Anda di halaman 1dari 24

LAPORAN

ISOLASI DNA KROMOSOM BAKTERI


DAN
ISOLASI DNA PLASMID DARI BAKTERI

Dosen Pembimbing : Dewi Dianasari, S. Farm., M. Farm., Apt

Oleh

: Kelompok C 3

Mia Restu

132210101086

Stevanus Ary Pratama

142210101002

Della Karissa

142210101004

Nimatin Choiroh

142210101006

Devi Ayu Larasati

142210101014

Zahra Puspa Diani

142210101016

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2016

BAB I. PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika
unit - unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat
(DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA). DNA
dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama sebab antara unit-unit
mononukleotida terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3
suatu mononukleotida dan posisi 5 pada mononukleotida lainnya (Harpet, 1980).
Asam-asam nukleat seperti asam dioksiribosa nukleat (DNA) dan asam ribonukleat
(RNA) memberikan dasar kimia bagi pemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam
nukleat merupakan molekul makro yang memberi keterangan tiap asam nukleat mempunyai
urutan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino yang unik dari suatu protein
tertentu karena asam nukleat merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan monomer
yang disebut nukleotida (Dage, 1992).
Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat (DNA) dan asam
ribonukleat (RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban
kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk selsel baru untuk memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel
mengerahkan sintesis molekul RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA (mRNA),
meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme
itu sesuai dengan kode DNA-nya(fessenden, 1990).
Meskipun banyak memiliki persamaan dengan DNA, RNA memiliki perbedaan
dengan DNA, antara lain yaitu(Poedjiati, 1994):
a. Bagian pentosa RNA adalah ribosa, sedangkan bagian pentosa DNA adalah
dioksiribosa.
b. Bentuk molekul DNA adalah heliks ganda, bentuk molekul RNA berupa rantai tunggal
yang terlipat, sehingga menyerupai rantai ganda.
c. RNA mengandung basa adenin, guanin dan sitosin seperti DNA tetapi tidak
mengandung timin, sebagai gantinya RNA mengandung urasil.
d. Jumlah guanin dalam molekul RNA tidak perlu sama dengan sitosin, demikian pula
jumlah adenin, tidak perlu sama dengan urasil.
Selain itu perbedaan RNA dengan DNA yang lain adalah dalam hal (Suryo, 1992) :

1. Ukuran dan bentuk


Pada umumnya molekul RNA lebih pendek dari molekul DNA. DNA berbentuk double helix,
sedangkan RNA berbentuk pita tunggal. Meskipun demikian pada beberapa virus tanaman,
RNA merupakan pita double namun tidak terpilih sebagai spiral.
2. Susunan kimia
Molekul RNA juga merupakan polimer nukleotida, perbedaannya dengan DNA yaitu:
a. Gula yang menyusunnya bukan dioksiribosa, melainkan ribosa.
b. Basa pirimidin yang menyusunnya bukan timin seperti DNA, tetapi urasil.
3. Lokasi
DNA pada umumnya terdapat di kromosom, sedangkan RNA tergantung dari macamnya,
yaitu:

RNAd (RNA duta), terdapat dalam nukleus, RNA d dicetak oleh salah satu pita DNA

yang berlangsung didalam nukleus.


RNAp (RNA pemindah) atau RNA t(RNA transfer), terdapat di sitoplasma.
RNAr (RNA ribosom), terdapat didalam ribosom.

4. Fungsinya
DNA berfungsi memberikan informasi atau keterangan genetik, sedangkan fungsi RNA
tergantung dari macamnya, yaitu:

RNAd, menerima informasi genetik dari DNA, prosesnya dinamakan transkripsi,

berlangsung didalam inti sel.


RNAt, mengikat asam amino yang ada di sitoplasma.
RNAt, mensintesa protein dengan menggunakan bahan asam amino, proses ini
berlangsung di ribosom dan hasil akhir berupa polipeptida.
DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di

dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast.
Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA
genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal
dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat
rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri)
atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear
sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu

atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih
kecil dibanding kromosom.

