RUC, Nat-Bach, Hus 14.

1
2. semester, 2016

Gruppe: 14
Gruppemedlemmer:
Michelle Hundevad Rasmussen

57993

Fahima Yasen

58145

Kenneth Jack Jensen

57347

Prince Ravichandran

57353

Vejleder
Ole Skovgaard

Forord
Dette er et 2. semesterprojekt p den Naturvidenskabelige Bacheloruddannelse p Roskilde
Universitet. Projektet er skrevet inden for biologi og kemi. I dette semester skal projektet opfylde
semesterbindingen Samspil mellem teori, model, eksperiment og simulering i naturvidenskab.
For at kunne gennemfre dette projekt har vi fet hjlp fra flere sider, og vi vil gerne takke visse
personer. Frst og fremmest vil vi gerne takke vores vejleder Ole Skovgaard for inspiration, ny
viden og hjlp i laboratoriet.
Dertil vil vi gerne takke lektor Torben Lund for ln af laboratorium, materialer og udstyr til at
udfre vores forsg samt god sparring og feedback. Vi vil ogs takke laboratorieteknikker Britt
Clemmensen for udfrslen af 1H-NMR, og til sidst takker vi professor Poul Erik Hansen, for
udfrelsen af de kvantekemiske beregninger af vores stoffer, samt sparring omkring de kemiske
beregninger og 1H-NMR.

Abstract
As a relatively new type of ionic liquids, Deep Eutectic Solvents (DES) have been proclaimed to
have capabilities similar to those of ionic liquids and some has even been proven to have
antibacterial effects. With this project we aim to investigate the antibacterial effects of DES and
to assess these effects, we have studied a phosphonium-based DES and its effects on four bacteria
along with yeast, through agar diffusion assay. We have also studied whether DES in high
dilution has response to the bacteria and simultaneously tested the components of DES where
the amount of substance was matched. The phosphonium-based DES applied in this project
showed antibacterial effects against all four bacteria, but no effect on yeast. DES also revealed a
higher impact on the grampositive bacteria than on the gramnegative, as well as showing a
bacteriostatic effect, rather than a bactericidal. Agar diffusion assay showed that DES and its
HBA had an approximately equal antibacterial effect, which led us to believe that the DES
complex had been broken down in aqueous solution. We were able to confirm this through 1HNMR spectroscopy, which leads to the conclusion that the DES studied in this project isnt
suitable for application as an antibacterial remedy.

Resume
Deep Eutectic Solvents (DES) er en relativ ny type ionvske, som er blevet proklameret at have
samme egenskaber som de typisk anvendte ionvsker. DES har iflge nylig undersgelser vist
sig at have antibakterielle egenskaber, og disse egenskaber vil blive undersgt gennem dette
projekt. For at vurdere DES antibakterielle egenskaber, har vi testet en fosfonium-baseret DES
p fire bakterier, samt gr, via agar diffusion assay. Vi har ogs undersgt, om DES viser
antibakteriel effekt, over for bakterier, nr den er meget fortyndet, og har samtidigt testet
oplsninger af DES komponenter, med tilsvarende stofmngde. Den fosfonium-baserede DES
anvendt i dette projekt, viste antibakterielle effekter mod alle fire bakterier, hvorimod den ingen
effekt havde p gr. DES viste strre indvirkning p grampositive bakterier end gramnegative
bakterier, og viste bakteriostatisk virkning frem for bakteriocidalt. Resultaterne fra agar diffusion
assayet viste, at DES og dens HBA antibakterielle virkning var tilnrmelsesvis det samme.
Dette ledte os til den konklusion, at DES komplekset var blevet spaltet i vandig oplsning,
hvilket blev bekrftet via 1H-NMR spektroskopi. Dette ledte os til konklusionen; at den
fosfonium-baserede DES anvendt i dette projekt ikke er velegnet som antibakterielt remedie.

Indhold
Kapitel 1 Introduktion ........................................................................................................... 5
1.1 Indledning ................................................................................................................... 5
1.2 Semesterbinding .......................................................................................................... 6
1.3 Arbejdsmetode ............................................................................................................. 6
Kapitel 2 Deep Eutectic Solvents ........................................................................................... 7
2.1 De anvendte DES ........................................................................................................ 8
Kapitel 3 Celler ................................................................................................................... 10
3.1 Eukaryote celler ......................................................................................................... 10
3.2 Prokaryote celler ........................................................................................................ 11
3.2.1 Grampositive og gramnegative bakterier .............................................................. 12
Kapitel 4 Antibakterielle midler ........................................................................................... 15
4.1 Antibiotika ................................................................................................................ 15
4.1.1 Tetracyklin .......................................................................................................... 15
4.1.2 Rifampicin .......................................................................................................... 16
4.2 Inhibering af Cellen ................................................................................................... 17
4.2.1 Inhibering af cellevgs biosyntesen ...................................................................... 17
4.2.2 Inhibering af protein biosyntesen ......................................................................... 18
4.2.3 Inhibering af DNA replikation/RNA transskriptionen .......................................... 18
4.2.4 Inhibering af folsyremetabolismen........................................................................ 19
Kapitel 5 Eksperimentelt ..................................................................................................... 20
5.1 DES antibakterielle egenskaber ................................................................................. 20
5.2 DES 4........................................................................................................................ 23
5.3 DES kontra HBA ....................................................................................................... 23
5.4 Fortyndede DES kontra HBA .................................................................................... 25
5.5 Antibiotika og DES indvirkninger p henholdsvis gr og 4 bakterier .......................... 28

5.6 DES interaktion med vand ........................................................................................ 30

Kapitel 6 Diskussion ........................................................................................................... 33
Refleksion over arbejdsproces .......................................................................................... 37
Kapitel 7 Konklusion .......................................................................................................... 38
Kapitel 8 Perspektivering ..................................................................................................... 39
Kapitel 9 Materialer og metoder .......................................................................................... 40
Fremstilling af LB medie ................................................................................................. 40
Fremstilling af agarplader ................................................................................................ 40
Agar diffusion assay ........................................................................................................ 40
Synteser .......................................................................................................................... 41
Fortyndinger ................................................................................................................... 42
Litteraturliste ...................................................................................................................... 44
Bilag A ............................................................................................................................... 46
Bilag B ................................................................................................................................ 48
Bilag C ............................................................................................................................... 49

Kapitel 1 Introduktion
1.1 Indledning
Ionvsker er en klasse af kemikalier, som har flere egenskaber, som gr dem nyttige f.eks. lavt
damptryk og hj konduktivitet. De er ofte anvendt som oplsningsmiddel i kemiske
synteseprocesser, bl.a. i ekstrahering af urenheder i biodiesel og metal-rensning [Zhang et al.,
2012]. Det er p nuvrende tidspunkt et hovedfokus inden for grn kemi at finde ionvsker,
som er mindre sundheds- og miljskadelige end dem, der anvendes i dag.
Deep Eutectic Solvents (DES) er klassificerede som room temperature ionic liquids (RTILs), og
har flere egenskaber til flles med de meget anvendte imidazolium-baserede ionvsker, samtidig
med at de er mindre toksiske og mere prisvenlige [Hayyan et al., 2015]. Vi har anvendt en
ammonium-baseret DES som elektrolyt i Dye-sensitized Solar Cells (DSCs) i vores 1. semester
projekt, og har erfaret, at DES besidder egenskaber som elektrolyt p niveau med de nuvrende
elektrolytter [Nielsen et al., 2015].
Ud over dette har DES ogs andre anvendelsesmuligheder, blandt andet kan DES iflge
litteraturen anvendes som antibakterielt middel. I en artikel fra 2012 viste fosfonium-baserede
DES toksicitet overfor flere forskellige bakterier [Hayyan et al., 2012]. De konkluderede, at DES
eventuelt kunne anvendes som antibakterielt middel, men at der skulle meget forskning til, fr
det kunne pvises, om det var muligt.
I en artikel fra 2013 blev ammonium-baserede DES undersgt og viste ikke nogen toksicitet over
for de samme bakterier [Hayyan et al., 2013]. I 2015 blev de samme ammonium-baserede DES
igen undersgt, men i meget strre omfang. Resultaterne omhandlende bakterier fra denne
undersgelse var i uoverensstemmelse med resultaterne fra 2013 [Hayyan et al., 2015].
Disse tre artikler er de eneste, der direkte undersger de antibakterielle effekter af DES, og
allerede her findes modstridende resultater. Vi vlger derfor at undersge udvalgte fosfoniumog ammonium-baserede DES antibakterielle effekter p fire forskellige bakterier; to
grampositive og to gramnegative. I tilfldet af at DES viser antibakteriel effekt, undersges ogs
DES indvirkning mod eukaryote celler, hvilket leder os hen imod vores problemformulering:
I dette projekt undersges Deep Eutectic Solvents antibakterielle egenskaber der bliver herunder lagt vgt
p, om Deep Eutectic Solvents besidder en synergetisk effekt med henblik p de antibakterielle egenskaber.
Dette leder hen imod en undersgelse af, hvorledes Deep Eutectic Solvents reagerer i vandig oplsning. Dertil
undersges indvirkningen p eukaryote celler, hvilket giver baggrund for en afsluttende diskussion af Deep
Eutectic Solvents anvendelsesmuligheder.
5

1.2 Semesterbinding
Dette er et 2. semester projekt, som har til endeml at opfylde semesterbindingen Samspil
mellem teori, model, eksperiment og simulering i naturvidenskab.
Nr man arbejder inden for et felt, der endnu ikke er veludforsket, bygger ens eksperimenter p
en begrnset mngde teori. Som i dette projekt, hvor vi kun har haft minimal teori, om DES
antibakterielle virkning fra litteraturen, at basere vores hypoteser p.
Vi har igennem vores eksperimenter hurtigt bevget os lngere ind i feltet, end vi har kunnet
finde tidligere forskning p. Det har bevirket, at vi mtte opbygge vores modeller og hypoteser
ud fra meget generel teori, hvilket har skabt nogle udfordringer. Dog er det ogs sledes forskning
udfres, hvilket har givet os et godt indblik i samspillet mellem teori og eksperiment, inden for
det naturvidenskabelige omrde.

