Anda di halaman 1dari 18

BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pemuliaan tanaman secara konvensional telah menunjukkan kemajuan yang
sangat pesat untuk meningkatkan daya hasil tanaman. Akan tetapi, perbaikan sifat
genetik tanaman secara konvensional dengan cara persilangan seksual, adakalanya
tidak dapat diterapkan karena kendala genetik, seperti adanya inkompatibilitas
seksual atau kondisi fisiologis tanaman yang tidak memungkinkan terjadinya
persilangan seperti fertilitas polen yang rendah atau tidak bisa menghasilkan
bunga (bersifat steril) .
Kendala genetik ini sering terjadi pada persilangan antara tanaman tanaman
yang berkerabat jauh, misalnya persilangan antar spesies (interspecific) atau antar
genus dalam satu famili (intergeneric). Sementara itu, beberapa sifat seperti sifat
ketahanan terhadap hama, penyakit, nematoda, atau ketahanan terhadap cekaman
abiotik, biasanya terdapat pada tanaman liarnya, sehingga untuk memindahkan
sifat sifat tersebut ke tanaman budidaya kita harus melakukan persilangan
interspesifik atau bahkan mungkin intergenerik.
Sebagai contoh: dalam budidaya tanaman jahe, salah satu kendalanya adalah
kepekaan tanaman terhadap penyakit layu bakteri yang disebabkan oleh serangan
bakteri Ralstonia solanacearum, yang dapat menimbulkan kerugian hasil lebih
dari 90 %. Upaya yang paling efisien dalam mengatasi penyakit ini adalah dengan
penggunaan varietas resisten. Sementara itu, perakitan varietas resisten secara
konvensional melalui cara persilangan seksual terkendala oleh rendahnya fertilitas
polen (kesuburan tepungsari) dan adanya inkompatibilitas sendiri (self
incompatibility). Oleh karena itu perlu diaplikasikan metode inkonvensional
misalnya dengan cara mutasi induksi, seleksi in vitro, produksi tanaman haploid,
penerapan metode transformasi genetik atau fusi protoplas sehingga diperoleh
variasi genetik baru sebagai bahan seleksi (Rostiana,O., 2006).
Penggunaan metode transformasi genetik merupakan cara yang ideal untuk
mentransfer gen yang diinginkan secara efisien tanpa ada hambatan seksual dan
kedekatan taksonomi. Tetapi penggunaan metode transformasi hanya dapat

dilakukan pada sifat sifat genetik yang disandi oleh gen tunggal. Beberapa sifat
yang disandi oleh banyak gen (poligenik) yang terletak di satu atau beberapa
kromosom tanaman sulit untuk diidentifikasi dan diisolasi, sehingga penggunaan
metode transformasi menjadi sangat sulit untuk diterapkan (Ramulu et al., 1995
dalam Purwito,1999); Millam et al., 1995).
Aplikasi metode fusi protoplas atau hibridisasi somatik dapat dijadikan
alternatif untuk mengatasi masalah tersebut. Selain dapat mentransfer
gen

yang

gen

belum teridentifikasi, fusi protoplas juga dapat memodifikasi dan

memperbaiki sifat sifat yang diturunkan secara poligenik (Millam et al., 1995;
Waara and Glimelius, 1995). Fusi protoplas dimasa yang akan datang,menjadi
tujuan utama manipulasi genetik, karena dapat memecahkan hambatan genetik
dalam sistem persilangan secara konvensional (Verma,N., et al.,2004).
Fusi protoplas merupakan teknik penggabungan inti dan atau sitoplasma
dari genotipe yang berbeda untuk meningkatkan keragaman genetik atau
memperbaiki sifat unggul tanaman yang diinginkan (Rostiana, O., 2006). Pada
teknik fusi protoplas , dua protoplas dengan genetik yang berbeda diisolasi dan
difusikan dengan berbagai cara untuk memperoleh protoplas hibrida. Fusi
protoplas ini berguna untuk memproduksi hibrida interspesifik atau bahkan
intergenerik (Verma, N. et al.,2004).
Menurut Wattimena (1999), fusi protoplas dapat dilakukan dengan cara
menggabungkan seluruh genom dari dua jenis protoplas dari kultivar yang
berlainan

(intraspecific),

atau

antar

species

dalam

genus

yang

sama

(interspecific) , atau fusi antar genus dalam satu famili (intergeneric).


