pembekuan;
-

Setelah pemaparan dengan medium krioprotektan intraselluler, embrio

dipindahkan ke medium vitrifikasi ekstraselluler yang terdiri dari atas
25 % gliserol dan 25 % 1.2 propanediol dalam PBS dan siap dikemas

dalam straw
Segera setelah pengemasan ministraw langsung dicelupkan dalam
nitrogen cair secara progresif untuk menghindari letupan kristal es

sukrosa yang dapat memecahkan straw

Pencairan dan Pembilasan krioprotektan
- Pencairan dilakukan dengan cara memasukan ministraw ke dalam
waterbath 30 oC sampai kristal es dalam diluen hilang. Segera setelah
hangat seluruh isi straw dikeluarkan ke dalam petridish, biarkan 10
menit equilibrasi pada suhu 37 oC, kemudian embrio dipipet untuk
pencucian tiga kali dalam PBS 20 % h.i FCS

Teknik Kriopreservasi

Teknik kriopreservasi dapat dibedakan atas teknik lama (klasik) dan teknik baru :

A. Teknik lama (klasik)

Teknik ini didasarkan pada freeze-induced dehydration, yaitu dehidrasi yang
diinduksi dengan pembekuan pada suhu di bawah titik beku air hingga -40C.
Teknik lama juga disebut teknik pembekuan lambat atau teknik pembekuan dua
tahap. Teknik pembekuan dua tahap meliputi inkubasi sel pada krioprotektan
dengan total konsentrasi 1-2 M yang menyebabkan dehidrasi moderat dan diikuti
oleh pembekuan lambat, misalnya dengan kecepatan 1C per menit hingga suhu
-35C, lalu pembekuan dalam nitrogen cair dan selanjutnya thawing (pelelehan).
B. Teknik baru
Teknik ini didasarkan pada vitrification, yaitu dehidrasi yang diinduksi pada
suhu di atas titik beku air.Vitrification (vitrifikasi) adalah fase transisi air dari bentuk
cair menjadi bentuk nonkristalin atau amorf, tembus pandang (glassy) karena elevasi
ekstrim dari larutan yang viskos selama pendinginan. Teknik vitrifikasi didasarkan
pada dehidrasi sel pada suhu non-freezing (tidak beku), yaitu dengan merendam
bahan dalam larutan krioprotektan dengan total konsentrasi 5-8 M pada suhu 0-25C
dan diikuti oleh pembekuan dan selanjutnya pelelehan. Macam-macam teknik baru
antara lain:
-

Vitrifikasi
Enkapsulasidehidrasi
enkapsulasi-vitrifikasi
desikasi
pratumbuh
pratumbuh-desikasi, dan
dropplet-freezing

Adapun penjelasannya sebagai berikut:

a) Pada teknik vitrifikasi, bahan diperlakukan dengan senyawa krioprotektif dan
dehidrasi dengan larutan vitrifikasi, lalu diikuti dengan pembekuan cepat,
pelelehan, dan pembuangan krioprotektan serta pemulihan kultur.
b) Teknik enkapsulasidehidrasi didasarkan pada teknologi yang telah dikembangkan
pada produksi benih sintetik. Pada teknik tersebut, bahan dienkapsulasi pada
kapsul alginat, lalu ditumbuhkan pada medium yang diperkaya dengan sukrosa

dan dikeringkan secara parsial dalam laminar air flow cabinet atau gel silika
hingga kandungan air sekitar 20% dan diikuti oleh pembekuan cepat .
c) Teknik enkapsulasi-vitrifikasi merupakan kombinasi antara teknik vitrifikasi dan
enkapsulasidehidrasi, yaitu bahan dienkapsulasi dengan kapsul alginat, lalu
dibekukan dengan teknik vitrifikasi.
d) Teknik desikasi merupakan teknik yang paling sederhana, yaitu mengeringkan
bahan dalam laminar air flow cabinet, gel silika atau flash drying hingga
kandungan air 10-20%, kemudian diikuti oleh pembekuan cepat .
e) Teknik pratumbuh meliputi penanaman bahan ke dalam media yang mengandung
krioprotektan, lalu diikuti oleh pembekuan cepat.
f) Teknik pratumbuh-desikasi dilakukan dengan menanam bahan ke dalam media
yang mengandung krioprotektan, lalu mengeringkannya dalam laminar air flow
cabinet atau gel silika dan diikuti oleh pembekuan cepat.
g) Droplet-freezing diawali dengan pra-perlakuan bahan ke dalam media cair yang
mengandung krioprotektan, lalu meletakkan pada Al-foil yang disertai dengan
droplet krioprotektan dan diikuti oleh pembekuan cepat .
Teknik lama memerlukan peralatan terprogram yang cukup mahal harganya,
sedangkan teknik baru tidak memerlukan peralatan canggih dan prosedurnya relatif
lebih mudah. Teknik lama memerlukan peralatan pembekuan, digunakan pada kultur
sel, dan lebih sulit diaplikasikan pada unit sel yang lebih besar seperti tunas apikal
atau embrio. Teknik lama berhasil diterapkan pada sistem kultur yang tidak
terdiferensiasi (suspensi sel dan kalus) dan spesies yang toleran terhadap suhu dingin,
namun tidak berhasil diterapkan pada spesies tropis. Teknik vitrifikasi telah berhasil
diterapkan pada spesies dengan skala yang lebih luas (tropis dan subtropis) dan
sistem kultur yang lebih kompleks (embriosomatik, suspensi sel, dan meristem
apikal)