1.3 Arbejdsmetode
Besvarelsen af problemformuleringen er primrt opnet gennem laboratoriearbejde, dog har vi
ogs gjort brug af en del bger og videnskabelige artikler. Mlet med dette projekt er frst og
fremmest at vurdere DES antibakterielle egenskaber. Derudover vil vi ogs forsge kvantitativt
at opstille nogle beregninger af koncentrationer, som vi vil forsge at sammenligne med to
antibiotika, som vi har anvendt som reference til de anvendte DES.
Projektet er opbygget sledes, at vi begynder med baggrundsteori til DES, samt opbygningen af
prokaryote og eukaryote celler, i kapitel 2 og 3. Denne viden har vi primrt opnet vha. bger,
men vi har ogs gjort brug af en del videnskabelige artikler.
I kapitel 4 kommer vi ind p de generelle mekanismer, hvorved antibiotika inhiberer prokaryote
celler. Dette er ogs baggrundsviden, men en viderebygning p kapitel 3, som omhandler
strukturen af celler.
Kapitel 5 er det eksperimentelle afsnit. Til hvert forsg er der frst en kort introduktion, efterfulgt
af resultaterne, og s rundet af med en kort diskussion af de opnede data, som s vil blive
diskuteret videre i kapitel 6.
Kapitlerne 6 og 7 er diskussionen og konklusionen, hvor vi vil sammenholde og diskutere vores
data fra de enkelte diskussioner i kapitel 5, samt sammenligne vores data med tidligere forsg
fundet i litteraturen. Projektet vil blive afsluttet og problemformuleringen besvaret i
konklusionen. Afslutningsvis vil vi i kapitel 8 give en perspektivering.

Kapitel 2 Deep Eutectic Solvents

DES dannes ved at blande to eller flere stoffer, som individuelt har hjere smeltepunkter end det
kompleks, der bliver dannet. DES hrer under en gruppe af ionvsker, kaldt RTILs, hvor navnet
henviser til at de er p vskeform ved stuetemperatur.
DES er en eutektisk blanding, som bliver dannet via hydrogenbindinger mellem to eller flere
komponenter. En eutektisk blanding er karakteriseret ved et skaldt eutektisk punkt, som er t
bestemt molforhold af to komponenter blandet sammen, som resulterer i en homogen vske
med et lavere smeltepunkt [Zhang et al., 2012]. Dette illustreres i fasediagrammet i figur 1.

Figur 1: Fasediagram over et eutektisk system som illustrerer temperaturen mod molforholdet.

For at danne DES, krver det stoffer som kan binde til hinanden via hydrogenbindinger. Det
ville sige, at DES skal indeholde bde en skaldt "hydrogen bond donor" (HBD) og en "hydrogen
bond acceptor" (HBA). En HBA er ofte et organisk salt, som bestr af en kvaternr kation og en
halid anion, eksempelvis chlorid eller bromid. Hydrogenbindingerne mellem halid anionen og
HBD komponenten formindsker smeltepunktet af komplekset hvorved det kommer p
vskeform. Dette sker grundet formindskelsen af den energi, der holder dem i en gitterstruktur.
Energien bliver formindsket p grund af den energi, der bliver brugt p at danne
hydrogenbindingerne [Abbott et al., 2002; Zhang et al., 2012].
P figur 2 ses kompositionen af en DES bestende af MTPB og glycerol i forholdet 1:4. Der
dannes 2 hydrogenbindinger fra hver glycerol til bromid ionen.

Figur 2: 3D strukturen af DES 1 komplekset. Til venstre ses 4 glycerol molekyler som danner hydrogenbindinger med en
bromid ion. Til hjre ses strukturen af MTP. Beregningen er foretaget af prof. Poul Erik Hansen ved hjlp af det
kvantemekaniske program Gassian. Mrkerd = bromid, orange = fosfor, rd = oxygen, gr = carbon og hvid = hydrogen.

2.1 De anvendte DES

Basis for vores projekt er at undersge fosfonium-baserede DES, men ogs for at syntetisere
andre DES med mulige antibakterielle egenskaber. Da vi tager udgangspunkt i Hayyan et al.
artiklen fra 2013, har vi baseret nogle af vores DES p deres. Andre DES blandinger har vi valgt,
med udgangspunkt i deres brug som antibakterielt remedie.
HBAen anvendt i artiklen er methyl triphenyl fosfonium bromid (MTPB). Denne HBA
kombineres med glycerol, som er velegnet til brug i DES grundet dets evne til at donere tre
hydrogenbindinger [PubChem Glycerol, web].
Vi vlger ogs en kombination af cholin chlorid som HBA og benzamid som HBD. Cholin
chlorid blev i 2012 undersgt i fire forskellige DES kombinationer og viste ingen antibakteriel
effekt [Hayyan et al., 2012], hvilket vi sger at eftervise. Da benzamid er en del af strukturen i
adskillige antibiotika, samt har evnen til at donere en hydrogenbinding [PubChem Benzamide,
web], valgte vi at anvende den som komponent i DES, med forhbninger om at frembringe
antibakterielle egenskaber.
Den tredje DES vi undersger, er med MTPB som HBA og adipinsyre som HBD. Adipinsyre
har vi valgt da den er en strk syre, som burde have en indvirkning p bakterierne, og den kan
samtidigt opfylde rollen som en HBD i en DES.
De indgende stoffer kan ses i figur 3 nedenfor.
8

Figur 3: Molekylre strukturer af de forskellige komponenter i DES.

Kapitel 3 Celler
Alle levende organismer er opbygget og afhngig af celler. Alle celler skal kunne optage
nringsstoffer, have mulighed for respiration, samt have det vitale arvemateriale DNA.
Dette kapital omhandler eukaryote og prokaryote celler og deres forskelle, samt en beskrivelse
af grampositive og gramnegative bakterier.

3.1 Eukaryote celler

Den eukaryote celletype forekommer bde hos encellede organismer (gr og svampe) og hos
flercellede organismer (dyr og planter).
Den eukaryote celle er kendetegnet ved at den er stor med en typisk lngde p 10-100 m
[Thougaard et al., 2011]. Cellen er opbygget af forskellige organeller, som kan ses i figur 4
nedenfor.

Figur 4: Den eukaryote celle struktur [Campbell et al., 2003]

De eukaryote celle indeholder alts utroligt mange organeller, men i dette kapitel bliver der kun
fokuseret p de, der er relevante mht. antibiotika. Disse inkluderer: Cellemembran, cellekernen
og ribosomerne.

10

Alle celler har en cellemembran, der adskiller og beskytter dem fra det omgivende milj.
Cellemembranen er grundlggende opbygget af fosforlipider, som danner et dobbelt fedtlag,
med et hydrofobt ydre og en hydrofil indre. Membranen indeholder ogs proteiner, der
transporterer de stoffer, der skal ud og ind i cellen.

Figur 5: Cellemembran struktur [Campbell et al., 2014]

Inde i cellen findes cellekernen, som indeholder arvematerialet DNA. Derudover indeholder
cellekernen ogs proteiner og enzymer, som hjlper til nr der f.eks. dannes mRNA. mRNA er
afgrende for syntesen af proteiner i cellen, som varetages af ribosomerne. De proteiner, der
dannes, anvendes utallige steder i cellen og er vitale for dens overlevelse. Ribosomerne har
samme funktion bde i eukaryote og prokaryote celler [Thougaard et al., 2011].

3.2 Prokaryote celler

Den prokaryote celle har en lngde p 0,5-5 m, og har kun et kromosom som indeholder DNA.
Den prokaryote celle har en meget simpel struktur i modstning til den eukaryote, og indeholder
f.eks. ikke en cellekerne. Bakterier er prokaryote celler [Thougaard et al., 2011].
Inde i cellen findes der ogs ribosomer, som bestr af rRNA og protein. Ribosomers strrelse
angives i enheden Svedberg (S), som er et udtryk for, hvor hurtigt ribosomerne bundflder ved
centrifugering. Jo hjere S vrdi, desto strre er ribosomerne. Bakterieribosomer har en strrelse
p 70S - bestende af to subunits 50S og 30S - og er mindre end ribosomer i de eukaryote celler,
som er 80S - en 60S og 40S [Thougaard et al., 2011].

11

Som tidligere nvnt indgr ribosomerne i proteinsyntesen, og derfor er ribosomerne et vigtigt

ml for antibiotika at angribe. I prokaryote celler findes der bde mindre ribosomale subunits
(30S) og strre ribosomale subunits (50S), som er illustreret i figur 6. Det 30S har en kompleks
struktur dannet af 16S RNA og ribonukleoproteiner, der fungerer i mRNA translation og bliver
hmmet af aminoglycosider og tetracykliner [Lambert, 2012].