Fusi protoplas antar kultivar yang berlainan (intraspecific) bertujuan untuk
meresintesis genotipe tetraploid dari galur tanaman dihaploid yang telah terseleksi
sehingga tanaman tetraploid hasil fusi mempunyai tingkat heterozigositas yang
tinggi. Penggunaan fusi protoplas memungkinkan produksi hibrida dengan
heterozigositas yang tinggi hanya dalam sekali langkah sehinga sangat efisien,
walaupun keberhasilannya

sangat ditentukan

oleh genotipe (Waara and

Glimelius, 1995; Purwito, 1999).


Fusi protoplas antar species dalam satu genus (interspecific) bertujuan
mendapatkan sifat sifat tertentu, misalnya ketahanan ( resistensi) terhadap hama

dan penyakit. Untuk mendapatkan sifat sifat ketahanan juga dapat dilakukan
dengan cara fusi protoplas antar genus (intergeneric) (Purwito,1999).
Fusi protoplas dari genotipe yang berbeda dapat menghasilkan hibrida
somatik dengan tiga kategori yaitu,1.hibrida simetris dimana kedua inti dari dua
tetua tergabung secara sempurna 2.hibrida asimetris, dimana hanya sebagian saja
inti dari salah satu tetua bergabung dengan inti tetua lainnya.3. Cybrid ,yi dimana
inti dari salah satu tetua terakumulasi di dalam gabungan protoplas kedua tetua.
Oleh karena itu, variasi rekombinan sifat genetik di dalam tanaman hasil fusi
akan sangat beragam dalam frekuensi yang berbeda (Bhojwani and Razdan,1996
dalam Rostiana,O.,2006).
Fusi simetris dapat menghasilkan keragaman genetik yang tinggi yang
berguna dalam program pemuliaan tanaman, melalui beberapa kali silang balik
(backcross), dilanjutkan dengan seleksi, dapat dihasilkan kultivar baru (Mariska,I.
et al., 2006). Tanaman hasil fusi protoplas memiliki sifat sifat gabungan dari
kedua tetuanya,, termasuk sifat sifat yang tidak diinginkan yang berasal dari
species liar. Untuk menghilangkan sifat sifat yang tidak diinginkan pada tanaman
hasil fusi biasanya dilakukan dengan cara silang balik (backcross) dengan salah
satu tetuanya.

BAB 2
PEMBAHASAN
2.1 Protoplas
Perbaikan sifat genotipe tanaman secara inkonvensional melalui kultur
invitro dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain peningkatan keragaman
somaklonal, penyelamatan embrio, kultur haploid, atau fusi protoplas (hibridisasi
somatik).
Penggunaan teknik fusi protoplas atau hibridisasi somatik merupakan salah
satu aplikasi bioteknologi yang menjanjikan. Teknik hibridisasi somatik dapat
mentransfer sifat monogenik dan poligenik antar galur atau antar species dan
dapat mengatasi hambatan inkompatibilitas seksual (Millam et al.,1996 ;
Purwito,1999). Kendala genetik seperti inkompatibilitas seksual atau fertilitas
polen yang rendah atau sterilitas sering terjadi pada persilangan antara genotipe
genotipe tanaman yang berkerabat jauh, yang tidak dapat diatasi dengan metode
konvensional dengan persilangan seksual. Fusi protoplas dapat digunakan untuk
mengatasi hambatan dalam persilangan tersebut.
Penelitian fusi protoplas telah menghasilkan hibrida somatik yang
menunjukkan peningkatan pada potensi genetik tanaman. Beberapa penelitian fusi
protoplas telah menghasilkan keragaman genetik tanaman, produktivitas tinggi ,
perbaikan

sifat

ketahanan terhadap hama, penyakit, dan nematoda, serta

perbaikan sifat-sifat kualitatif seperti kandungan minyak tinggi (Mariska,I.et al,


2006).
Fusi protoplas untuk perbaikan sifat ketahanan terhadap penyakit, telah
dilakukan pada tanaman kentang (Solanum tuberosum L.). Pada tanaman kentang,
sifat ketahanan banyak terdapat pada spesies diploid, misalnya, Solanum phureja
(resistensi PVY dan layu bakteri), S.breviden (resisten terhadap PLRV),
S.demissum (resisten terhadap phythophtora infestan), S. etuberosum (resisten
terhadap frost), S. pennellii (resisten terhadap Alternaria), S.berthaultii (resisten
terhadap

serangga)

(Purwito,1999).

dan

S.balbocastanum

(resisten

terhadap

nematoda)