Isolasi DNA kromosom.


Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-

komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia.
Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian
pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan
RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA.
Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90C untuk menginaktifasi enzim yang
mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa
dilarutkan lagi dengan air.

Isolasi DNA plasmid


DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA

plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh
lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan
perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan
penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA,
protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan
potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi.
Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan.
Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya
DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.

Isolasi RNA
RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein.

Jumlah populasi mRNA akan lebih banyak dibanding dengan DNA. mRNA eukariot dapat
dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT. Atau RNA total juga dapat di
isolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi
DNA.

Ekstraksi DNA
Dari organisme eukaryote (manusia, hewan dan tumbuhan) dilakukan melalui proses

penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan protein dan RNA (cell digestion)
dan pengendapan DNA (precipitation of DNA) dan pemanenan. Berbagai teknik ekstraksi

DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini muncul berbagai
teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses
untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Hasil ekstraksi tersebut
merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya
harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi.
Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia
seperti EDTA (ethyllenediamine tetraacetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA
berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk
mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang
merusak asam nukleat). SDS merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membrane
sel. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Kotoran akibat lisis
sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang
telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol.
Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform
digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Enzim
RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.
Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut
dengan NaCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan
mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Proses sentrifugasi dengan kecepatan
tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung
ependorf.
Pada manusia, hanya sel darah putih yang mempunyai inti dan mengandung DNA. Agar
lebih efisien, isolasi DNA dilakukan hanya terhadap sel darah putih. Oleh sebab itu sampel
darah total (whole blood) yang masih segar langsung dipisahkan menjadi serum, sel darah
merah dan sel darah putih (dilapisan buffy coat) dengan teknik sentrifugasi. Setelah
disentrifugasi, sampel darah total akan terbagi menjadi tiga lapisan, yaitu lapisan paling atas
merupakan serum, lapisan tengah berwarna putih tipis adalah sel darah putih (buffy coat) dan
lapisan bawah adalah sel darah merah. Lapisan kedua yang merupakan sel darah putih diambil
dengan klinipette.
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam
keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan
dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan
karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi
atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.

Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus
menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus
efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah
struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA
yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. molekul yang mempunyai beratmolekul besar akan
berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung
(Mader, 1993)
Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus yang disebut
sebagai DNA kromosomal, begitu pula bakteri. Disamping DNA kromosom, beberapa bakteri
juga mengandung DNA ekstrakromosom yang disebut DNA plasmid. Berbeda dengan DNA
kromosom, DNA plasmid berbentuk sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding
DNA kromosom. DNA plasmid hanya berukuran 1.000-200.000 pasang basa. DNA plasmid
terdapat bebas di dalam sitoplasma, dan dapat melakukan replikasi secara autonom.
Pada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun
tidak memiliki plasmid. Plasmid bisa saja tidak terdapat pada bakteri yang biasa saja karena
plasmid tidak mempengaruhi ketahanan hidup bakteri tersebut. Plasmid hanya memberikan
sifat istimewa yang dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensi terhadap antibiotik.
Beberapa karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antaralain: dapat ditransfer ke
bakteri lain dan memiliki ORI (Origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa
pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ORI hingga semua plasmid
tereplikasi. Plasmid membawa informasi genetik dan mengalami replikasi untuk
menghasilkan plasmid yang identik dan diturunkan selama pembelahan sel (Gaffar, 2007).
Plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang
diinginkan ke dalam suatu sel inang. Oleh karena itu, perlu diperoleh plasmid yang tidak
terkontaminasi dengan kromosom agar diperoleh produk yang diinginkan.
Berdasarkan fungsinya plasmid dapat dikelompokkan menjadi:
Fertility- F plasmids
Merupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel ke sel bakteri lain untuk proses
konjugasi. Plasmid ini juga mempunyai kemampuan untuk mentransfer DNA atau gen baik

