Teknik Ekspresi Gen menggunakan Microarray DNA

Analisis ekspresi gen menggunakan microarray DNA sering digunakan

dalam hal analisis ekspresi DNA, selain CGH, SNP, ChIP-on-chip, dan metilasi DNA.
Penggunaan microarry DNA memungkinkan untuk dapat membedakan perbedaan
antara dua asam nukleat yang berbeda antar sample yang ingin diuji. Tahapan
yang harus dilakukan untuk analisis ekspresi gen menggunakan DNA microarray
berupa : 1). Pemurnian RNA, 2). Melabeli sample, 3). Hibridisasi dan pencucian
slide, 4). Deteksi signal, 5). Data analisis.
Berdasarkan protokol, penggunaan purifikasi RNA valid digunakan pada
Arabidopsis, kedelai dan juga padi. bahan tanaman untuk purifikasi RNA harus
dalam keadaan beku selama proses grinding dengan menambahkan N2 cair.
Temperatur rendah tersebut dimaksudkan untuk inaktifasi dari RNAse.
Penggunaan microarray tidak membutuhkan biaya yang banyak, akurat
dan memiliki reproducibility yang cukup tinggi.

Microarray merupakan teknologi dalam bidang Biologi Molekuler yang dapat

digunakan untuk melihat perbedaan ekspresi gen. Teknologi ini memanfaatkan
kumpulan array yang berjumlah ribuan yang berisi nukleotida DNA yang berfungsi
sebagai probe. Hibridisasi antara probe dan target (cDNA atau cRNA) dideteksi
dengan menggunakan target yang dilabel fluoresen. Karena array yang digunakan
terdiri atas ribuan probe, eksperimen microarray dapat dikatakan sebagai tes
genetik yang dilakukan secara paralel. Informasi yang dihasilkan sangat detail dan
menyeluruh pada genom pada tingkat transkripsi gen. Sehingga, proses biologi
yang melibatkan regulasi gen bisa dianalisis dengan lebih baik.
Informasi yang diperoleh dari hasil microarray telah dimanfaatkan untuk
berbagai aplikasi spesifik seperti diagnosis penyakit, penemuan obat-obatan,
pengelompokan ekspresi gen yang terlibat dalam organogenesis, cekaman dan
interaksi dengan mikro organisme.
Perkembangan teknologi microarray telah memberikan kesempatan bagi peneliti
untuk mengeksplorasi ketersediaan gen-gen suatu organisme yang berhubungan
dengan gen yang sedang kita pelajari. Data-data microarray yang tersedia diproses
dengan menggunakan bantuan pengukuran komputerisasi ekspresi profiling, atau
dengan melihat kedekatan sepasang gen melalui derajat stringensi. Dari sini
dihasilkan suatu database yang dapat memprediksi keterkaitan suatu gen dengan
gen-gen lain. Hasil ini biasanya ditampilkan berupa klaster-klaster yang merupakan
hasil pengelompokan gen-gen yang memiliki kemiripan motif ekspresi.

Material
RNA Analisis
1. Latex gloves.
2. Mortar and pestle (Grinding equipment).

3. Spatula.
4. 2 ml Eppendorf tubes.
5. Vortex mixer.
6. Microtube mixer.
7. High-speed microcentrifuge.
8. Centrifuge desiccator.
9. NanoDrop ND-1000 UVVIS Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientifi c Inc.).
10. Liquid N 2 .
11. Ultrapure water.
12. 75 % (v/v) ethanol.
13. 99.5 % (v/v) ethanol.
14. Isopropanol.
15. RNAiso Plus (Takara) or TRIzol Reagent (Invitrogen).
16. 3 M sodium acetate, pH 5.2.
17. High-salt buffer (0.8 M sodium citrate and 1.2 M sodium chloride).
18. RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies).
19. Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).
20. IKA vortex mixer (Agilent Technologies).

Microarray Analisis
1. Low Input Quick Amp Labeling Kit, Two-Color (Agilent Technologies).
2. RNA Spike-In Kit, Two-Color (Agilent Technologies).
3. Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technologies).
4. Gene Expression Wash Buffer Kit (Agilent Technologies).
5. DNase/RNase-free distilled water (Agilent Technologies).
6. RNeasy Mini Kits (Qiagen).
7. 99.5 % (v/v) ethanol.
8. Microarray Scanner (Agilent Technologies).
9. Hybridization Chamber, stainless (Agilent Technologies).
10. Hybridization Chamber gasket slides (Agilent Technologies).
11. Hybridization oven (Agilent Technologies).
12. Hybridization oven rotator (Agilent Technologies).
13. Nuclease-free 1.5 ml tubes.
14. Magnetic stir bar (2).
15. Microcentrifuge.
16. NanoDrop ND-1000 UVVIS Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientifi c Inc.).
17. Slide-staining dish, with slide rack (X3).
18. Thermal cycler.
19. Clean forceps.
20. Powder-free gloves.
21. Vortex mixer.
Method

RNA Purification
1. Bahan tanam yang digunakan dipanen dan langsung dimasukkan ke
dalam nitrogen cair.
2. Pindahkan bahan tanaman ke mortar yang berisi nitrogen cair, gerus
hingga menjadi halus, penghancuran harus dilakukan dalam keadaan
beku.
3. Pindahkan sample ke dalam precooled tube (2mL) pada wadah berisi
nitrogen cair.
4. Tambah 1 ml RNAiso Plus pada masing-masing tube, dan mix selama 5-10
menit.