Mekanisme Pembekuan

Merupakan perubahan bentuk fisik timbal balik dari fase cair ke fase padat
(fase beku) dan kembali ke fase cair
Mekanisme Fisik Kriopreservasi ini meliputi;
-

Penurunan temperatur dalam keadaan tekanan normal disertai dengan

dehidrasi

sampai

tingkat

tertentu

dan

mencapai

temperatur

deepfreezing
Proses ini harus revelsibel ke keadaan fisiologis
Tujuannya mempertahankan sesempurna mungkin sifat-sifat meterial
biologis, terutama viabilitasnya

Hal penting terkait keberhasilan pembekuan embrio

Keberhasilan pembekuan embrio tergantung dari jenis embrio melalui upaya
manipulasi media (krioprotektan), percepatan derajat pendinginan, pengaturan suhu
selama pemaparan, pendinginan, penyimpanan, dan pencairan. Dalam penyedian
krioprotektan yang harus diperhatikan adalah faktor konsentrasi.

Pengembangan kembali embrio yang telah dibekukan

Embrio yang telah dibekukan dapat ditumbuh kembangkan kembali secara in
vitro melalui metode kultur atau secara in vivo melalui metode transfer embrio
Faktor-faktor yang menyebabkan sel mati karena proses kriopreservasi
-

Kerusakan mekanis dengan timbulnya pembentukan kristal es intraselluler

yang dapat mempengaruhi struktur sel. Kerusakan dapat terjadi pada organel

dalam protoplasma
Adanya dehidrasi dalam suspensi media baik intra maupun ekstraselluler
sehingga konsentrasi solute menjadi toksik dan letal. Dehidrasi juga dapat

menimbulkan presipitasi, koagulasi, hancurnya struktur molekul, kenaikan

-

permeabilitas dan viskositas serta gangguan keseimbangan ion

Perubahan-perubahan fisik-kimiawi diantaranya presipitasi, denaturasi,
koagulasi dari protein, disosiasi ion dan kehilangan sifat-sifat adsorbtif ayau
sifat pengikat air.

Klasifikasi embrio Pre Pembekuan

Kualitas

Penampilan umum morfologi

A (+++)

Stadium embrio sesuai dengan yang diantisifasi

Sangat baik

( morula, blastosis awal, blastosis ) tidak cacat, zona

intak, bentuk bundar sperikal, ikatan antar blastomer
erat dan kompak, ukuran sama besar dan simetris,
warna agak gelap dan morfologi sel yang utuh

B ( ++ ) Baik

Stadum perkembangan agak retarded

banding

dengan sekelompok embrio yang terkoleksi bersama

tampak sdikit cacat, seperti keluarnya salah satu
blastomer dari ikatan kumpulan blastomer, bentuk
simetris,
C ( + ) Cukup

Staium perkembangan biasanya retarded , Cacat

bebrapa blastomer keluar, mulai berdegenerasi dan
berwarna pucat, ukuran blastomer tidak sama besar
atau asimetris

D ( - ) Jelek

Stadium perkembagan retarded , terlihat kerusakan

pada semua sel blastomer, sel blastomer sudah
mengalami degenerasi seluler seperti vakuolisasi,
granulasi dan debris, sedikit atau tidak ada sama

sekali organisasi sel

dan zona pellusida tampak

retak

Klasifikasi embrio Pasca Pembekuan

Kualitas

Penampilan umum morfologi

A (+++)