yang terdapat dalam plasmid ataupun dalam kromosom. Plasmid ditemukan antara lain
pada Escherichia coli, Pseudomonas sp, dan Streptomyces.
Resistance- R plasmids
Mengandung gen yang resisten terhadap antibiotik atau racun dan inhibitor pertumbuhan
lainnya. Plasmid R dapat ditemukan pada Staphylococcus.
Plasmid penyandi bacteriocins
Bacteriocins adalah senyawa yang diproduksi oleh bakteri untuk menghambat
pertumbuhan atau bakteri lain yang spesises atau galurnya berbeda. Plasmid ini
mengandung gen struktural bacteriocins ataupun gen yang mengkode protein yang
berperan dalam pemrosesan dan transport bacteriocins. Penamaan plasmid ini tergantung
pada organisme yang memproduksinya.Misalnya plasmid Col pada bakteri Escherichia
coli yang mengkode colicins.
Degradative plasmids
Merupakan plasmid yang mampu mencerna subsansi yang tidak biasa, contoh toluen dan
asam salisilat.
Virulence plasmids
Merupakan plasmid yang menjadikan bakteri tersebut patogen.
Berbagai macam bentuk plasmid akan mempengaruhi kecepatan migrasi plasmid dalam
elektroforesis. Elektroforesis adalah proses migrasi dari fragmen DNA di dalam gel yang
direndam dalam larutan buffer. Urutan migrasi bentuk-bentuk plasmid tersebut dari yang
paling cepat adalah supercoiled, supercoiled denaturated, relaxed circular, dan nicked open
circular. Bentuk plasmid yang semakin kecil atau ramping akan lebih mudah bergerak melalui
pori gel agarose sehingga akan mencapai bagian bawah terlebih dahulu. Perjalanan molekul
DNA di dalam gel mengikuti arus listrik, dari kutub negative menuju kutub positif. Semakin
besar tegangan arus listrik, perjalanan molekul DNA akan makin cepat, demikian pula
sebaliknya. Ada bermacam- macam zat kimia yang digunakan sebagai gel di dalam proses
elektrofoesis. Penggunaan jenis gel disesuaikan denga tujuan yang akan dicapai. Ada dua cara
elektroforesis, yaitu elektroforesis gel agarose dengan visualisasi menggunakan ethidium
bromide dan elektroforesis gel polyacrilamide dengan visualisasi menggunakan silver
staining.
Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa genetika, plasmid
digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Selain itu plasmid juga banyak digunakan
untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa mengekspresikan gen tertentu. Alasan
utama pengunaan plasmid ini adalah karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker
sehingga dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number yang

besar, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu. Karena plasmid memiliki fungsi
yang bisa dimanfaatkan keuntungannya, maka ada banyak cara yang digunakan untuk
mengisolasi plasmid tersebut. Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal
sebagai proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20g. Sedangkan untuk
jumlah yang lebih besar (100-200g) digunakan midi preparation dan maxi preparation untuk
jumlah yang lebih besar dari 200 g.
Dalam isolasi DNA plasmid biasanya diperoleh plasmid dalam 3 topologi, yaitu:
covalently closed circulair (ccc), open circulair (oc), dan linier (l). Isolasi plasmid bertujuan
untuk mengisolasi atau memisahkan plasmid dari molekul-molekul lain yang terdapat di
dalam sel (Suryani, dkk. 2011).
Keberhasilan tahapan isolasi bergantung pada sumber bahan, konsentrasi bahan,
stabilitas, dan kadar kemurnian produk akhir. Isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan
kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan pemanenan atau harvesting, tahap lisis dan tahap
pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu proses reproduksi bakteri sehingga pada saat
pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Perusakan (lisis) dinding sel
bakteri dapat dilakukan dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku leleh
maupun dengan cara kimiawi menggunakan larutan lisis. Plasmid yang diperoleh dimurnikan
dari berbagai kontaminan dengan penambahan fenol (Brown 2003).
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran
membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA
yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki
beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar
dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan
iradiasi. Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran
dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada
membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel. Sementara cara enzimatik seperti
menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel serta mendegradasi
protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown, 2010)
Untuk isolasi DNA plasmid, setelah pemanenan, dilakukan proses ekstraksi DNA. Hal
ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini
harus dilakukan dengan hati hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk
mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran

plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Penambahan
detergen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena detergen dapat menyebabkan rusaknya
membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik detregen dengan protein
dan lemak pada membran membentuk senyawa lipid protein kompleks ( Machfud, 2006 ).
Macam-macam detergen yang digunakan juga berpengaruh pada hasil dari isolasi
DNA dengan kualitas baik karena kandungan pada masing masing detergen berbeda. Pada
proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium dodecyl sulphate (SDS)
sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam melisiskan
membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang
merupakan enzim pendegradasi DNA. Selain digunakan SDS, detergen yang lain seperti cetyl
trimethylammonium bromide (CTAB) juga sering dipakai untuk melisiskan membran sel pada
isolasi DNA tumbuhan.
Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi.
Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa
tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal
membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi. Presipitasi juga
berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi.
Prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam nukleat
dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan
aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus
fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat
bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul isopropanol tidak dapat
berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang
lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air
dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin
akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA.
Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu
RNA dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak
membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular.Pada saat etanol atau
isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa
dalam tabung adalah DNA pekat.

Setelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol, maka
etanol kemudian dibuang dan pellet dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk
menghilangkan residu etanol dari pelet DNA. Penghilangan residu etanol dilakukan dengan
cara evaporasi karena etanol mudah menguap. Pada tahap pencucian biasanya etanol
dicampur dengan ammonium asetat yang bertujuan untuk membantu memisahkan kontaminan
yang tidak diinginkan seperti dNTP dan oligosakarida yang terikat pada asam nukleat.
Setelah pellet DNA dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer TE
ke dalam tabung yang berisi pellet dan kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu
sekitar -20C. Verkuil et al. (2008) menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada
-20C bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu
berminggu-minggu. Keller dan Mark (1989) juga menjelaskan bahwa pelarutan kembali
dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih
rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA
dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20C.
Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua
organel sel dapat keluar.Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal
(plasmid).Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran
sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Metode yangdapat digunakan untuk isolasi plasmid
antara lain yaitu boiling lysis, lysis withdetergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan
enzimatic digestion.
1.2 RUMUSAN MASALAH
Bagaimana melakukan isolasi DNA kromosom bakteri?
Bagaimana mengisolasi plasmid rekombinan pET ads dari Escherichia coli?
1.3 TUJUAN
Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA kromosom bakteri
Mahasiswa mengetahui dan mampu mengisolasi plasmid rekombinan pET ads dari
bakteri Escherichia coli
1.4 MANFAAT
Dapat melakukan isolasi DNA kromosom (interselular)
(ekstraselular) pada suatu bakteri
BAB II. METODE PRAKTIKUM
2.1 ALAT DAN BAHAN
ISOLASI DNA KROMOSOM
Alat

maupun

plasmid

Sentrifuse
Vortex
Shaker Incubator
Pemanas air
Freezer
Tabung reaksi
Pembakar spiritus
Mikropipet
Tip
Micro tube 1,5 mL
Petri dish
Sengkelit
Erlenmeyer

Bahan
Bakteri Eschericia coli
Media LB cair
PBS (Phospat Buffer Saline)
Aquabidest steril

ISOLASI DNA PLASMID


-

Alat
Shaker Inkubator 37C
UV transilluminator
Mikropipet
Ose bulat
Sentrifus
Tabung micro tube 1,5 ml
Tip biru (1ml)
Tip kuning (100 l)
Tip putih (10 l)