Figur 6: Ribosomale subunits af den eukaryote og prokaryote celle [Siborova, 2014].

3.2.1 Grampositive og gramnegative bakterier

Der er ikke stor forskel p selve cellestrukturen af gramnegative og grampositive bakterier, den
strste forskel findes i deres cellemembran og cellevg. Begge bakterietyper har et skaldt
peptidoglycan (PG) lag, ogs kaldet et mureinlag, som bestr af sukkerarter og aminosyrer.
Mureinlaget er en sammenstning af N-acetyl-glucosamin (NAG) og N-acetyl-muramin
(NAM), hvilket omslutter bakterien og er med til at fungere som en barriere imod osmotiske
krfter, som kan medfre lysis for cellen. Grampositive bakterier har en enklere vg med en
stor mngde peptidoglycan, alts har de et tykkere mureinlag omkring cellemembranen
[Thougaard et al., 2011].
Gramnegative bakterier har et tyndere mureinlag samt en mere kompleks struktur med en ydre
membran. Gramnegative bakterier har to membraner, den indre og den ydre membran, som
12

indeholder lipopolysaccharider. Den ydre membran hjlper til at beskytte dem imod hrde
miljer, som f.eks. kroppens forsvar.
Gramnegative bakterier har ogs en tendens til at vre mere modstandsdygtige end grampositive
bakterier over for antibiotika, fordi den ydre membran forhindrer penetreringen af antibiotika
ind i cellen.
Forskellene mellem de to bakterietyper kan ses p figur 7.

Figur 7. Forskellen i strukturen af grampositive og gramnegative bakterier [Thougaard et al., 2011].

I dette projekt undersges DES antibakterielle effekt p bde grampositive og gramnegative

bakterier samt gr. Nedstende er en kort beskrivelse af de 4 udvalgte bakterier, som anvendes
i dette projekt:
Grampositiv
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis er stavformede bakterier, som vokser i jorden og forrdnede organiske materialer,
hvor de kan derfra nemt overfres via luft, stv og vand. De vokser typisk i store, flade,
hvidfarvede kolonier p agar substrat. B. subtilis er normalt apatogen. Bakterien har en
fordoblingstid p ca. 26 minutter ved 40oC [Thougaard et al., 2011].
Micrococcus luteus
Micrococcus luteus er sm bakterier, som angivet ved navnet micro. M. luteus arter er meget udbredt
i naturen og deres placering er enkeltvis eller i kolonier. Hvis man undersger indholdet af
13

luftbakterier, s er en stor del af dem M. luteus. De danner glinsende hvide, gule eller rdlige
kolonier p agarpladen efter inkubation. Generelt er M. luteus meget flsom over for antibiotika,
f.eks. penicillin [Thougaard et al., 2011].
Gramnegativ
Escherichia coli
Escherichia coli er bakterier som forekommer af den normale tarmflora (i tyktarmen). Generelt er
E. coli apatogen, men der findes nogle varianter af bakterien, der er patogene, som forrsager
diarrsygdomme. Bakterien har en fordoblingstid p ca. 20 minutter ved 38oC [Thougaard et al.,
2011].
Serratia marcescens
Serratia marcescens er en bakterie der forekommer i jord og vand, og som kan findes som
forurening i fdevarer. S. marcescens kan nemt identificeres ud fra den rde pigment, som dannes
ved inkubation ved ca. 30oC. Bakterien er bevgelig, da den har flagela [Thougaard et al., 2011].

Figur 8: Skitsering af de fire bakterier anvendt i projektet.

14

Kapitel 4 Antibakterielle midler

Antibiotikas virkemde kan groft inddeles i to former for hovedgrupper; nemlig bakterier og
svampe. Vi har overvejende fokus p bakterierne i dette projekt, dog har vi ogs testet nogle af
de DES vi har anvendt, imod gr, hvilket tilhrer svampegruppen.
Antibiotika kan have to indvirkninger p bakterierne; de kan hmme bakterievksten, hvilket
kaldes at de er bakteriostatiske, eller de kan vre bakteriedrbende (bakteriocidale). Dette er
dog ikke ensbetydende med at en antibiotika, f.eks. penicillin, er cidal over for alle former for
bakterier. Et antibiotika kan sagtens vre cidal over for en eller flere bakterier, men statisk over
for andre, eller sgar ingen indvirkning have p nogle bakterier [Walsh, 2003].

4.1 Antibiotika
Antibiotika kan vre bde naturligt fremkomne eller syntetiserede stoffer. Mange af de
antibiotika vi kender i dag er udvundet fra forskellige bakterier, da bakterierne selv fremstiller
antibiotika for at bekmpe andre bakterier i samme milj.
I vores projekt har vi anvendt to forskellige antibiotika, som reference til vores DES; nemlig
Tetracyklin og Rifampicin.
4.1.1 Tetracyklin
Tetracyklin er et naturligt antibiotika som er udvundet fra Streptomyces aureofaciens.
Antibiotikummet blev fundet i 1940erne og har til forml at inhibere proteinsyntesen i de
prokaryote celler, mere prcist binder Tetracyklin sig til 30S ribosomerne og er med til at blokere
ribosomets funktion [Jakobsen, 2013].

Figur 9: Strukturen af Tetracyklin.

15

Tetracyklin er valgt, da den har et bredt spektrum og virker p bde grampositive og

gramnegative bakterier [Chopra & Roberts, 2001].
4.1.2 Rifampicin
Rifampicin er et antibiotikum som er syntetiseret ud fra bakterien Streptomyces mediterranei.
Rifampicin angriber RNA syntesen, ved at danne et kompleks med enzymet RNA polymerase,
og derved forhindrer syntesen af RNA [Walsh, 2003].

Figur 10: Strukturen af Rifampicin [PubChem Rifampicin, web].

Rifampicin har et bredt spektrum og virker anti-bakterielt overfor mange forskellige bakterier,
hvilket er grunden til at, vi har valgt denne [PubChem Rifampicin, web].

16

4.2 Inhibering af Cellen

Figur 11: Overblik over de fire hovedomrder i bde grampositive og gramnegative bakterier, som antibiotikaene inhiberer
[Walsh, 2003].

Nr man skal finde et antibiotikum er det vigtigt at tage hjde for de strukturelle forskelligheder
mellem de prokaryote og eukaryote celler, for at sikre sig at der ikke ydes skade p de eukaryote
celler, men udelukkende drber eller hmmer de prokaryote.
Nedenfor gives en kort gennemgang af de fire hovedomrder, som antibiotika angriber hos de
prokaryote celler, samt eksempler p hvordan nogle antibiotika angriber inden for de forskellige
omrder, hvilket ogs er fremhvede p figur 11.
4.2.1 Inhibering af cellevgs biosyntesen
Som gennemget i kapitel 3, samt kan ses p figur 11, er mureinlaget i cellevgen bundet
sammen med kovalente krydsbindinger. Disse kovalente krydsbindinger er med til at forstrke
cellevgen [Thougaard et al., 2011]. Krydsbindingen og sammenstningen af mureinlaget
foregr vha. enzymer. Det er ved disse enzymer at f.eks. penicillin, som er af -lactam gruppen,
17

gr ind og inhiberer enzymerne. Derved forhindrer de syntesen af de krydsbindinger, som er med

til at give mureinlaget sin styrke, hvilket medfrer lysis for cellen. Denne form for antibiotika er
derfor cidal, da cellevgen vil briste, grundet det hje osmotiske pres [Walsh, 2003; Thougaard
et al., 2011].

4.2.2 Inhibering af protein biosyntesen

Som tidligere nvnt er ribosomerne i de prokaryote celler 70S ribosomer, bestende af to
halvdele, en 30S og en 50S. Ribosomerne har til funktion at syntetisere proteiner ud fra mRNA,
og dette gres vha. tre forskellige sites inde i selve ribosomerne; A-site, P-site og E-site. Frst
lser ribosomerne et kodon p mRNA stregen, og ved A-sitet finder ribosomerne s et passende
antikodon. Antikodonerne har forskellige aminosyrer forbundet til sig. Dette antikodon bliver
s flyttet videre til P-sitet, og ribosomerne har et frit A-site igen. Ribosomerne lser s det nste
kodon og finder dets antikodon, som placeres i det frie A-site. Aminosyren ved P-sitet bliver s
bundet til den nye aminosyre ved A-sitet gennem peptidbindinger, og antikodonerne flytter igen
videre fra A-site til P-site og til slut E-site. P denne mde vokser polypeptiderne, indtil de er
net sine nskede strrelser, som bestemmes ud fra mRNA stregen, og derved blevet til
proteiner.
Disse tre sites er, hvor antibiotika kan inhibere, de kan inhibere i bde 50S og 30S. Som nvnt
tidligere inhiberer Tetracyklin, som vi har anvendt i vores projekt, ved 30S ribosomerne, og
blokerer derfor for antikodonerne, s proteinsyntesen ikke kan forlbe. Denne mde hvorved at
antibiotika inhiberer proteinsyntesen er bakteriostatisk, da antibiotika kun forhindrer bakterierne
i at replikere, og ikke direkte slr dem ihjel, modsat penicillin som medfrer at cellevgen brister
og bakterien dr med det samme [Walsh, 2003].
4.2.3 Inhibering af DNA replikation/RNA transskriptionen
DNA er det man kalder supercoilede, alts at DNA strengene er snoede om hinanden, og de
snoede DNA strenge er s snoede om hinanden igen, hvilket er med til at skabe en stor spnding.
DNA er supercoilet for at det optager mindre plads inde i cellen. For at replikationen kan forlbe,
er der frst behov for nogle enzymer, som kan lsne spndingen p stregen, ved at klippe stregen
over og s sammenstte den igen. Disse enzymer kaldes for topoisomeraser, og det er ved disse
enzymer at de antibiotika, som angriber DNA replikationen gr ind og inhiberer. Antibiotika
gr ind og inhiberer den del af topoisomeraserne som sammenstter DNA stregen igen. Da mere

