BAB III

METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang bertujuan untuk
mengetahui efek gastroprotektor pada ekstrak etanol herba pegagan. Metode
penelitian ini menggunakan metode kimia dengan induksi etanol 40% secara
per oral. Besarnya efek gastroprotektor dilihat dari pengamatan luar dan
histopatologi pada lambung mencit.
Penelitian ini meliputi tiga tahap, tahap pertama adalah persiapan
seluruh alat, bahan, dan sampel. Tahap kedua adalah pelaksanaan, kelompok A
sebagai kontrol negatif, B untuk kontrol positif, kelompok C, D, dan E sebagai
ekstrak etanol herba pegagan namun dengan dosis yang berbeda yaitu 300
mg/kg BB, 400 mg/kg BB dan 500 mg/kg BB. Tahap ketiga adalah
pengumpulan data, analisis data, serta penarikan kesimpulan terhadap
histologis lambung mencit.
B. Waktu dan Lokasi Penelitian
Tempat yang akan digunakan dalam penelitian ini yaitu laboratorium
farmakologi Stikes Madani Yogyakarta. Penelitian dilakukan pada Bulan
Februari 2016 sampai dengan Bulan April 2016.
C. Populasi dan Sampel
Penelitian ini menggunakan hewan uji mencit jantan galur DDY yang berumur
3 bulan. Perkiraan besar sampel yang akan digunakan adalah 25 ekor mencit
jantan yang akan dibagi menjadi 5 kelompok. Setiap kelompok terdiri dari 5
mencit jantan galur DDY.
D. Variabel dan Definisi Operasional
Variabel adalah objek penelitian, atau apa yang menjadi titik perhatian
suatu penelitian. Klasifikasi variabel dalam penelitian ini sebagai berikut :
24

25

1. Variabel Bebas
Variabel bebas merupakan himpunan sejumlah gejala yang memiliki unsur
yang berfungsi mempengaruhi munculnya variabel yang lain (variabel
terikat). Variabel ini tidak dipengaruhi oleh ada atau tidaknya variabel yang
lain (Sugiono, 2007). Adapun variabel bebas dalam penelitian ini adalah
ekstrak etanol herba pegagan.
2. Variabel Terikat
Variabel terikat merupakan himpunan sejumlah unsur yang berfungsi
menyesuaikan diri dengan variabel yang lain (variabel bebas) (Sugiono,
2007). Variabel terikat dalam penelitian ini adalah efek gastroprotektor yang
diperoleh dengan cara pengamatan langsung dan dari histopatologi lambung
mencit.
Definisi operasional merupakan proses mengubah kata yang digunakan
dalam definisi nominal. Definisi operasional bisa berupa penjelasan dari sisi
makna atau mengungkapkan skala pengukuran untuk masing masing variabel
(Muslihin, 2013). Definisi operasional dalam penelitian ini sebagai berikut:
a. Uji aktivitas gasroprotektor adalah uji aktivitas dimana dilakukan pengujian
terhadap

suatu

ekstrak

yang

memungkinkan

dapat

memberikan

perlindungan lambung dari zat yang dapat merusak lambung.

b. Ekstrak etanol herba Pegagan (Centella asiatica) adalah ekstrak yang
didapat dari hasil penyarian dengan cara maserasi selama 2 hari dengan
menggunakan pelarut Etanol 96%. Hasil yang diperoleh dipekatkan diatas
waterbath sampai pekat dan tidak tercium bau etanol. Kemudian hasil
pemekatan dihitung randemen dan dibagi dalam berbagai dosis.
c. Induksi akohol merupakan rangsangan alkohol yang diberikan kepada
hewan uji secara per oral yang bertujuan untuk membuat luka pada mukosa
lambung.