Untuk mendapatkan sifat ketahanan, telah dilakukan fusi antar genus (inter
generic), seperti antara kentang dengan genus lain dalam Solanaceae, misalnya
untuk mendapatkan ketahanan terhadap penyakit hawar daun, layu bakteri dan
ketahanan terhadap kekeringan dilakukan fusi antara kentang (Solanum
tuberosum) dengan species liar Lycopersicon pimpinellifolium ;S. khasianum
dengan S. aculestissima ; S. khasianum dengan S. laciniatum); S. melongena
dengan S. Aethopicum ; S.khasianum dengan S. mammosum ; serta S.tuberosum
BF15 dengan S.stenotomum (Purwito,1999).
Fusi protoplas untuk mendapatkan ketahanan terhadap penyakit juga
dilakukan pada tanaman terung. Pada budidaya tanaman terung (Solanum
melongena), masalah yang sering dihadapi antara lain adalah serangan penyakit
layu bakteri yang disebabkan oleh Ralstonia Solanacearum yang mengakibatkan
kehilangan hasil 15-95% (Husni, A. et al, 2004). Penyakit ini memiliki kisaran
inang yang luas, bukan hanya menyerang famili Solanaceae , tetapi juga menjadi
masalah serius dalam budidaya tanaman jahe dan beberapa tanaman lainnya.
Pada tanaman terung sumber ketahanan (resistensi) terhadap penyakit layu
bakteri banyak ditemukan pada spesies liar antara lain pada takokak ( Solanum
torvum) . Pemindahan sifat ketahanan dari species liar ke dalam species terung
budidaya secara konvensional dengan persilangan seksual sering mengalami
kegagalan akibat inkompatibilitas atau dihasilkan hibrida yang steril . Salah satu
cara untuk memindahkan sifat genetik dari dua spesies yang berbeda tersebut
adalah melalui fusi protoplas (Husni, A. et al., 2004) .
Hibrida somatik tanaman terung yang dihasilkan dari fusi protoplas toleran
terhadap penyakit layu bakteri Ralstonia solanacearum, bahkan beberapa
diantaranya lebih tahan dibandingkan kerabat liarnya. Melalui silang balik
(backcross) antara tanaman dihaploid dengan terung dapat dihasilkan genotipe
baru dengan morfologi, warna dan struktur buah yang menyerupai tetua
hibridanya (Mariska, I dan A. Husni., 2006). Dari penelitian lain yang telah
dilakukan, kultur protoplas dapat menghasilkan keragaman yang tinggi baik
dalam sifat sifat morfologi maupun resistensi terhadap phytophthora infestans dan
Alternaria solanii (Husni, A. et al., 2004) , juga telah diperoleh klon klon yang
tahan terhadap herbisida ( Evans and Sharp, 1986 dalam Husni, A. et al.,2004).

Walaupun penelitian fusi protoplas telah banyak dilakukan ,metode fusi


protoplas yang dapat berlaku umum pada genus Solanum belum ada, terutama
antara S. melongena dan S. torvum yang sering mengalami kegagalan dalam
regenerasi membentuk hibrida baru (Purwito, 1999).
Fusi protoplas untuk mendapatkan ketahanan terhadap nematoda telah
dilakukan pada tanaman nilam. Nilam (Pogostemon cablin) merupakan penghasil
minyak atsiri yang potensial untuk dikembangkan dan Indonesia merupakan
pemasok utama di pasar dunia. Tanaman nilam yang dibudidayakan di Indonesia
bersifat steril atau tidak berbunga sehingga sulit mendapatkan genotipe baru
melalui persilangan seksual. Selain itu, pengembangan nilam menghadapai
masalah serangan nematoda pratylenchus brachyurus.
Sifat ketahanan terhadap nematoda tersebut terdapat pada nilam jawa
(Girilaya) yang produksi minyaknya rendah. Untuk mendapatkan sifat ketahanan
tersebut maka dilakukan fusi protoplas antara nilam jawa dan nilam aceh
(budidaya) yang kadar minyaknya tinggi (Mariska, I dan A. Husni, 2006).
Mekanisme ketahanan terhadap nematoda dapat terjadi secara fisik dan
kimia. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tanaman yang tahan terhadap
nematoda mempunyai kandungan fenol dan lignin yang lebih tinggi daripada
tanaman yang rentan. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian pada pisang bahwa
senyawa fenol dan lignin memiliki hubungan yang sangat erat dengan ketahanan
terhadap nematoda. Hasil fusi protoplas nilam Aceh dan nilam jawa (girilaya)
dapat meningkatkan kandungan fenol dan lignin pada beberapa hibrida somatik
seperti pada kerabat liarnya ( Mariska, I dan A. Husni 2006).
Dalam hal peningkatan keragaman genetik, fusi protoplas pada tanaman
nilam (Pogostemon,sp) menghasilkan keragaman genetik yang luas untuk karakter
tinggi tanaman, panjang cabang primer, jumlah dan panjang cabang sekunder,
panjang dan lebar daun, panjang tangkai daun, produksi terna basah dan kering
( Martono, B., 2009).
Menurut Bhojwani dan Razdan (1996) dalam Martono,B (2009) bahwa
variasi rekombinan karakter genetik di dalam tanaman hasil fusi akan sangat
beragam dalam frekuensi yang berbeda . Variasi (keragaman) hibrida somatik
dapat merupakan hasil dari satu atau ketiga mekanisme berikut:

1. Keragaman genetik akibat subkultur kalus yang dilakukan terus menerus yang
mengakibatkan suatu variasi somaklonal.
2. Ketidakstabilan dari kombinasi inti sel yang mengakibatkan hilangnya
ekspresi gen atau hilangnya bagian dari informasi genetik,
3. Terjadinya segregasi dari inti atau sitoplasma setelah fusi yang
menghasilkan kombinasi unik antara informasi genetik pada inti dan
sitoplasma.
Beberapa penelitian tentang fusi protoplas lainnya misalnya pada tembakau,
tomat, timun, kacang panjang, slada, jamur,rumput laut,padi dan jahe. Pada
tanaman padi telah dilaporkan keberhasilan regenerasi tanaman hasil fusi
protoplas interspesies antara padi budidaya subspecies japonica dan beberapa
spesies padi liar (Takamura et al.,1992;Yan et al.,2004) dalam Sukmajaya et
al.,2007).
Faktor faktor penting yang berpengaruh dalam hibridisasi somatik adalah
sumber protoplas yang dipergunakan, metode isolasi protoplas, jenis dan
konsentrasi enzim yang dipergunakan, parameter listrik pada saat fusi, dan media
yang dipergunakan pada awal kultur protoplas pasca fusi serta media regenerasi
protoplas (Purwito, 1999).
2.2 Sumber protoplas
Jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplas bervariasi,
umumnya jaringan muda dari tanaman yang mempunyai umur fisiologis muda
seperti pucuk muda (dari kecambah,bibit,plantlet). Protoplas dari jaringan tersebut
dinding selnya masih sederhana terdiri dari dinding sel primer (belum berlignin).
Skema perlakuan untuk mendapatkan protoplas .

Jaringan daun pada umur dan kondisi fisiologis optimal (tanaman muda)
ditumbuhkan dalam growth chamber pada lingkungan terkendali dan reproducibel

Direndam

dalam

larutan

ethanol

70

(dalam

waktu

sangat

singkat),sterilisasi dengan 2.5% Na-hipokhlorida (15-30 menit)

Pencucian beberapa kali dengan air steril

Bahan jaringan dikeringkan diantara kertas tissue

Lapisan epidermis bawah dikupas dengan forsep untuk memudahkan


penetrasi Enzim atau bahan jaringan dipotong selebar 1-2 mm dan penetrasi enzim
dilakukan dalam vacuum

Dibuat suspense protoplas setelah inkubasi dengan enzim


Teknik Perlakuan Jaringan untuk Mendapatkan Protoplas (Mantell et al.,1985
dalam Soemartono et al.,1992)

2.3 Isolasi Protoplas


Protoplas adalah sel telanjang tanpa dinding yang hanya dilindungi oleh
membrane plasma. Menurut Suryowinoto (1996), isolasi protoplas yaitu teknik
untuk menghasilkan protoplas yang utuh dan viable dari jaringan tanaman hidup
dengan cara menghilangkan dinding selnya. Isolasi protoplas pertama kali