18

og mere DNA bliver foldet ud og derved optager mere plads i cellen, vil cellen til sidst d. Det
vil sige at denne form for inhibering er cidal [Jakobsen, 2013].
Rifampicin, som vi har anvendt i vores forsg, er et antibiotikum, som nvnt tidligere, inhiberer
RNA transskriptionen. RNA transskriptionen forlber vha. et enzym, som hedder RNA
polymerase. Rifampicin binder sig til dette enzym ved et allosterisk sted, og derved forhindrer
enzymet RNA stregen i at blive forlnget [Walsh, 2003].
4.2.4 Inhibering af folsyremetabolismen
Inde i bakteriecellen foregr der en proces, som kaldes for folsyremetabolismen. Denne proces
bestr af flere forskellige trin, hvorved der indgr nogle forskellige enzymer. Det er ved disse
enzymer, at antibiotika kan g ind og inhibere dannelsen af folsyre. Et af disse enzymer hedder
dihydropteroate synthase, som gr ind og binder to stoffer sammen, 7,8-dihydropterin
pyrophosphat og para-aminobenzoat (PABA). Ved at inhibere enzymet, og derved forhindre den
endelige dannelse af folsyre, som indgr i dannelsen af nukleotider, vil der forefindes frre
nukleotider til DNA replikationen og RNA transskriptionen. Denne form for inhibering er
bakteriostatisk, da den ikke medfrer direkte lysis for cellen, med derimod besvrer
celledelingen [Walsh, 2003].

19

Kapitel 5 Eksperimentelt
I dette kapitel beskrives de forsg, der er udfrt i projektet. Formlet med hvert forsg angives,
hvorefter fremgangsmde og resultater prsenteres. Herefter diskuteres resultaterne kort, og en
henledning mod nste forsg gives. Den samlede diskussion er at finde i kapitel 6.
Tabel 1: Et overblik over de indgende stoffer i de specifikke DES. DES 4 anvendes frst i forsg 2.

HBA

HBD

DES 1

MTPB

Glycerol

DES 2

ChCl

Benzamid

DES 3

MTPB

Adipinsyre

DES 4

ChCl

Adipinsyre

Tabel 2: Et overblik over de anvendte bakterier.

Grampositiv

Gramnegativ

B. S.

M. C.

E. C.

SER

Bacillus subtilis

Micrococcus luteus

Escherichia coli

Serratia marcescens

Der bruges i dette kapitel nogle forkortelser for at undg for lange navne til de specifikke DESblandinger. Som kan ses i tabel 1 henviser f.eks. DES 1 altid til en blanding mellem MTPB og
glycerol.
Dog syntetiseres der flere DES 1 med forskellige forhold af HBA og HBD forholdene 1:2, 1:3
og 1:4. Mngden af HBA holdes altid fast, mens mngden af HBD ndres. Derfor er
blandingerne altid navngivet efter mngden af HBD. Alts vil f.eks. DES 1 i forholdet 1:3 hedde
DES 1:3.

5.1 DES antibakterielle egenskaber

Dette frste forsg udfres med henblik p at eftervise de resultater og konklusioner angivet i
indledningen. Formlet er at eftervise at visse DES har antibakterielle egenskaber. Samtidigt
undersges, om det specifikt er DES, der virker antibakterielt, eller om det er en (eller flere) af
dens komponenter, som giver virkningen.

20

Forsget udfres ved at syntetisere 3 DES i 3 forskellige molforhold, samtidigt med at HBA og
HBD i de specifikke DES oplses og fortyndes til 3 forskellige koncentrationer. Herefter udfres
agar diffusion assay. Se kapitel 9 for materialer og metoder.
Syntesen af DES 2 og 3 resulterede i vsker med meget hj viskositet ved alle de syntetiserede
forhold. De kom p vskeform ved opvarmning og omrring, men ved stuetemperatur var
vskerne s viskse, at vi vurderede at de ikke kunne arbejdes videre med vi forsgte os endda
med at fortynde dem med demineraliseret vand. Iflge litteraturen har DES2 et smeltepunkt p
92C i molforholdet 1:2 [Zhang et al., 2012]. Derfor har vi ndret p molforholdene for at se om
smeltepunktet falder, og om vi kunne f blandingerne p vskeform ved stuetemperatur - dette
var dog ikke muligt. Smeltepunktet for DES 3 er ikke angivet i litteraturen, da vi selv har udvalgt
kombinationen af HBA og HBD.
P baggrund af disse observationer forsger vi i forsg 2 at syntetisere en ny DES (DES 4), som
er en blanding mellem cholin chlorid som HBA og adipinsyre som HBD. Smeltepunktet i
molforholdet 1:1 br vre 85C [Zhang et al., 2012], hvorfor vi afprver forskellige molforhold.
Syntesen af DES 1 resulterede i oplsninger med brugbar viskositet. Der arbejdes derfor videre
med DES 1, HBA 1 og HBD 1 i de syntetiserede forhold, i dette forsg.

Figur 12: DES 1s (i forholdene 1:2, 1:3 og 1:4), HBA 1s (i stofmngderne 10, 1 og 0.1 mol) og HBD 1s (i stofmngderne 10,
1 og 0.1 mol) hmningszoner mod bakterien B. subtilis.

21

Figur 13: DES 1s (i forholdene 1:2, 1:3 og 1:4), HBA 1s (i stofmngderne 10, 1 og 0.1 mol) og HBD 1s (i stofmngderne 10,
1 og 0.1 mol) hmningszoner mod bakterien M. luteus.

Figur 14: DES 1s (i forholdene 1:2, 1:3 og 1:4), HBA 1s (i stofmngderne 10, 1 og 0.1 mol) og HBD 1s (i stofmngderne 10,
1 og 0.1 mol) hmningszoner mod bakterien E. coli.

Figur 15: DES 1s (i forholdene 1:2, 1:3 og 1:4), HBA 1s (i stofmngderne 10, 1 og 0.1 mol) og HBD 1s (i stofmngderne 10,
1 og 0.1 mol) hmningszoner mod bakterien S. marcescens.

22

DES 1 i alle tre forhold (1:2, 1:3 og 1:4) viser antibakteriel virkning p alle fire bakterier. MTPB
viser ogs antibakteriel virkning p alle fire bakterier dog ikke ved alle koncentrationer. Den
antibakterielle effekt af DES p de grampositive bakterier er lidt kraftigere i forhold til de
gramnegative bakterier og isr M. luteus bliver ramt hrdt. Glycerol viser ingen antibakteriel
virkning p nogle af bakterierne. Disse resultater kan ses i figurerne 12-15.
MTPB har alts antibakteriel virkning i sig selv, og vi vil derfor forsge at teste om effekten af
DES udelukkende afhnger af koncentrationen af MTPB. Dette undersges i forsg 3, hvor
glycerol ikke undersges videre, da den ikke viser antibakteriel virkning.

5.2 DES 4
Dette forsg udfres i forlngelse af forsget i afsnit 5.1, da det kun var muligt at fremstille en
DES, der kunne anvendes til efterflgende forsg.
Forsget udfres ved at syntetisere DES 4 i tre forskellige molforhold. Desvrre viste alle tre
molforhold af DES 4 ogs s hj viskositet, at de ikke kunne arbejdes videre med. Derfor valgte
vi at fokusere udelukkende p DES 1, hvis viskositet er inden for et omfang vi vil vre i stand til
at arbejde videre med.

5.3 DES kontra HBA

Formlet med dette forsg er at undersge om den antibakterielle virkning af DES 1 fundet i
afsnit 5.1 udelukkende skyldes MTPB.
Forsget udfres ved at syntetisere DES 1 i tre molforhold og fortynde HBA 1 til tre forskellige
koncentrationer. Herefter udfres agar diffusion assay, og resultaterne aflses som
hmningszoner. Se kapitel 9 for materialer og metoder.

23

Tabel 3: Stofmngder og sammenhrende hmningszoner af DES 1:2, DES 1:3 og DES 1:4 for alle fire bakterier.

Grampositive
B. subtilis

M. luteus

n(HBA i DES)

Hmning

n(HBA i DES)

Hmning

[mol]

[cm]

[mol]

[cm]

DES 1:2

37.2

1.88

DES 1:2

37.2

3.50

DES 1:3

21.4

1.95

DES 1:3

21.4

3.50

DES 1:4

15.0

1.78

DES 1:4

15.0

3.50

Gramnegative
S. marcescens

E. coli

n(HBA i DES)

Hmning

n(HBA i DES)

Hmning

[mol]

[cm]

[mol]

[cm]

DES 1:2

37.2

0.93

DES 1:2

37.2

2.20

DES 1:3

21.4

1.05

DES 1:3

21.4

2.28

DES 1:4

15.0

1.25

DES 1:4

15.0

2.35

Tabel 4: Stofmngder og sammenhrende hmningszoner af HBA for alle fire bakterier.