Embrio masih seperti segar, tidak dapat dibedakan dari

Sangat baik

embrio yang belum dibekukan

B ( ++ ) Baik

Lebih gelap dari normal, masih memiliki ukuran dan

bentuk seperti embrio segar

C ( + ) Cukup

Tampak jelas lebih gelap dan lebih kecil dari normal,

material yang gelap keluar dari massa sel, vesikuler,
inclusion tampak jelas, zona kelihat retak dengan batas
jelas atau kabur

D ( - ) Jelek

Warna gelap, bentuk irreguler, 1 atau beberapa masa hitam

kecil, granular, vesiculer inclusion keluar besar, zona retak
dan bentuk irreguler, blastomer mebran kabur, kadang kala
blastomer bulat tetapi tidak saling melekat dengan
blastomer sekitarnya

E ( mati ) dead

Biasanya bentuk irreguler, zona rusak berat, blastomerblastomer terlalu terang atau gelap, bentuk embrio irregular
karena sering kehilangan bagian luar membran, masa
sitoplasma sangat sedikit dan tidak ada organisasi sel
dengan jarak yang jauh dalam sitoplasma

Keuntungan Pembekuan Embrio

- Embrio dapat disimpan dalam jangka waktu tidak terbatas
- Embrio dapat dikoleksi sepanjang tahun dan ditransperkan pada musim-

musim kawin
Surplus embrio dapat disimpan dan ditransferkan pada resifien yang akan

tersedia
Jenis-jenis embrio yang berada dalam ambang kepunahan dapat

dipreservasi atau pelestarian plasma nutfah

Sebagian embrio dapat dibekukan dan ditransferkan

Kerugian Pembekuan Embrio

- Biaya tambahan untuk peralatan pembekuan dan tenaga teknisi terlatih,
-

trampil untuk mengoperasikan alat

Hanya embrio yang berkualitas bagus yang cocok dan dapat dibekukan
Sekitar 1/10 embrio beku yang telah dicairkan akan mengalami kerusakan
berat karena alasan kriopreservas

Kesimpulan
Kriopreservasi embrio adalah suatu proses penghentian untuk
sementara kegiatan hidup dari sel tanpa mematikan fungsi sel, dimana proses hidup
dapat berlanjut setelah pembekuan dihentikan. Secara umum terdapat dua metode
pembekuan yang telah dikembangkan, yaitu metode kriopreservasi konvensional dan
metode vitrifikasi.
Secara umum, mekanisme kriopreservasi merupakan perubahan bentuk fisik
timbal balik dari fase cair ke padat dan kembali lagi ke fase cair. Mekanisme fisika
kriopreservasi meliputi penurunan temperatur pada tekanan normal disertai dengan
dehidrasi sampai tingkat tertentu dan mencapai temperatur jauh di bawah 0 oC (-196
o

C). Proses ini harus reversibel ke kondisi fisiologis awal. Tujuan kriopreservasi

adalah mempertahankan sesempurna mungkin sifat-sifat material biologis terutama

viabilitasnya.
Adapun keuntungan kriopreservasi embrio ialah embrio dapat disimpan dalam
jangka waktu tidak terbatas , embrio dapat dikoleksi sepanjang tahun dan
ditransperkan pada musim-musim kawin , surplus embrio dapat disimpan dan
ditransferkan pada resifien yang akan tersedia, jenis-jenis embrio yang berada dalam
ambang kepunahan dapat dipreservasi atau pelestarian plasma nutfah, sebagian
embrio dapat dibekukan dan ditransferkan.
Kerugian kriopreservasi embrio ialah biaya tambahan untuk peralatan
pembekuan dan tenaga teknisi terlatih, trampil untuk mengoperasikan alat, hanya
embrio yang berkualitas bagus yang cocok dan dapat dibekukan, sekitar 1/10 embrio
beku yang telah dicairkan akan mengalami kerusakan berat karena alasan
kriopreservasi.

Daftar Pustaka
Anonimus.

2012.

BIOTEK.

http://makalahskripsimakalah.blogspot.com/2012/11/biotek.html.

Diakses

pada tanggal 12 Desember 2015

Fulton, J.E. 2006. Avian genetic stock preservation: Anindustry perspective. Poult.
Sci. 85:

227 231

Rall, W.F. 1992. Cryopreservation of oocytes and embryos : methods and application
Ani. Repord, Sci., 28 : 237 - 245.
Suprianata, I. dan F.H. Pasaribu. 1992. In Vitro Fertization, Transfer Embrio dan
Pembekuan Embrio. Bogor : IPB