dilakukan oleh Klercker, 1892 dari potongan irisan umbi bawang yang terlebih
dahulu diplasmolisa, kemudian dimasukkan kedalam media cair sehingga banyak
protoplas yang meluncur kedalam medium (Bhojwani dan Razdan,1983 dalam
Suryowinoto, M. 1990).
Prosedur penyediaan protoplas dilakukan dengan menghilangkan dinding
sel tanaman tanpa banyak merusak protoplas dalam lingkungan osmotik yang
menstabilkan membrane protoplas. Protoplas dapat dilepaskan dari sel utuh,
secara mekanik yaitu melalui proses plasmolisis untuk melepaskan protoplas dari
dinding sel, atau dengan cara hidrolisis dinding sel dengan menggunakan enzim.
Cara mekanik, hanya menghasilkan sedikit protoplas yang viable (Soemartono, et
al., 1992).
Banyak modifikasi teknik mendapatkan protoplas menggunakan macam
macam enzim untuk menghancurkan dinding sel secara lunak. Beberapa enzim
patent yang digunakan untuk memperoleh protoplas (Mantell et al,1985 dalam
Soemartono, et

al.1992) sbb:1) Driselase (berasal dari Trichoderma

viridis,kombinasi selulase + pektinase); 2) Macerozyme (berasal dari Rhizopus


spp, kombinase selulase + pektinase);3) Pectolyase Y-23; 4) Onozuka R-10 ; 5)
Meicelase; 6) Rhozyme; 7) Macerozyme R-10. Enzim yang lebih banyak
mengandung pektinase tanpa adanya garam,memberikan protoplas lebih viable.
Protoplas dapat diisolasi dari hampir semua bagian tanaman seperti akar,
daun, nodul , koleoptil, kultur kalus, dan daun invitro (Husni,A. et al., 2004). Pada
isolasi protoplas tanaman jeruk siam satsuma dan mandarin ternyata bahwa
keberhasilan isolasi protoplas sangat dipengaruhi oleh jenis, konsentrasi, dan
kombinasi enzim yang digunakan (Suryowinoto, 1990).
Demikian pula hasil penelitian Purwito (1999) ternyata bahwa pada isolasi
protoplas tanaman kentang, jenis dan konsentrasi enzim sangat menentukan
banyaknya protoplas yang dihasilkan, bahkan pada komposisi enzim yang sama
menghasilkan protoplas dalam jumlah yang berbeda akibat perbedaan genotipe
tanaman. Umumnya tanaman yang tumbuh vigor menghasilkan protoplas lebih
banyak dibandingkan tanaman yang tumbuh kurus (Purwito,1999).
Jenis dan konsentrasi enzim yang digunakan dalam isolasi protoplas sangat
bervariasi, paling tidak ada 15 jenis enzim yang dapat dipergunakan, yang biasa

digunakan adalah pektinase, pektolyase, macerozim dan selulase. Pektinase,


pektolyase, dan macerozim berfungsi untuk melarutkan dinding primitive antar sel
yang tersusun oleh zat pektin sehingga menjadi sel sel tunggal, sedangkan selulase
berfungsi melarutkan sisa dinding sel yang tersusun atas zat selulosa
(Suryowinoto, 1990). Jenis enzim dan lamanya penghancuran dinding sel
menentukan viabilitas protoplas (Puite,K.J.,1991).

Gambar 1. Skema Teknik Mendapatkan Protoplas (Mantell et al., 1985


dalam Soemartono, et al. 1992)
2.4 Fusi Protoplas
Fusi protoplas dapat terjadi secara spontan dan dapat dengan cara induksi
(buatan). Fusi induksi dapat dilakukan dengan dua cara :
2.4.1Metode fusi dengan cara kimia.
Protoplas dengan sifat osmotik sama dapat dipacu untuk melakukan fusi
dibawah pengaruh senyawa garam seperti NaNO3. Cara ini dapat menghasilkan
25% fusi protoplas. Senyawa lain misalnya polyvinil Alkohol (PVA);dekstran ;
polyethylene glycol (PEG) dengan media fusi yang mengandung Ca

++

dan pH

tinggi (8-10). Hasil fusi sangat bervariasi dari 1-100 %, tergantung operator dan

bahan yang digunakan. (Puite,K.J.,1991; Soemartono et al.,1992; Purwito,


1999).
Metode

fusi

dengan

cara

kimia,

umumnya

menggunakan

enzim

polyethylene glycol (PEG) yang telah diaplikasikan secara luas (Puite,K.J.,1991).


PEG berfungsi sebagai bulking agent, yaitu sebagai jembatan antara protoplas
yang mirip fungsinya dengan plasmodesmata. Terjadinya fusi semakin besar pada
saat proses penghilangan PEG, yaitu pada saat pencucian. Keberhasilan fusi
sangat dipengaruhi oleh konsentrasi PEG dan jumlah kerapatan protoplas yang
akan difusikan (Puite,K.J.,1991; Purwito,1999). Keuntungan fusi protoplas
dengan PEG antara lain dapat dilakukan dengan peralatan sederhana.