Grampositive
B. subtilis

M. luteus

n(HBA) [mol]

Hmning [cm]

n(HBA) [mol]

Hmning [cm]

HBA

10.0

0.75

10.0

2.50

HBA

1.00

1.00

0.83

HBA

0.10

0.10

Gramnegative
S. marcescens

E. coli

n(HBA) [mol]

Hmning [cm]

n(HBA) [mol]

Hmning [cm]

HBA

10.0

10.0

1.13

HBA

1.00

1.00

HBA

0.10

0.10

24

For at se hmningszonerne af DES og HBA mod de fire bakterier, som udregningerne er baseret
p, se bilag A.
Resultaterne viser, som i afsnit 5.1, at DES ved alle stofmngder virker hmmende overfor alle
fire bakterier. Dertil viser resultaterne ogs at der er en tendens til at DES har strre indvirkning
p grampositive bakterier. HBA viser hmning overfor alle bakterier undtagen S. marcescens
den generelle trend er at HBA i disse stofmngder viser sm hmningszoner.
Hmningszonerne for DES og HBA er desvrre ikke direkte sammenlignelige, da
stofmngderne ligger for langt fra hinanden. Vi vlger derfor i afsnit 5.4 at fortynde DES bde
for at f sammenlignelige stofmngder, men ogs for at f et yderligere indblik i hvorledes DES
pvirkes af vand.
Vi vlger efter dette forsg kun at arbejde videre med DES 1:4, da DES 1:2 og 1:3, p trods af
hjere stofmngder, ikke viser strre hmningszoner. DES 1:2 og 1:3 er meget viskse, hvilket
kan vre grunden til de begrnsede hmningszoner.

5.4 Fortyndede DES kontra HBA

Formlet med dette forsg er at fortynde DES 1:4, sledes, at vi fr stofmngder af MTPB i
DES, som matcher de stofmngder vi har af den fortyndede MTPB, og derved kan sammenligne
hmningszonerne. Dette vil vre med til at klargre for os, om DES 1:4 er afhngig af
koncentrationen af MTPB, som sin HBA, eller om DES har en ndret antibakteriel virkning
frem for den frie HBA.
Hvordan DES reagerer i et vandigt milj, vides ikke om det stadig er bundet sammen i DES
komplekset eller om det oplses til en vandig oplsning af de to komponenter. Hvis komplekset
oplses fuldstndigt, br en blanding af DES og en fortynding af MTPB med samme
stofmngde, vise tilnrmelsesvis samme hmningszoner, hvilket er vores hypotese. Dette p
baggrund af at der i vand er mange hydrogenbindinger, som vi formoder vil g ind forstyrre, hvis
ikke bryde, hydrogenbindingerne HBA og HBD imellem. Hvorvidt denne hypotese er rigtig, vil
vi forsge at eftervise i dette forsg.
For at f et indblik i om DES har cidal eller statisk indvirkning mod bakterierne, udfres et
simpelt udstregningsforsg efter de andre resultater er aflst. Dette udfres kun for hjeste og
laveste inhiberende stofmngde af DES 1.4, imod alle fire bakterier.

25

Forsget udfres ved at fremstille DES 1:4 i 8 forskellige stofmngder, baseret p HBAen i DES
1:4. Der laves fremstilles samtidigt 6 oplsninger af HBAen med samme stofmngder som DES
1:4. Herefter udfres agar diffusion assay, og resultaterne aflses som hmningszoner og
afbilledes grafisk se kapitel 9 for materialer og metoder.
Efter resultaterne fra agarpladerne er aflst udfrer vi et udstregingsforsg, hvor der udtages f
kolonier fra hjeste og laveste stofmngde med hmningszoner, af DES 1:4, fra alle fire
bakterier, som overfres til nye agarplader. Disse agarplader inkuberes ved 32C i et dgn,
hvorefter der aflses om der er vkst eller ej.

Hmningszone som funktion af stofmngden af DES 1:4 og

MTPB

1,2

M. luteus DES1:4
1

Hmningszone radius [cm]

M. luteus HBA
0,8

B. subtilis DES1:4
B. subtilis HBA

0,6

E. coli DES1:4
0,4
E. coli HBA
0,2

S. marcescens
DES1:4
S. marcescens HBA

0
0
-0,2

Stofmngde [mol]

Figur 16: Hmningszone af DES 1:4 (MTPB i DES) og HBA, i forskellige stofmngder. Alle DES er indikeret med cirkler ved
mlepunkterne og HBAene er indikeret med trekanter. DES og HBA ved hver bakterie er indikeret ved to forskellige nuancer af
samme farve.

Som det kan ses ud fra figur 16, viser DES 1:4 mindre hmningszoner ved M. luteus og S.
marcescens end de af deres HBA. Ved E. coli og B. subtitlis viser DES derimod strre
hmningszoner, selv meget fortyndede. Dette giver os et tvetydigt svar p vores hypotese,
hvilket var at DES ikke ville opretholde sit kompleks ved tilstningen af meget vand. Det kan
eksempelvis skyldes fejlkilder ved fortyndingen af DES eller HBAen eller noget helt tredje. Vi

26

vlger derfor at foretage et 1H-NMR af vores rene DES kontra DES i oplsningen 0.5M, for at
se om DES opretholder sit kompleks selv meget fortyndet. Dette vil blive undersgt i afsnit 5.6.
Efterflgende udfrte vi et udstregningsforsg, for at f et indblik i om DES havde statisk eller
cidal indvirkning p de fire bakterier se figur 17.

Figur 17: Udstregninger fra hjeste og laveste inhiberende stofmngde mod de fire bakterier fra figur 16.

Ved hver plade er der lavet udstregninger af hjeste og laveste inhiberende stofmngde,
undtagen for S. marcescens da der kun var hmningszone ved hjeste stofmngde. Ved hver
stofmngde kan man se at der str C eller K, hvilket indikerer om prven er taget op ad skiven
ved centrum (C) eller om det er taget tt p synlig bakterievkst ved kanten (K).
Resultaterne viser at, bakterierne der ligger helt op ad filterpapiret, undtagen B. subtilis, drbes
ved hjeste stofmngde af DES (8,5 mol HBA). Samtidigt viser resultaterne at nr der udtages
bakterier lngere vk fra filterpapiret, er bakterierne kun blevet hmmet, da de er i stand til at
gro en ny koloni p en ny agarplade. Dette leder os hen imod den antagelse at DES kun har en

27

statisk indvirkning p de fire bakterier, da det formentlig ved de hjeste stofmngder, er grundet
den hje stofmngde at bakterierne er blevet drbt.

5.5 Antibiotika og DES indvirkninger p henholdsvis gr og 4 bakterier

Formlet med dette forsg er at teste indvirkningen af DES 1:4, HBA, samt to antibiotika mod
eukaryote celler i form af grceller. Dertil testes hmningen af de to antibiotika, Rifampicin og
Tetracyklin, ogs p de fire bakterier, for at have en reference til DES.
Forsget udfres ved at anvende stofmngderne af DES 1:4 og HBA fra afsnit 5.4, og udfre
agar diffusion assay p grceller i stedet for bakterier. Se kapitel 9 for materialer og metoder.

Figur 18: DES 1:4 og HBAs indvirkning p grceller.

28

Figur 19: Tetracyklins og Rifampicins indvirkning mod grceller

Figur 20: Tetracyklins og Rifampicins hmningszoner p alle fire bakterier.

Som kan ses i figur 18 og 19 bliver gr ikke pvirket i nogle af stofmngderne af hverken DES
1:4, HBA eller de to antibiotika. Som forventet har bde Tetracyklin og Rifampicin indvirkning
p alle fire bakterier.

29

Tabel 5: Hmningszoner af henholdsvis Tetracyklin og Rifampicin mod de fire bakterier.

Tetracyklin og Rifampicin
B. subtilis

E. coli

M. luteus

S. marcescens

Hmning i

Hmning i

Hmning i

Hmning i

radius [cm]

radius [cm]

radius [cm]

radius [cm]

Tetracyklin (10 mg/ml)

1.05

1.05

1.45

0.4

Rifampicin (30 mg/ml)

0.75

0.65

1.7

0.55

Antibiotikum

I tabel 5 er angivet massekoncentrationen, hvilket er den massekoncentration vi har tilfrt 10 l

af til skiverne. Vi har derved tilfrt 0.23 mol Tetracyklin og 0.36 mol Rifampicin til skiverne.
Massekoncentrationerne opgivet for de to antibiotika, er stamoplsninger, hvilket betyder at hvis
de reelt skulle anvendes ville de blive fortyndet betydeligt. Dette er dog kun for at f en
tilnrmelsesvis reference til DES, hvilket vil blive diskuteret i kapitel 6.

5.6 DES interaktion med vand

For at kunne se, om DES opretholder sit kompleks i en vandig oplsning, analyseres bde den
rene DES 1:4, samt DES 1:4 fortyndet i vand, i koncentrationen 0.5 M, ved hjlp af 1H-NMR
spektroskopi. Dette forsg udfres da vi i afsnit 5.4 fik resultater, som indikerede at den
fortyndede DES havde strre indvirkning p to ud af de fire bakterier, end den vandige oplsning
af HBAen i samme koncentration. Dette forsg vil vre med til at give os et indblik i, om vores
resultater i afsnit 5.4 skyldes at DES reelt opretholder sit kompleks eller om DES er blevet til en
vandig oplsning af sine to komponenter.

30

Figur 21: 1H-NMR spektret for den rene DES 1:4. 1H-NMR mlingen er udfrt af laboratorieteknikker Britt Clemmensen vha.
apparaturet Bruker NanoBay 400.