26

d. Mencit merupakan hewan uji percobaan yang berukuran kecil, cepat

berkembang biak, masa kehamilan singkat, mudah dipelihara dalam jumlah
banyak, ukuran tubuh relatif kecil dibandingkan dengan hewan uji lain, ciri
anatomi dan fisiologi yang mudah dikenali, serta harganya yang relatif
murah.
E. Instrumen Penelitian
Instrumen penelitian adalah alat dan bahan yang digunakan untuk
pengumpulan data. Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini
adalah sebagai berikut :
1. Alat yang akan digunakan untuk pembuatan ekstrak etanol herba pegagan
dan suspensi Omeprazole adalah blender, pisau, toples kaca, kain tipis, gelas
beker, labu ukur, batang pengaduk, dan pengangas air.
2. Alat yang akan digunakan untuk uji gastroprotektor adalah spuit injeksi 1
ml, kandang mencit, pinset, gunting bedah, sarung tangan dan masker.
3. Bahan yang akan digunakan dalam uji aktifitas gastroprotektor adalah herba
Pegagan ( Centella asiatica), aquadest, Omeprazole kapsul, alkohol 40 %,
CMC Na 0.5%, dan mencit (mus musculus) jantan galur DDY.
F. Etika Penelitian
Kode etika penelitian adalah acuan moral bagi peneliti dalam
melaksanakan proses penelitian untuk pengembangan ilmu pengetahuan dan
teknologi. Etika penelitian ini juga dapat dikatakan sebagai suatu sikap dan
acuan yang harus dijunjung tinggi dalam melakukan suatu penelitian agar
penelitian dapat berjalan dengan lancar. Etika penelitian dalam penelitian ini
adalah,
1.

Adaptasi hewan uji

27

Mencit diadaptasikan selama 7 hari. Hal ini dilakukan agar mencit dapat
beradaptasi dengan lingkungan baru. Ruangan yang digunakan untuk
percobaan hendaknya memenuhi persyaratan suhu, kelembaban, cahaya
dan kebisingan yang sesuai dengan kebutuhan hidup hewan uji, yaitu suhu
ruangan diatur menjadi 22 C 3 C, dengan kelembaban relatif 30-70%,
dan penerangan 12 jam terang 12 jam gelap. Ruangan harus selalu dijaga
kebersihannya. Hewan diberi pakan yang sesuai standar laboratorium dan
diberikan tanpa batas (ad libitum). Hewan dipelihara dalam kandang yang
terbuat dari material yang kedap air, kuat dan mudah dibersihkan, ruang
pemeliharaan bebas dari kebisingan.
2.

Cara memegang hewan uji

Ujung ekor mencit diangkat dengan tangan kanan, diletakkan pada suatu
tempat yang permukaannya tidak licin (misal ram kawat pada penutup
kandang), sehingga ketika ditarik, mencit akan mencengkram. Kulit
tengkuk dijepit dengan telunjuk dan ibu jari tangan kiri, ekornya tetap
dipegang dengan tangan kanan. Posisi tubuh mencit dibalikkan, sehingga
permukaan perut menghadap kita dan ekor dijepitkan antara jari manis dan

3.

kelingking tangan kiri.

Cara menyuntik uji
Pada Penelitian ini rute yang akan digunakan untuk menyuntik mencit
yaitu rute peroral. Pemberian obat peroral adalah memberikan obat yang
dimasukkan melalui mulut. Pemberian obat dalam bentuk suspensi, larutan
atau emulsi pada mencit dilakukan dengan menggunakan jarum suntik
yang berujung tumpul (bentuk bola/ kanula). Kanula dimasukkan ke dalam

28

mulut kemudian perlahan lahan dimasukkan melalui tepi langit langit

4.

ke belakang sampai esofagus.

Cara mengorbankan hewan uji
Dalam penelitian ini pengorbanan mencit dilakukan dengan menggunakan
Kloroform dalam wadah khusus. Kloroform dimasukkan pada dasar
desikator, kemudian mencit dimasukkan ke dalam wadah tertutup. Apabila
mencit telah kehilangan kesadaran maka dapat dilakukan pembedahan.

29

5.

Cara membedah hewan uji

Siapkan pot dan formalin sebagai tempat menyimpan lambung mencit.
Kemudian posisikan tubuh mencit pada papan bedah menggunakan pinset.
Bedah mulai dari uterus menggunakan gunting bengkok. Ambil dan
pisahkan lambung mencit dan bersihkan dengan NaCl 0,9% secara
berulang. Kemudian lambung mencit dimasukkan pot yang bersikan

formalin. Mencit yang telah dibedah dapat digunakan untuk histopatologi.

G. Prosedur Kerja
1.

Penyiapan Bahan Uji

Ekstrak herba Pegagan dibuat dengan cara herba pegagan diblender terlebih
dahulu hingga menjadi serbuk kasar. Kemudian serbuk kasar dimaserasi
dengan menggunakan pelarut etanol 96% selama dua hari. Setelah
dimaserasi dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring
hingga diperoleh filtrat. Kemudian filtrat tersebut di uapkan di atas
pengangas air pada suhu 90o C hingga mengental. Filtrat yang sudah
mengental dihitung randemennya dan disimpan dalam flakon.