Bahan
Bakteri Eschericia coli pET 30
Medium Luria Bertani
Kanamisin
Solution I (150 mM glukosa, 25 mM Tris Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8)
Solution II (0,2 N NaOH, 1% SDS, aquadest steril 880 l)

Solution III (60 mL 5M potasium asetat, 11.5 mL asam asetat glasial, 28.5 mL

aquadest)
PCI (Phenol/Chloroform/Isoamilalkohol)
Bufer TE
Etanol pa
Na asetat

2.2 CARA KERJA

ISOLASI DNA KROMOSOM

ISOLASI DNA PLASMID


Pembiakan dan Pemanenan Bakteri

Isolasi plasmid

BAB III. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

ISOLASI DNA KROMOSOM

Pada praktikum kali ini kami melakukan percobaan isolasi DNA kromosom bakteri,
untuk mengisolasi DNA kromosom bakteri ini perlu dilakukan beberapa langkah yaitu
menumbuhkan bakteri dan pemanenan bakteri untuk mendapatkan sel yang cukup kemudian
pemecahan dinding sel bakteri dan yang terakhir pemurnian atau pemisahan kromosom dari
komponen-komponen sel lainnya.
Penanaman untuk menumbuhkan sel bakteri dapat dilakukan dengan membiakkan
bakteri E.coli rekombinan yang diambil dari LB padat dan ditumbuhkan di LB cair kemudian
dishaker inkubasi selama 18 jam pada suhu 37C dengan kecepatan 150 rpm. Alasan
digunakannya shaker inkubator yaitu untuk meningkatkan aerasi sehingga mempermudah
dalam meratakan bakteri didalam media dan akhirnya pertumbuhan bakteri akan lebih
banyak.
Setelah penanaman yaitu dilakukan pemanenan, pemanenan dilakukan dengan cara
mengambil 1 ml biakan bakteri masukkan eppendorf 1,5 ml kemudian disentrifugasi selama 5
menit kecepatan 12.000 rpm dengan kecepatan ini maka akan mengendapkan sel-sel dari
bakteri sehingga yang diambil adalah natannya sedangkan supernatan dibuang. Kemudian
natan yang diperoleh dicuci dengan 1ml PBS dan disentrifugasi lagi selama 5 menit dengan
kecepatan 12.000 rpm pencucian ini bertujuan untuk menghilangkan sisa-sisa media
supernatan. Setelah selesai pencucian maka natan tadi disimpan pada suhu -20C.
Pemecahan dinding sel bakteri pada percobaan ini menggunakan metode Heat-Shock
yang dilakukan dengan cara mendidihkan pelet yang beku akibat disimpan disuhu -20C tadi
selama 4 menit kemudian dilarutkan dengan 50l aquabidest steril kemudian diresuspensi.
Tahapan yang terakhir yaitu pemurnian kromosom dari komponen-komponen lain
yang dilakukan dengan cara sentrifugasi selama 5 menit kecepatan 13.000 rpm dengan
kecepatan ini maka akan mengendapkan material-material sel bakteri dengan BM besar,
sehingga kromosom bakteri akan berada pada supernatannya. Supernatan diambil dan
disimpan pada suhu -20C hingga digunakan untuk nalisis selanjutnya.