Figur 22: 1H-NMR spektret for den fortyndet DES i koncentrationen 0.5M. 1H-NMR mlingen er udfrt af
laboratorieteknikker Britt Clemmensen vha. apparaturet Bruker NanoBay 400.

31

Hvis man sammenligner spektrene fra henholdsvis den rene DES og fortyndede DES, kan man
tydeligt se at DES har ndret sin struktur ved fortynding med vand. Hvis man sammenligner
figur 22 med et 1H-NMR spektrum af ren glycerol (se bilag C), er der kun en differens p hvad
der svarer til 0.07 ppm. Efter konsultation med professor Poul Erik Hansen, har vi net den
konklusion, at DES 1:4 ikke er i stand til at opretholde sin struktur i vandig oplsning.

32

Kapitel 6 Diskussion
Dette kapitel er en samlet diskussion af vores projekt, hvor vi tager udgangspunkt i de indledende
diskussioner, der er givet efter hvert forsg i kapitel 5. Vi vil derefter sammenholde vores data
med forsg fundet i litteraturen, og til sidst ende ud i en besvarelse af vores problemformulering:
I dette projekt undersges Deep Eutectic Solvents antibakterielle egenskaber der bliver herunder lagt vgt
p, om Deep Eutectic Solvents besidder en synergetisk effekt med henblik p de antibakterielle egenskaber.
Dette leder hen imod en undersgelse af, hvorledes Deep Eutectic Solvents reagerer i vandig oplsning. Dertil
undersges indvirkningen p eukaryote celler, hvilket giver baggrund for en afsluttende diskussion af Deep
Eutectic Solvents anvendelsesmuligheder.
DES er et relativt ny forskningsomrde, der blev introduceret som ikke-toksiske ionvsker og er
blevet proklameret at have antibakterielle egenskaber. DES antibakterielle egenskaber er omtalt
i tre forskellige artikler, som vi har taget udgangspunkt i [Hayyan et al., 2012; 2013; 2015]. Denne
egenskab havde de tre artikler sat sig for at undersge, hvilket vi startede med at ville eftervise,
samt at undersge nogle andre kombinationer af DES. Vi endte ud med kun at arbejde videre
med DES1 grundet viskositet.
De antibakterielle egenskaber af en fosfonium-baseret DES (MTPB og glycerol) i molforholdet
1:3, blev undersgt af Hayyan et al. i 2013, hvor de testede den mod fire forskellige bakterier. Af
de fire bakterier som blev anvendt, har vi i dette projekt anvendt to af dem, E. coli og B. subtilis.
Hayyan et al. i 2013 fik kun antibakteriel effekt p en ud af de fire bakterier, Pseudomonas
aeruginosa, hvorimod de ingen inhibering af hverken B. subtilis og E. coli havde. Derimod havde
vi inhibering af begge frnvnte bakterier i alle tre molforhold, som vi anvendte, 1:2, 1:3 og 1:4.
Hvorfor de ingen inhibering havde, kan umiddelbart ikke begrundes, da vi i alle vores forsg,
endda under fortyndede forhold, observerede inhibering. n af grundene kan vre metoden,
hvorved de har tilfrt DES til filterpapirene, samt mngden af tilsat DES. Det kunne ogs
skyldes deres udfrelse af agar diffusion assayet, men da der ikke er en mere detaljeret udfrelse
af deres forsg, kan dette ikke siges med sikkerhed. Det eneste vi kan g ud fra er det faktum, at
vi i alle vores forsg har inhibering af bakterierne.
Neden for ses tabellerne 6 og 7, som angiver hmningszonerne fra Hayyan et al. fra 2013 kontra
vores egne udfrte forsg.

33

Tabel 6: Diameteren af DES hmningszoner fra Hayyan et al. 2013. NI = No inhibition

DES hmningszoner iflge litteraturen

cm

Escherichia coli

NI

Staphylococcus aureus

NI

Pseudomonas aeruginosa

0.7

Bacillus subtilis

NI

Tabel 7: Diameteren af DES hmningszoner fra vores eget forsg. NI = No inhibition

DES hmningszoner iflge vores forsg

cm

Bacillus subtilis

1.95

Micrococcus luteus

3.50

Escherichia coli

1.05

Serratia marcescens

2.28

Vi observerede, at DES har en generel tendens til at have strre indvirkning mod de grampositive
end de gramnegative bakterier. Vi vurderer forskellen til at vre grundet cellevgsstrukturen, da
de gramnegative bakterier har en tendens til at vre mindre flsomme over for antibiotika, eller
i dette tilflde DES. Eksistensen af den ydre cellemembran gr dem mere modstandsdygtige i
modstning til de grampositive bakterier.
I artiklen af Hayyan et al. fra 2013, undersgte de ogs cytotoksiciteten af DES samt af dens
komponenter. Her konkluderede de at DES havde en hjere cytotoksicitet end dens
komponenter. Mden hvorp de har undersgt cytotoksiciteten af DES, HBA og HBD er ved
at, af flere omgange, nedsnke et vist antal saltskrebs i en af de 3 blandinger og derefter se,
hvor lang tid der gik fr rejerne dde. Se tabel 8 for deres resultater.
Tabel 8: Cytotoksiciteten af DES mod saltskrebs [Hayyan et al., 2013].

34

Metoden hvorved de testede DES og dens HBA gjorde, at vi funderede over om forskellen
mellem cytotoksiciteten af DES og dens HBA, kunne skyldes at DES er meget mere visks end
den vandige oplsning af dens HBA samtidigt med at der er mangel p ilt, som Hayyan et al.
ogs selv konkluderer. Derfor undersgte vi, i modstning til Hayyan et al. 2012 og 2013, DES
og HBA indvirkning p grceller.
Grcellerne havde desvrre ikke den nskede vkst, og dermed ss kun et tyndt lag gr p
agarpladerne. Dog viste hverken DES eller HBA hmningszoner, hvilket leder imod at DES
ingen virkning har mod eukaryote grceller. Om DES har virkning p andre eukaryote
celletyper kan ikke konkluderes ud fra dette forsg.
I en artikel af Hayyan et al. fra 2015 testes ammonium-baserede DES p humane krft celler.
Resultaterne viste, at DES delagde plasma membranen p disse celler dette forsg viser, at
DES kan have indvirkning p eukaryote celler. Om DES har indvirkning p eukaryote celler,
afhnger alts af typen af DES og typen af eukaryot celle. Dette forsg leder ogs hen mod, at
det kan vre muligt at anvende ammonium-baserede DES og muligvis ogs andre DES typer
til krftbehandling [Hayyan et al., 2015].
For at f et indblik i, hvilken form for virkning DES 1 ville have mod bakterier, udfrte vi et
udstregningsforsg i afsnit 5.4. Dog oplses DES til komponenterne i fortyndinger, og forsget
giver derfor i strre grad et indblik i MTPBs virkning.
Forsget indikerer, at DES har en statisk indvirkning p de fire bakterier, da alle fire bakterier er
i stand til at vokse igen, efter at have vret udsat for DES i et dgn. For at forsge at minimere
fejlkilderne i forsget, tog vi prver fra bde hjeste og laveste inhiberende stofmngde, samt to
forskellige steder i hmningszonerne. Tt p skiven hvor stoffet kun havde diffunderet en smule
ud, samt helt ude hvor stofmngden af DES var s lille, at den kun lige var i stand til at inhibere
bakterierne. Selvom bakterierne dr ved de hjeste stofmngder, anser vi ikke DES for at vre
cidal mod bakterierne, da det hjest sandsynligt skyldes den hje stofmngde at bakterierne er
blevet drbt.
Vi har ogs undersgt DES antibakterielle effekt i forhold til to allerede kendte antibiotika,
Tetracyklin og Rifampicin. DES ikke er direkte sammenlignelig med Tetracyklin og Rifampicin,
men forsget kan give et indblik i, hvor effektiv DES er, ved at sammenligne hmningszonerne
og stofmngderne af DES med de to andre antibiotika. Disse resultater kan ses i tabel 9.

35

Tabel 9: Sammenligning af hmningszoner og tilsat stofmngde af DES og antibiotika.