Gambar 2.Hibridisasi Somatik antara Dua Species Tanama cara Elektrofusi


(Puite,K.J.,1991)

2.4.2 Metode fusi dengan cara elektrofusi


Metode ini dilakukan dengan menggunakan aliran listrik pada alat yang
dilengkapi dengan generator AC dan DC. Generator AC berfungsi untuk
membuat protoplas berjajar, membentuk rantai lurus, selanjutnya pulsa DC pada
tegangan tertentu dapat menginduksi terjadinya fusi kru pulsa DC dapat

membuat celah yang dapat balik, sehingga protoplas dapat berfusi


(Puite,K.J.,1991; Purwito,1999).
2.5 Kultur protoplas dan Regenerasi Tunas
Keberhasilan kultur protoplas dan regenerasinya ditentukan oleh beberapa
faktor, seperti genotipe dan jaringan yang digunakan, fisiologi jaringan, jenis dan
konsentrasi enzim, masa inkubasi, media kultur, zat pengatur tumbuh, dan kondisi
inkubasi (Bradsan and Mackey, 1994 dalam Sukmadjaya, et al, 2007). Tidak ada
metode baku dalam isolasi dan kultur protoplas, karena setiap individu sel atau
jaringan yang akan digunakan sebagai sumber protoplas kemungkinan akan
memerlukan kondisi yang khusus (Sukmadjaya et al. 2007).
Menurut Purwito (1999) bahwa keberhasilan produksi hibrida somatik
sangat ditentukan oleh keberhasilan dalam proses kultur protoplas dan
regenerasinya menjadi tanaman dari tetua- tetuanya. Oleh karena itu perlu
diketahui metode kultur protoplas, baik mengenai sumber protoplas yang
dipergunakan, jenis dan konsentrasi enzim untuk isolasi, komposisi medium
penaburan protoplas dan medium regenerasi mikrokalus menjadi tanaman pada
masing masing tetua yang dipakai.
Untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi adanya hibrida somatik dapat
dilakukan dengan beberapa cara, antara lain secara visual,melihat kejaguran
hibrida dari mikrokalus yang dihasilkan, menggunakan marka biokimia seperti
mutan defisiensi nitrat reduktase, penghitungan kromosom dan analisis ploidi
dengan flow cytometry, menggunakan teknik RFLP, teknik RAPD,dan melihat
morfologi tanaman di laboratorium dan di lapangan. Identifikasi tersebut
diperlukan untuk mendapatkan validitas dalam penentuan hibrida somatik
(Purwito,1999).
2.6 Prosedur Fusi Protoplas
Contoh

Fusi

Protoplas

antara

Solanum

Solanum torvum (takokak) (Husni et al., 2004) sbb:


2.6.1Persiapan eksplan (Sumber Protoplas)

melongena

(terung)

dan

Eksplan yang digunakan adalah S.melongena dan S. torvum .Benih dari


kedua species tersebut disterilkan dalam alkohol 70 %, kemudian dalam 0,05%
HgCl2, dan 30 % clorox masing masing selama 3 menit. Setelah itu benih dicuci
dengan aquades. Benih yang telah disterilisasi dikecambahkan dalam media MS
+ 20 g/l sukrosa dan 7 g/l agar. Media tersebut disterilkan dalam autoklaf dengan
suhu 121