30

Skema pembuatan ekstrak etanol herba Pegagan dapat dilihat pada gambar
3.1.
Herba pegagan

Di blender ad serbuk

Maserasi dengan etanol 96%

2 Hari
Saring dengan kertas saring

Gambar 3.1. Skema Pembuatan Ekstrak Etanol Herba Pegagan

2. Penentuan Dosis
a. Herba Pegagan
Uapkan pada suhu 90o C ad mengental
1) Dosis 300 mg
Dosis ekstrak etanol herba Pegagan (Centella asiatica) yang
Hitung Randemen

digunakan pada penelitian ini yaitu 300 mg/Kg BB mencit. Jika

Simpan dalam flakon

diubah menjadi 20 gram berat badan mencit maka dosisnya menjadi

6mg/20g BB mencit. Volume penyuntikan per oral 20 gram berat
badan mencit menurut pustaka standar adalah sebesar 0.5 1.0 ml
(Harmita dan Radji, 2008). Namun dalam penelitian ini volume yang
akan digunakan untuk menyuntik mencit secara peroral yaitu 0.5 ml
yang mengandung 6 mg herba Pegagan. Sehingga untuk membuat
larutan stok ektrak etanol herba Pegagan yaitu :
6 mg
0.5 ml x 25 ml = 300 mg
Hasil yang diperoleh untuk membuat larutan stok dalam 25 ml yaitu :
300 mg = 0.3 gram.
2) Dosis 400 mg
Dosis ekstrak etanol herba Pegagan (Centella asiatica) yang
digunakan pada penelitian ini yaitu 400 mg/Kg BB mencit. Jika
diubah menjadi 20 gram BB mencit maka dosisnya menjadi 8 mg/20 g

31

BB mencit. Volume penyuntikan per oral 20 gram berat badan mencit

menurut pustaka standar adalah sebesar 0.5 1.0 ml (Harmita dan
Radji, 2008). Namun dalam penelitian ini volume yang akan
digunakan untuk menyuntik mencit secara peroral yaitu 0.5 ml yang
mengandung 8 mg herba Pegagan. Sehingga untuk membuat larutan
stok ektrak etanol herba Pegagan yaitu :
8 mg
0.5 ml

x 25 ml = 400 mg

Hasil yang diperoleh untuk membuat larutan stok dalam 25 ml yaitu :

400 mg = 0.4 gram.
3) Dosis 500 mg
Dosis ekstrak etanol herba Pegagan (Centella asiatica) yang
digunakan pada penelitian ini yaitu 400 mg/Kg BB mencit. Jika
diubah menjadi 20 gram berat badan mencit maka dosisnya menjadi
10 mg/20g BB mencit. Volume penyuntikan per oral 20 gram berat
badan mencit menurut pustaka standar adalah sebesar 0.5 1.0 ml
(Harmita dan Radji, 2008). Namun dalam penelitian ini volume yang
akan digunakan untuk menyuntik mencit secara peroral yaitu 0.5 ml
yang mengandung 10 mg herba Pegagan. Sehingga untuk membuat
larutan stok ektrak etanol herba Pegagan yaitu :
10 mg
0.5 ml

x 25 ml = 500 mg

Hasil yang diperoleh untuk membuat larutan stok dalam 25 ml yaitu :

500 mg = 0.5 gram.

32

b. Pembuatan etanol 40%

Menurut Rohman (2007) pengenceran etanol 40 % menggunakan rumus :
V1 x N1 = V2 x N2
keterangan :
V1 : banyaknya larutan murni yang kita ambil
N1 : konsentrasi larutan yang akan kita encerkan
V2 : banyaknya larutan yang akan kita buat dengan pengenceran
N2 : konsentrasi larutan yang akan kita buat
Jika diketahui bahwa kadar Etanol Absolut = 96 % (N1)
Maka perhitungan pembuatan larutan Etanol 40 % (N2)
sebanyak 250ml (V2) adalah sebagai berikut :
V1 x N1 = V2 x N2
V1 = 40% x 250 ml : 96 %
V1 = 104,167
Jadi V1 = 104,167 ml.
Pembuatan etanol 40% yaitu dengan memasukkan etanol 96% sebanyak
104,167ml. Tambahkan aquades hingga batas mencapai 250 ml. Tutup
labu ukur, kemudian dikocok perlahan lahan.
Skema pembuatan etanol 40% dapat dilihat pada gambar 3.2.
Masukkan Etanol 96% sebanyak 104,167 ml ke dalam labu Ukur 250 ml