B. subtilis

M. luteus

n [mol]

Hmning [cm]

n [mol]

Hmning [cm]

Tetracyklin

0.23

1.05

0.23

1.45

Rifampicin

0.36

0.75

0.36

1.70

DES

3.5

0.05

1.5

0.10

E. coli

S. marcescens

n [mol]

Hmning [cm]

n [mol]

Hmning [cm]

Tetracyklin

0.23

1.05

0.23

0.40

Rifampicin

0.36

0.65

0.36

0.55

DES

3.5

0.10

8.5

0.05

Resultaterne viser, at der skal en meget hjere stofmngde af DES til, for at f tilnrmelsesvis
samme effekt som de to antibiotika. Dette taler imod at anvende den undersgte DES som
antibakterielt middel, men udelukker ikke, at DES kan finde anvendelse inden for andre
medicinske omrder.
Et afgrende punkt i dette projekt er, hvorvidt DES har en synergetisk effekt med hensyn til de
antibakterielle egenskaber.
Vi har i dette projekt undersgt dette ved at sammenholde hmningszonerne for n fosfoniumbaseret DES og dets komponenter. Glycerol som HBD viste allerede tidligt i projektet ingen
inhibering mod bakterierne, hvorfor denne ikke blev undersgt yderligere. Dette er tilfldet, nr
specifikt glycerol anvendes som HBD, men kan p ingen mde antages at vre en generel
tendens for DES. MTPB som HBA viser derimod inhibering mod alle fire anvendte bakterier.
Dette stter sprgsmlstegn ved, om DES har en ndret antibakteriel effekt fra MTPB, eller om
virkningen der ses, blot er virkningen af MTPB.
I afsnit 5.4 fortyndede vi DES 1:4 i vand, for at f nogle sammenlignelige stofmngder med dens
HBA. Vi valgte DES 1:4, da det var det molforhold vi havde undersgt, som gav de strste
hmningszoner.
Resultaterne viste, at hmningszonerne var tilnrmelsesvis de samme for DES og HBA for alle
fire bakterier. DES fortyndet i vand, besad strre indvirkning p bakterierne B. subtilis og E. coli,

36

mens HBA besad strre indvirkning p M. luteus og S. marcescens. Resultaterne stemmer til en vis
grad overens med vores hypotese, om at DES komplekset vil blive brudt til en vandig oplsning
af de indgende komponenter. Forsget er dog kun blevet udfrt en gang, og diverse fejlkilder
har kunnet spille ind. Derfor sger vi, i afsnit 5.6 at eftervise disse resultater ved at undersge
ren DES og DES i oplsning via HNMR.
HNMR spektrene bekrfter vores hypotese om, at DES ikke holder sin struktur ved oplsning i
vand. Dette bekrfter ogs vores antagelse om, at resultaterne fra forsget i 5.4 er pvirket af
fejlkilder, som giver visse afvigelser. For at f et mere prcist resultat, kunne forsget vre blevet
gennemfrt flere gange og vre opgivet i et gennemsnitteligt resultat med usikkerheder. Dette
har monumentale konsekvenser for anvendelsesmulighederne af denne phosphonium-baserede
DES som anti-bakterielt middel. Den vil ikke opn den nskede effekt ved brug i f.eks.
menneskekroppen, da den pga. mngden af vand i kroppen vil oplses til sine komponenter.
Dette ville vre det samme resultat ved andre anvendelsesmuligheder f.eks. i rengringsmidler,
etc. Om dette er tilfldet for alle typer af DES kan diskuteres, men vi vil vurdere at ved tilstning
af nok vand vil det samme ses for alle DES. Dog vil DES kunne oplses i andre
oplsningsmidler, som ikke gr ind og forstyrre hydrogenbindingerne.

Refleksion over arbejdsproces

Dette projekt er et 2. semesterprojekt, hvormed der lgges vgt p samspillet mellem teori,
model, eksperiment og simulering inden for naturvidenskab. Vi har valgt at arbejde ud fra denne
semesterbinding, ved frst at fokusere p teori og p baggrund af dette opstille hypoteser, som
afprves gennem eksperimenter og undersgelser. DES anti-bakterielle egenskaber er ikke
veludforskede, og der har derfor vret begrnset teori at basere vores hypoteser p. Dette har
medfulgt at vi har vret ndsaget til at lave nogle forsg om, og at tiden derfor ikke altid er blevet
udnyttet optimalt.
P baggrund af semesterbindingen og vores egne forhbninger til projektet, havde det ikke vret
tilfredsstillende at besvare problemformuleringen udelukkende baseret p et litteraturstudie. Det
har ogs medfrt at vi har udfrt nogle specifikke forsg, som ikke tidligere er blevet udfrt p
DES f.eks. forsget, hvor vi undersger om DES virker statisk eller cidalt, samt 1H-NMR af
DES. Der var alts meget, der talte for at opbygge vores projekt p denne mde. Dog kunne
vores arbejdsmetode i projektet godt have vret optimeret ved f.eks. at basere vores indledende
forsg i endnu strre grad p forsgene fra litteraturen, s de ville vre mere sammenlignelige.

37

Kapitel 7 Konklusion
Vi kan ud fra resultaterne konkludere, at den fosfonium-baserede DES anvendt i dette projekt
besidder antibakterielle egenskaber, og vi kan dertil vurdere at den virker statisk og ikke cidalt.
Resultaterne viste ogs, at DES har en generel tendens til at have strre indvirkning p
grampositive bakterier. DES har ingen indvirkning p eukaryote gr celler, men da vi ikke har
testet den p andre eukaryote celler, kan vi ikke konkludere om DES har en indvirkning p
eukaryote celler generelt. Sammenlignet med de to antibiotika, Tetracyclin og Rifampicin, har
DES en markant ringere antibakteriel effekt mod de anvendte bakterier.
Ud fra forsg med agar diffusion assay, samt 1H-NMR, ses at DES ikke er i stand til at opretholde
sin struktur i vandig oplsning. Vi vurderer p baggrund af dette, at den fosfonium-baserede
DES alene ikke kan anvendes, som antibakterielt remedie til indvortes brug, da der hjest
sandsynligt vil ske en spaltning af komplekset.

38

Kapitel 8 Perspektivering
Vi har i dette projekt undersgt de antibakterielle egenskaber af en fosfonium-baseret DES. Vi
har ogs undersgt hvordan DES reagerede i vandig oplsning, og mtte konkludere at den
fosfonium-baserede DES ikke var i stand til at opretholde sit kompleks. Dette ledte os hen imod
den vurdering, at den anvendte fosfonium-baserede DES, ikke er optimal at anvende som
antibakterielt remedie, i ren form. I artiklen af Hayyan et al. fra 2015 har de testet nogle
ammonium-baserede DES p mus, og observerede en ndring i musenes levertal, som de mener
tyder p, at indtagelsen af denne type DES i ren form, kan medfre leverskade.
De har ogs beskrevet DES synergetiske effekt, og gennem et LD50 forsg, kom de frem til at
DES besidder en synergetisk effekt, da LD50 af DES var lavere end den af DES indgende
komponenter.
Selvom vi p baggrund af vores resultater vurderer - at anvendelsen af DES som antibakterielt
remedie ikke er muligt med DES i ren form - er der blevet foretaget forsg af Kumar & Malhotra
i 2009, p nogle fosfonium-baserede ionvsker. Disse fosfonium-baserede ionvsker viser
potentiale som krftbekmpende, derudover observerede de en ndring af potentialet til det
bedre, ved at forlnge alkylkden af fosfonium saltet. De opstiller ogs en form for hypotese,
baseret p deres resultater, hvor de antyder at en ndring i saltets anion, har strk indflydelse
p den cytotoksiske effekt, hvorimod en ndring af kationen, har indflydelse p den cytostatiske
effekt.
Dette er interessante observationer, som har gjort at vi har reflekteret over, om en ndring af
vores HBA, enten i form af udskiftningen af anionen eller kationen, eller mske hele molekylet,
ville kunne fre til strre hmningszoner p bakterierne. Denne undersgelse var dog foretaget
p ionvsker, og ikke p et DES kompleks, og vi kan derfor ikke begrunde om det er muligt.
Det kunne vre interessant at undersge, om det var muligt at danne et DES kompleks af nogle
af de fosfonium salte, som er blevet anvendt og er blevet erklret at besidde krftbekmpende
egenskaber af Kumar & Malhotra i 2009.

39

Kapitel 9 Materialer og metoder

Fremstilling af LB medie
LB medium (pr. liter) fremstilles ved at tilstte 10 g bacto-tryptone, 5 g bacto-yeast ekstrakt og
10 g NaCl til en 1 L kolbe og fylde op med demineraliseret vand til 1 L. Blandingen pH indstilles
med 5 M NaOH til pH 7,2, hvorefter den autoklaveres. Blandingen nedkles, hvorefter der
overfres 5 ml til hvert reagensglas. LB rrene er herefter klar til anvendelse [Skovgaard et al.,
2001].

Fremstilling af agarplader
LB medium (pr. liter) fremstilles ved at tilstte 10 g bacto-tryptone, 5 g bacto-yeast ekstrakt og
10 g NaCl til en 1 L kolbe og fylde op med demineraliseret vand til 1 L. Herefter tilsttes 20 g
agar og vsken autoklaveres. Efter autoklavering nedkles vsken, og fordeles mellem ca. 80
petriskle (ca. 25 ml pr. petriskl) i sterilt milj. Vsken strkner i mindst et dgn, og
agarpladerne er dermed klar til brug [Skovgaard et al., 2001].

Agar diffusion assay

Af hver af de 4 bakterier udtages f kolonier, som overfres til hvert sit LB rr i sterilt milj.
Kulturerne inkuberes ved 37C natten over, hvorefter de er klar til brug.
10 l DES/HBA/HBD udtages og overfres til et 6mm filterpapir. Mngden af filterpapir med
hver af de forskellige blandingstyper er forudbestemt. Der laves dobbelt/triplet bestemmelser p
alle blandinger. Filterpapirene lgges til trre i varmeskab ved 37C i en time, hvorefter de er
klar til brug.
50 l frisk overnatskultur overfres til en agarplade og udsmrres over hele pladen med en
Drigalski spatel under aspeptiske forhold. Dette udfres for alle fire bakterier p den mngde
agarplader som er forudbestemt.
Efter bakterierne er udsmurt sttes filtepapirerne p. Der sttes 6 filterpapir p hver plade,
hvilket gr at der p n plade findes tre forskellige molforhold eller koncentrationer, da der laves
dobbeltbestemmelser p alle.
Pladerne inkuberes ved 32C i et dgn, hvorefter resultaterne aflses [Skovgaard et al., 2001].