C selama 20 menit. Setelah berkecambah, benih disubkultur pada

o
media baru dan diinkubasi pada suhu 25-27 C, dengan penyinaran 1000 lux
selama 12 jam setiap hari. Satu bulan setelah pengkulturan daunnya digunakan
sebagai sumber protoplas (Husni,A. et al.,2004).
2.6.2 Persiapan Larutan Enzim
Enzim yang digunakan adalah enzim Sellulase Onozuka RS 0,5 % (ml/l);
0,5 % (M/v) macerozyme R-10 (Yakult honssa Co.);0,05% (M/v) MES dan 9,1 %
(M/v) manitol. Senyawa tersebut dilarutkan dalam CPW dan pH diatur 5,5 5,6,
dan disterilisasi dengan filter ukuran 0,22 m. Larutan tersebut kemudian
dimasukkan kedalam cawan petri berdiameter 5 cm, masing masing 5-6 ml setiap
cawan (Husni,A. et al.,2004).
2.6.3 Isolasi Protoplas
Permukaan bagian bawah daun S.melongena dan S.torvum digores dengan
pisau secara merata dengan jarak antar irisan 2-3 cm. Daun yang telah diiris
ditempatkan dalam cawan petri yang berisi larutan enzim, kemudian diinkubasi
o
dalam kamar gelap pada suhu 27 C selama 16 jam. Untuk membantu melepaskan
protoplas, cawan petri digoyang selama 30 detik sehingga diperoleh larutan
protoplas.
Larutan protoplas S.melongena dan S.torvum disaring dengan metalic sieve
berukuran 100 m, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1800 rpm selama 5
menit sampai dihasilkan pelet. Kemudian larutan enzim dipisahkan dan protoplas
dilarutkan dalam 21 % sukrosa dan disentrifugasi kembali selama 10 menit.
Protoplas murni diambil menggunakan pipet dan disentrifugasi kembali.
Kemudian protoplas dilarutkan dalam 0,5 M manitol + 0,5 mM CaCl 2 dan

disentrifugasi selama 5 menit sampai terbentuk pelet protoplas. Akhirnya


protoplas dicuci dan densitas nya diukur (Husni,A. et al.,2004).
2.6.4

Fusi Protoplas
Protoplas S.melongena dan S torvum yang telah dimurnikan seperti tersebut

diatas masing masing diencerkan dengan larutan pencuci sehingga densitasnya


menjadi + 5 x 10

protoplas /ml. Kemudian suspensi protoplas dicampur

dalam tabung reaksi dengan perbandingan volume yang sama dan diresuspensi
sampai homogen. Setelah homogen suspensi protoplas diambil dengan pipet
sebanyak 600-800 l kemudian dimasukkan kedalam cawan petri berdiameter 5
cm dan dibiarkan selama 5 menit sehingga protoplas mengendap. Selanjutnya di
sekeliling suspensi protoplas ditambahkan 100 l larutan PEG dengan
konsentrasi 30 % atau 50 % sebagai perlakuan selama 10 dan 20 detik untuk
menginduksi terjadinya fusi. Larutan PEG kemudian dibuang dan protoplas
dibersihkan dengan larutan pencuci. Selanjutnya dilakukan penghitungan secara
mikroskopis terhadap protoplas yang mengalami fusi. Protoplas yang telah
difusikan dikultur dalam media perlakuan untuk memacu pertumbuhannya
(Husni,A. et al.,2004).
2.6.5

Kultur Protoplas Hasil Fusi


Media yang digunakan adalah media dasar KM8P dan VKM, masing

masing diperkaya dengan 0,2 mg/l 2,4-D + 0,5 mg/l zeatin + 0,1 mg/l NAA
dengan pH 5,8.Media tersebut disterilisasi dengan filter ukuran 0,22 m. Masing
masing medium dipipet dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi
protoplas yang telah difusi,masing masing 6 ml setiap cawan. Kultur dipelihara
o
dalam ruangan tanpa atau dengan penyinaran 1000 lux pada suhu 27 C sampai
terbentuk koloni sel atau mikrokalus. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah
koloni sel dan mikrokalus yang dihasilkan (Husni,A. et al.,2004).
2.6.6

Pengenceran Suspensi (Koloni ) Sel

Untuk mendorong mikrokalus membentuk kalus, suspense sel diencerkan


dengan media dasar yang sama

(KM8P dan VKM), tetapi ZPT nya diganti

dengan 0.1 mg/l 2,4-D + 2mg/l BAP. Koloni atau mikrokalus dari setiap cawan
petri dibagi menjadi tiga, dan setiap bagian dimasukkan ke dalam cawan petri
baru yang telah berisi media pengenceran masing masing 6 ml. Kultur disimpan
o
kembali tanpa cahaya dalam inkubator bersuhu 27 C..Lalu diamati jumlah kalus
yang dihasilkan (Husni,A. et al.,2004).
2.6.7

Regenerasi Tunas
Kalus yang dihasilkan dari setiap perlakuan dipindahkan ke dalam media

padat MS + vitamin Morell + 0,1 mg/l IAA dan konsentrasi zeatin sebagai
perlakuan (2,4 dan 6 mg/l).Kemudian diamati keberhasilan regenerasi kalus
membentuk tunas. Tunas yang dihasilkan dipindahkan ke media dasar yang
sama ,yaitu MS + vitamin Morell(padat) tanpa menggunakan zpt untuk induksi
akar (Husni,A. et al.,2004).