ISOLASI DNA PLASMID

Untuk mengisolasi DNA plasmid perlu dilakukan beberapa langkah yaitu penanaman
bakteri pada suatu media LB cair, pemanenan dan lisis sel bakteri serta pemurnian plasmid
DNA yang dilakukan dengan ekstraksi dengan pelarut organik atau metode kromatografi.
Penumbuhan bakteri ini dilakukan dengan tujuan memperbanyak bakteri sehingga didapat sel
yang cukup untuk dilakukan dengan tujuan memperbanyak bakteri sehingga didapat sel yang
cukup untuk dilakukan proses selanjutnya. Sehari setelah penumbuhan bakteri dilakukan
pemanenan bakteri yang diambil sebanyak 1,5 ml dan dimasukkan ke tabuang eppendorf,
dilakukan pemecahan/lisis sel dengan sentrifugasi bakteri yang ada dalam tabung eppendorf
setelah 5 menit. Supernatan (cairan) sel dibuang, artinya DNA kromosom berada pada bagian
yang tidak larut yaitu pelet sel. Proses sentrifuse di lakuakan sebanyak 3 kali berturut-turut
dengan tujuan mendapatkan pelet sel yang lebih banyak. Hasilnya diresuspensi dengan
solution I sebanyak 100l dan divortex, lalu ditambah solution II sebanyak 200 l dengan
cara memipet 100 l SDS 1% dari 10% dan NaOH 0,2 N dari 10 N sebanyak 20 l serta
aquadest steril 880 l dan dibolak-balik 6-8 kali. Lalu, diinkubasi selama 5 menit sampai
bening di es maka akan terjadi lisis dan diambil supernatannya. Ditambahkan 150 l solution
III dan bolak-balik 6-8 kali dan disimpan dalam es selama 5 menit, lalu disentrifugasi dan
dipindahkan pada eppendorf baru. Ukur volume supernatan yaitu 450 l dan tambahkan PCI
dengan volume yang sama, divortex dan sentrifus kembali (jangan lupa untuk memakai
sarung tangan saat bekerja dengan PCI). Diambil lapisan atas, ditambahkan etanol p.a 2,5
kalinya dari 400 l dan Na asetat 3M sebanyak 0,1 kalinya dari volume supernatan saja yaitu
400 l. Dilakukan presipitasi dengan suhu -20C didalam lemari es selama 1 jam, lalu
eppendorf ini disentrifugasi lagi dan diambil peletnya (residu) dan dicuci dengan etanol
dingin 70% dengan cara resuspensi, lalu disentrifus lagi. Selanjutnya, pelet dikerngkan dalam
20 l buffer Tris EDTA dan disimpan pada suhu 4 C untuk analisis selanjutanya yaitu
elektroforesis.

BAB IV. PENUTUP

4.1 KESIMPULAN
Isolasi DNA adalah proses pemisahan DNA yang diinginkan dari molekul yang tidak

diinginkan.
Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dapat replikasi otonom dan sebagai

vektor transfer DNA.


Langkah isolasi adalah menumbuhkan bakteri, memanen bakteri, melisiskan dinding
sel bakteri dan pemisahan serta pemurnian plasmid DNA dari komponen lainnya.

4.2 SARAN
Isolasi DNA kromosom dan isolasi DNA plasmid harusnya dilakukan secara hati-hati
supaya tidak terkontaminasi pada tubuh.

BAB V. DAFTAR PUSTAKA


Dage ,Yohanis 1992.Biokimia Dasar.Bandung: Penerbit Rekayasa Sains.
Fesseden, Ronald A. 2004. Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Jakarta:
Penerbit Buku Kedokteran EGC
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius

LAMPIRAN FOTO

Alat sentrifus

Tabung mikrosentrifus

Media LB cair yang berisi bakteri E.Coli

Memasukkan bakteri dalam tabung mikrosentrifus 1.5 ml

Tabung mikrosentrifus yang telah diisi lb cair dan siap untuk di sentrifus

Tabung yang telah diisi oleh media LB cair disentrifus dimasukkan ke dalam
alat

Tabung mikrosentrifus yang telah disentrifus dan tampak pelet

Hasil biakan bakteri yang telah disuspensi dengan mikropipet

Supernatan dibuang untuk diambil peletnya dan dijadikan dalam tabung untuk
disentrifus

Supernatan dibuang untuk diambil peletnya dan dijadikan dalam tabung untuk
disentrifus

Pelet yang telah dipisahkan dengan supernatan di sentrifus selama 5 menit

Dna kromosom
mendidihkan pelet beku

diekstraksi dengan

Pelet disimpan pada suhu -200C