40

Synteser
Syntesen af DES udfres p samme mde i alle forsg.
Syntesen af DES foregr ved at afveje HBA og HBD (se tabel 10-13 for de specifikke stoffer) i et
reagensglas i molforholdet angivet i tabel 10-13 og opvarme i oliebad ved 80-90C i ca. 30
minutter.
Tabel 10: Afvejede mngder af HBA og HBD til syntese 1.

Syntese 1
Stof

DES 1

Molforhold

1:2

1:3

m(HBA) [g]

0.353

0.353

m(HBD) [g]

0.182

0.276

DES 2
1:4

1:2

1:4

1:2

1:2

1:4

0.360 0.148 0.152

0.138

0.367

0.355

0.355

0.400 0.220 0.368

0.470

0.315

0.443

0.600

Tabel 11: Afvejede mngder af HBA og HBD til syntese 2.

Syntese 2
Stof

DES 4

Molforhold

1:2

1:3

1:4

m(HBA) [g]

0.143

0.140

0.148

m(HBD) [g]

0.291

0.436

0.570

Tabel 12: Afvejede mngder af HBA og HBD til syntese 3.

Syntese 3
Stof

DES 1

Molforhold

1:2

1:3

1:4

m(MTPB) [g]

0.355

0.355

0.358

m(Glycerol) [g]

0.186

0.272

0.380

41

1:3

DES 3

Tabel 13: Afvejede mngder af HBA og HBD til syntese 4, samt aflsning af DES volumener.

Syntese 4
Stof

DES 1

Molforhold

1:3

1:4

m(MTPB) [g]

1.07

1.07

m(Glycerol) [g]

0.86

1.14

Samlet V [ml]

1.40

2.00

Fortyndinger
Forsg 1
Syntesen af HBA og HBD foregr ved at afveje HBA eller HBD (i mngden angivet i tabel 14)
i et reagensglas og fylde op til 2 ml med demineraliseret vand. Fra denne oplsning udtages 1
ml, som overfres til et nyt reagensglas, hvorefter der fyldes op med demineraliseret vand til 10
ml. Der udtages 1 ml fra denne og processen gentages.
Tabel 14: Afvejede mngder og stofmngder af HBA og HBD til syntese 1.

Syntese 1
HBA1
n [mol]

10

m(HBA) [g]
n [mol]
m(HBA) [g]

10

1.0

HBA 2
0.1

10

1.0

0.712

0.275

HBD 1

HBD 2

0.1

10

0.215

1
0.245

0.1

HBD 3
0.1

10

0.1

0.31

Forsg 3
Syntesen af HBA foregr ved at afveje HBA (i mngden angivet i tabel 15) i et reagensglas og
fylde op til 2 ml med demineraliseret vand. Fra denne oplsning udtages 1 ml, som overfres
til et nyt reagensglas, hvorefter der fyldes op med demineraliseret vand til 10 ml. Der udtages 1
ml fra denne og processen gentages.

42

Tabel 15: Afvejede mngder og stofmngder af HBA til syntese 3.

Syntese 3
HBA 1
n [mol]

10

m(MTPB) [g]

1.0

0.1

0.722

Forsg 4
Der laves 8 fortyndinger af henholdsvis DES 1:4 og HBA. Fortyndingerne af DES 1:4 laves ved
at udtage 250 l og tilstter volumen demineraliseret vand angivet i tabel 16, hvorefter 8
fortyndinger er opnet. Stofmngden af HBA i hver fortynding kan aflses i tabel 16.
Tabel 16: Stofmngderne af den fortyndede DES 1.4, samt stofmngderne af HBA.

Syntese 4
DES 1:4

HBA

Volumen

Vand tilsat

Koncentrationer

Stofmngder af

Stofmngder af

(DES)

DES

af HBA i DES

HBA i DES tilsat

HBA tilsat skiverne

skiverne
[l]

[l]

[M]

[mol]

[mol]

250

1951

0.85

8.5

8.5

250

303.6

0.7

7.0

7.0

250

350.0

0.5

5.0

5.0

250

357.1

0.35

3.5

3.5

250

583.3

0.15

1.5

1.5

250

468.8

0.08

0.8

0.8

250

400.0

0.05

0.5

0.5

250

625.0

0.02

0.2

0.2

43

Litteraturliste
-

Abbott, A., Capper, G., Davies, D., Rashees, R., Tambyrajah, V., 2002. Novel solvent
properties of choline chloride/urea mixtures. Chem. Comm., 70-71.

Biology Magnetic Resonance Data Bank Glycerol NMR; University of Wisconsin

http://bmrb.wisc.edu/metabolomics/standards/glycerol/nmr/bmse000184/spectra_p
ng/1H/01.png (28. maj, 2016).

Campbell, N., Reece, J., Mitchell, L., Taylor, M., 2003. Biology concepts and
connections. Pearson Education, 0-781.

Campbell, N., Reece, J., Mitchell, L., Taylor, M., 2014. Campbell Biology tenth
edition. Pearson Education, 0-781.

Chopra, I., Roberts, M., 2001. Tetracycline Antibiotics: Mode of Action,

Applications, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistance. Mic. And
Mol. Biology rev., 232-260.

Hayyan, M., Hashim, M., Al-Saadi, M., Hayyan, A., AlNashef, I., Mirghani, M.,
2012. Assessment of cytotoxicity and toxicity for phosphonium-based deep eutectic
solvents. Chemosphere, 455-459.

Hayyan, M., Hashim, M., Hayyan, A., Al-Saadi, M., AlNeshef, I., Mirghani, M.,
Saheed, O., 2013. Are deep eutectic solvents benign or toxic? Chemosphere, 21932195.

Hayyan, M., Looi, C., Hayyan, A., Wong, W., Hashim, M., 2015. In Vitro and In Vivo
Toxicity Profiling of Ammonium-Based Deep Eutectic Solvents. PLOS ONE, 1-18.

Jakoben, H., 2013. Combating Antibiotic Resistance: Identification of Compounds

Targeting Bacterial Virulence and Host Innate Immunity. 0-81.

Kumar, V., Malhotra, S., 2009. Study on the potential anti-cancer activity of
phosphonium and ammonium-baes ionic liquids. Bio. & Med. Chem. Letters, 46434646.

Lambert, T., 2012. Antibiotics that affect the ribosome. Rev. sci. tech., 57-64.

Nielsen, C., Yasen, F., Christensen, H., Jensen, K., Rasmussen, M., Ravichandran, P.,
Bisgaard, S., 2015. Anvendelse af Deep Eutectic Solvents i Dye-sensitized Solar
Cells. 1-61.

44

PubChem Compound Database Rifampicin; CID=5381226. National Center for

Biotechnology Information, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5381226
(25. maj, 2016).

PubChem Compound Database Benzamid; CID=2331. National Center for

Biotechnology Information, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/2331 (25.
maj, 2016).

PubChem Compound Database Glycerol; CID=753. National Center for

Biotechnology Information, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/753 (25.
maj, 2016).

Siborova, M., 2014. Separace PCR produktu kapalinovou chromatografii. 1-58.

Skovgaard, O., Atlung, T., Rasmussen, L., 2001. Course manual for the genetechnology part of: Advanced Experimental Course in Molecular Biology. 1-169.

Thougaard, H., Varlund, V., Madsen, R., 2011. Mikrobiologi, Nyt Teknisk Forlag. 0372.

Walsh, C., 2013. Antibiotics Actions, origins, resistance. ASM Press, 0-335.

Zhang, Q., Vigier, K., Royer, S., Jerome, F., 2012. Deep eutectic solvents: syntheses,
properties and applications. Chem. Soc. Rev., 7108-7146.

45

Bilag A

Figur 23: Hmningszoner for DES og HBA p bakterien S. marcescens.

Figur 24: Hmningszoner for DES og HBA p bakterien M. luteus.

46

Figur 25: Hmningszoner for DES og HBA p bakterien E. coli.

Figur 26: Hmningszoner for DES og HBA p bakterien B. subtilis..

47

Bilag B
Tabel 17: Stofmngden af DES med tilhrende hmningszoner, af alle fire bakterier, i forholdet 1:4. Hmningszonen er mlt
fra kanten af skiven ud til synlig vkst af bakterierne.

DES 1:4
B. subtilis

E. coli

M. luteus

S. marcescens

n(HBA i

Hmning i

Hmning i

Hmning i

Hmning i

DES) [mol]

radius [cm]

radius [cm]

radius [cm]

radius [cm]

8.50

0.63

0.53

1.10

0.05

7.0

0.27

0.30

0.80

5.0

0.13

0.17

0.63

3.50

0.05

0.10

0.27

1.50

0.10

0.80

0.50

0.20

Tabel 18: Stofmngden af HBA med tilhrende hmningszoner, af alle fire bakterier. Hmningszonen er mlt fra kanten af
skiven ud til synlig vkst af bakterierne.

HBA
B. subtilis

E. coli

M. luteus

S. marcescens

n(HBA i

Hmning i

Hmning i

Hmning i

Hmning i

DES) [mol]

radius [cm]

radius [cm]

radius [cm]

radius [cm]

8.50

0.15

0.18

1.10

0.20

7.00

0.13

0.15

1.00

5.00

0.08

0.10

0.65

3.50

0.05

0.05

0.40

1.50

0.20

0.80

0.05

0.50

0.20

48

Bilag C

Figur 27: 1H-NMR spektrum af glycerol [BMR Data Bank, web].

49