BAB III
KESIMPULAN
Keberhasilan dalam pengendalian protoplas melangsungkan fusi non
spesifik memberi peluang bagi pembentukan sel hibrida dari dua species, yang
secara konvensional melalui persilangan seksual tidak mungkin dilakukan karena
keterbatasan kendala genetik seperti inkompatibilitas atau sterilitas. Beberapa
potensi keuntungan pemuliaan tanaman melalui hibridisasi somatik (fusi
protoplas)(Soemartono,et al.,1992) antara lain :
1. Produksi hibrida interspesies atau intergenus yang secara konvensional
tidak mungkin dapat berlangsung, misalnya antar protoplas dari
Lycopersicon esculentum (tomato) x Solanum tuberosum (potato) ke
Pomato
2. Produksi galur heterozigot species sama, yang umumnya hanya bisa
dikembangkan melalui perbanyakan vegetatif,misalnya tanaman kentang
dan tanaman umbi lainnya.
3. Transfer terbatas genom dari satu species ke species lain melalui
pembentukan heterokarion dan pemilihan unsur unsur sitoplasmik salah
satu species.
4. Produksi hibrid amfidiploid yang fertil dari dua species yang
inkompatibel.

DAFTAR PUSTAKA
Husni,A.,I.Mariska, dan Hobir. 2004. Fusi Protoplas dan Regenerasi Hasil Fusi
Antara
Solanum melongena dan Solanum Torvum. Jurnal Bioteknologi Pertanian 9(1): 17.
Mariska,I., dan A.Husni. 2006. Perbaikan Sifat Genotipe Melalui Fusi Protoplas
Pada Tanaman Lada,Nilam, dan Terung. Jurnal Penelitian dan
Pengembangan Pertanian 25(2): 55 60.
Martono,B. 2009. Keragaman Genetik, Heritabilitas dan Korelasi antara Karakter
Kuantitatif Nilam (Pogostemon sp.) Hasil Fusi Protoplas. Jurnal Penelitian
Tanaman Industri 15(1) :9 15.
Millam,S.,L.A.Payne, and G.R.Mackay. 1995. The Integration of Protoplast
Fusion- derived Material into a Potato Breeding Programme: a review of
progress and problem. Euphytica 85: 451 455.
Puite, K.J. 1991. Somatic Hybridisation in Biotechnological Innovations in Crop
Improvement. Open Universiteit and Thames Polytechnic. Nederland.
Purwito,A. 1999. Fusi Protoplas Intra dan Interspesies pada Tanaman Kentang.
Disertasi Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Rostiana,O.,2006. Peluang Pengembangan Bahan Tanaman Jahe Unggul Untuk
Penanggulangan Penyakit Layu Bakteri. Balai Penelitian Tanaman Obat dan
Aromatik.Hal 77-98.
Soemartono,Nasrullah & Hari Hartiko.1992. Genetika Kuantitatif dan
Bioteknologi Tanaman. PAU Bioteknologi. Universitas Gadjah Mada.
Yogyakarta.Hal 277-296.
Sukmadjaya, D.,Novianti Sunarlim,Endang G.Lestari, Ika Roostika, dan Tintin
Suhartini.
2007. Teknik Isolasi dan Kultur Protoplas Tanaman Padi. Jurnal AgroBiogen
3(2):60-65.
Suryowinoto,M.1990.
Laboratorium.

Pemuliaan

Tanaman

secara

In

vitro.

Petunjuk

PAU.Biotek.Universitas Gadjah Mada,Yogyakarta.321 hlm


Suryowinoto,M.1996. Prospek Kultur Jaringan dalam Perkembangan Pertanian
Modern.
Universitas Gadjah Mada.Yogyakarta. 2-18.
Verma,N.,M.C.Bansal, Vivek Kumar.2004. Protoplast Fusion Technology and its
Bio technological Applications.Departement of Paper Technology, Indian
Institute of Technology, Roorkee,Saharanpur.
Waara,S. and K.Glimelius. 1995. The Potential of Somatic Hybridization in Crop
Breeding. Euphytica 85:217-233.
Wattimena,G.A. 1999. Application of Biotechnology in Horticultural Crops
Production. In Proceeding of Seminar on Biotechnology: Application of
Biotechnology in Horticultural Production. Bogor Agricultural UniversityDFID British Council,Bogor, 14 April 1999.

Anda mungkin juga menyukai