Gambar 3.2. Skema Pembuatan Etanol 40%

c. Pembuatan Tambahkan
CMC Na 0.5%
Aquadest sampai batas 250 ml
Ditimbang sebanyak 0,5 gram CMC Na dan dilarutkan ke dalam aquades
Kocok
perlahan
- lahanaquades ini supaya CMC Na
panas sampai 100 ml.
Tujuan
pemanasan

mudah larut dan tercampur.

Skema pembuatan larutan CMC Na 0.5% dapat dilihat pada gambar 3.3.
Timbang 0,5 gram CMC Na

Larutkan kedalam aquadest yang sudah dipanaskan sampai 100 ml

Gambar 3.3. Skema Kerja Pembuatan Larutan CMC Na 0,5 %

d. Pembuatan larutan Omeprazole

Dosis lazim Omeprazole pada manusia dewasa 20 - 40 mg (Ikatan
selesai

Apoteker Indonesia, 2012). Dosis Omeprazole yang akan digunakan pada

penelitian ini adalah 40 mg. Faktor konversi manusia dengan asumsi

33

berat badan 70 kg manusia ke 20 gram berat badan mencit adalah 0,0026

(Harmita dan Radji, 2008). Sehingga dosis Omeprazole untuk mencit 20
gram = 40 x 0,0026
= 0,104 mg/20 g BB
= 5,2 mg/kg BB
Volume penyuntikkan secara per oral untuk 20 gram berat badan mencit
menurut pustaka standar adalah 0.5 - 1,0 ml (Harmita dan Radji, 2008).
Namun dalam penelitian ini volume yang akan digunakan untuk
menyuntik mencit secara peroral yaitu 0.5 ml yang mengandung 0,104
mg Omeprazole kapsul. Sehingga untuk membuat larutan stok
Omeprazole kapsul yaitu, = 0,104 mg/0,5 ml
= 5,2 mg/25 ml
Serbuk Omeprazole ditimbang sebanyak 5,2 mg, disuspensikan ke dalam
CMC Na 0,5% sampai 25 ml. lalu di ambil 0,5 ml yang mengandung
0,104 mg Omeprazole, apabila bobot mencit 20 gram, penyesuaian dosis
dilakukan apabila bobot mencit lebih dari 20 gram. Skema pembuatan
Suspensi Omeprazole untuk mencit 20 gram dapat dilihat pada gambar
3.4.
Timbang 5,2 mg serbuk Omeprazole kapsul

Suspensikan ke dalam CMC Na 0,5% sampai 100 ml

Gambar 3.4. Skema Pembuatan Larutan Omeprazole

Diambil Hewan
0,5 ml yang
3. Penyiapan
Uji mengandung 0,104 mg Omeprazole

Hewan uji sebanyak 25 ekor diadaptasikan di laboratorium supaya bisa

menyesuaikan dengan lingkungan yang baru selama 7 hari sebelum

34

memulai penelitian. Hewan uji diberi perlakuan yang sama baik dari
kandangnya, suhunya, serta makanan dan minumannya dari awal sebelum
melakukan pengujian hingga selesai. Hewan uji tidak dipuasakan seperti
penelitian yang lain karena metode yang akan digunakan adalah metode
proteksi mukosa lambung setelah diinduksi etanol 40%.
4. Uji Gastroprotektor
Disiapkan sebanyak 25 mencit jantan yang telah di adaptasi pada
kondisi yang sama dalam waktu 1 minggu di dalam kandang pada ruangan
bersuhu kamar. Mencit diberi makan pelet dan minum berupa aquadest ad
libitum (selalu tersedia). Sebanyak 25 ekor mencit jantan diambil secara
acak agar mendapat 5 perlakuan berbeda dimana masing-masing kelompok
perlakuan terdiri dari 5 ekor. Pengelompokan hewan uji dilakukan sebagai
berikut :
a. Kelompok A (Kontrol Negatif)
Kelompok kontrol negatif hanya menggunakan CMC Na dengan
pemberian konsentrasi 0,5% untuk masing-masing hewan uji disuntikkan
sebanyak 0,5 ml/20 gram BB mencit.
b. Kelompok B (Kontrol Positif)
Kelompok B menggunakan Omeprazole dengan kadar pemberian
sebanyak 5,2 mg/kg BB untuk masing-masing hewan uji. Omeprazole
disuntikkan sebanyak 0,5 ml/20 gram BB mencit dan dilakukan
penyesuaian dosis jika berat badan mencit lebih dari 20 gram.
c. Kelompok C.
Kelompok C menggunakan Ekstrak etanol herba pegagan dengan dosis
pemberian 300 mg/Kg BB untuk masing-masing hewan uji. Ekstrak

