Anda di halaman 1dari 4

Prinsip Kerja HPLC

Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa
geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC
digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai kedektetor (waktu retensinya) akan
berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah.

1.

Pompa

Pompa pendeteksian tetap dapat dibedakan menjadi pompa torak dan pompa semprit. Pompa
torak menghasilakan aliran yang berdenyut jadi memerlukan peredam denyut atau peredam
elektronik untuk menghasilkan garis alas detector yang stabil jika detector peka terhadap aliran.
Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak terbatas.
2.

Injector

Cuplikan harus dimasukan kedalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sedikit
mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama aliran henti dan pelarut
mengalir. Ada 3 macam system injector, yaitu:
a.

Stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, system tertutup dan

aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi
tidak dipengaruhi.

b.

Septum : septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada

kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampa 60 70 atmosfir. Tapi septum
ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang
terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan penyumbatan.
c.

Loop vaive : tipe injector ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar

dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai,
volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisikan ke
dalam loop pada kinerja atmosfir, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk dalam
kolom.

3.

Kolom

Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada
pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi kolom analitik dan
kolom preparative.
4.

Detector

Detector diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen kolom dan
mengatur jumlahnya. Detector yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan
liniernya lebar dan menggapai semua jenis senyawa.
Jenis-jenis detector :

UV/Vis

Retraktif indeks (RI) detector

Konduktifitas decetor

Elektroimia detector

PDA

ELSD

MS dectetor

5.

Fase gerak

Fase gerak memiliki syarat-syarat :

Murni, tanpa cemaran

Tidak bereaksi dengan kemasan

Sesuai dengan detector

Dapat melarutkan cuplikan

Mempunyai viskositas rendah

Memungkinkan memperoleh dengan mudah cuplikan jika diperlukan

Harganya wajar

HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat
padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan
fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus
karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak

tertentu. Dengan bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram.
Kromatogram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.