35

herba pegagan disuntikkan sebanyak 0,5 ml/20 gram BB mencitdan

dilakukan penyesuaian dosis jika berat badan mencit lebih dari 20 gram.
d. Kelompok D
Kelompok D menggunakan Ekstrak etanol herba pegagan dengan dosis
pemberian 400 mg/Kg BB untuk masing-masing hewan uji. Ekstrak
herba pegagan disuntikkan sebanyak 0,5 ml/20 gram BB mencit dan
dilakukan penyesuaian dosis jika berat badan mencit lebih dari 20 gram.
e. Kelompok E
Kelompok E menggunakan Ekstrak etanol herba pegagan dengan dosis
pemberian 500 mg/Kg BB untuk masing-masing hewan uji. Ekstrak
herba pegagan disuntikkan sebanyak 0,5 ml/20 gram BB mencit dan
dilakukan penyesuaian dosis jika berat badan mencit lebih dari 20 gram.
Setelah 60 menit kemudian, seluruh mencit diberikan suntikkan
larutan etanol 40% sebanyak 0,5 ml secara peroral. Perlakuan ini
dilakukan selama 7 hari secara berturut - turut untuk melihat efek
gastroprotektor pada lambung mencit.
6.

Pengamatan Luar
Pada hari ke-7 kelompok mencit A, B, C, D, dan E dibunuh dengan cara
dibius total (tidak ada gerakan dan reflek kornea) dengan menggunakan eter
yang dihirup. Lambung dari masing-masing kelompok mencit diambil
dengan cara dibedah. Lambung dibersihkan dengan NaCl kemudian

7.

Kerusakan lambung pada setiap kelompok di amati dan di dokumentasikan.

Histopatologi
Pada hari ke-7 kelompok mencit A, B, C, D, dan E dibunuh dengan cara
dibius total (tidak ada gerakan dan reflek kornea) dengan menggunakan eter

36

yang dihirup. Lambung dari masing-masing kelompok mencit diambil

dengan cara dibedah. Lambung dibersihkan dengan NaCl kemudian
disimpan dalam pot yang berisi cairan formalin. Dilanjutkan dengan
pembuatan preparat histopatologik sesuai metode standart yang dilakukan.

37

Skema kerja uji efek gastroprotektor terhadap mencit (Mus musculus) jantan
galur DDY dapat dilihat sebagai berikut :
25 ekor mencit jantan

Diadaptasikan selama 7 hari

Dibagi 5 kelompok (@ 5 ekor)

A
Kontrol Negatif
CMC Na 0,5 %
Volume 0,5 ml

C
D
E
B
Kelompok
Kelompok
Kelompok
Kontrol Positif
Pegagan
Etanol Herba
Pegagan
Ekstrak
Etanol Herba Pegagan
Omeprazole Ekstrak Etanol HerbaEkstrak
dosis
300
mg/Kg
BB
dosis
400
mg/Kg
BB
dosis
500 mg/Kg BB
40mg/KgBB

Masukkan Alkohol 40% sebanyak 0,5 ml secara peroral

Dilakukan selama 7 hari secara berturut turut

Dilakukan pembedahan pada lambung mencit

Pengamatan langsung dan histopatologi

Analisis Data

Gambar 3.5. Skema kerja uji efek Gastroprotektor pada mencit

(Mus musculus) putih jantan galur DDY

H. Analisis Data
Data yang diperoleh dalam penelitian ini didapatkan dengan cara pengamatan
luar dan dengan mengamati gambaran histopatologi pada lambung mencit.
Hasil dari data tersebut diolah dengan menggunakan metode uji ANOVA dan
menganalisis secara deskriptif.