Anda di halaman 1dari 8

Uji Konfirmasi dengan Metode KLT-Spektrofotodensitometri.

A. Pengertian Metode KLT, Fase Diam dan Fase Gerak

Metode Thin Layer Chromatography (TLC) Kromatografi lapis tipis


Thin Layer Chromatography (TLC) Kromatografi lapis tipis adalah salah satu
contoh kromatografi planar. Fase diamnya (Stationary Phase) berbentuk lapisan
tipis yang melekat pada gelas/kaca, plastik, aluminium. Sedangkan fase geraknya
(Mobile Phase) berupa cairan atau campuran cairan, biasanya pelarut organi dan
kadang- kadang juga air. Fase diam yang berupa lapisan tipis ini dapat dibuat
dengan membentangkan /meratakan fase diam (adsorbent=penjerap=sorbent) diatas
plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium.

Fase diam
Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena
strukturnya, ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa
diam yang digunakan TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk kromatografi
kolom, terutama karena ukuran dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan
spesifikasi tertentu, yaitu ukuran (diameter) dalam mesh dan untuk kegunaannya
(mis: untuk TLC atau kromatografi kolom).
Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam
perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40m. Makin kecil
diameter akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian
mempengaruhi kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 3001000 m2/g. Bersifat higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat
air 7-20%. Macam-macam silka gel yang dijual dipasaran: Silika gel dengan
pengikat. Pada umumnya digunakan pengikat gypsum, (CaSO4 5-15%). Jenis ini
diberi nama Silika gel G. Ada juga menggunakan pengikat pati (starch) dan dikenal
Silika gel S, penggunaan pati sebagai pengikat mengganggu penggunaan asam
sulfat sebagai pereaksi penentuan bercak.
Silika gel dengan pengikat dan indicator flouresensi. Jenis silica gel ini sama
seperti silika gel diatas dengan tambahan zat berfluoresensi bila diperiksa dibawah
lampu UV A, panjang atau pendek. Sebagai indicator digunakan timah- kadmium
sulfida atau mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau Silika gel

GF254 (berflouresensi pada 254 ,nm). Silika gel tanpa pengikat, dikenal dengan
nama Silika gel H atau Silika gel N. Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan
indicator flouresensi. Silika gel untuk keperluan pemisahan preparative.

Fase Gerak
Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik. Dapat
digunakan satu macam pelarut organic saja

ataupun campuran. Bilamana fase

gerak merupakan campuran pelarut organik dengan air maka mekanisme pemisahan
adalah partisi. Pemilihan pelarut organic ini sangat penting karena akan
menentukan keberhasilan pemisahan. Pendekatan polaritas adalah yang paling
sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar akan lebih mudah terelusi oleh fase
gerak yang bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa
non polar lebih mudah terelusi oleh fase gerak non polar dari pada fase gerak yang
polar.
B. Uji Konfirmasi
Pada uji konfirmasi dengan KLT, setiap senyawa yang terlarut dalam fase
gerak memiliki hambatan yang berbeda saat bergerak pada fase diam. Besar
hambatan ini dapat dinyatakan dengan nilai Rf (hRf = q00 Rf) (Sherma and fried,
1996). Harga Rf dapat dihitung dengan persamaan berikut :
Rf =

Jarak yang ditempuh masing-masing senyawa

Jarak yang ditempuh fase gerak


Uji konfirmasi dilakukan dengan membandingkan nilai hRf analit dengan
data senyawa standard an pustaka. Pada prakteknya, nilai hRf bervariasi karena
pengaruh faktor lingkungan seperti kejenuhan bejana kromatografi (chamber), pH
medium, suhu penguapan fase gerak pada plat, kadar analit yang ditotolkan
C. Metode Uji Konfirmasi
1. Metode Uji Konfirmasi Golongan Opiat
Fase Diam : Silika Gel GF254
Fase Diam Silika Gel GF254 (ketebalan 0,02 mm), dicuci dengan metanol dan
diaktivasi pada suhu 1000C. Masing masing larutan standar dilarutkan dalam
metanol.

Tabel Daftar Sistem KLT Morfin dan Kodein pada berbagai fase gerak
Sistem

Morfin

Kodein

TA

37

33

TB

00

06

TC

09

18

TE

20

35

TL

01

03

TAE

18

21

TAF

23

22

TAJ

00

10

TAK

00

00

TAL

15

26

TAEA

11

17

Keterangan :
TA

= Metanol : Larutan amonia kuat (100 : 1,5) Fase diam : Silika yang diimpregnasi
dengan 0,1 mol/L KOH dan dikeringkan.

TB

= Sikloheksana : Toluen : Dietilamina (75 : 15 : 10) Fase diam : Silika yang


diimpregnasi dengan 0,1 mol/L KOH dan dikeringkan.

TC

= Kloroform : Metanol (90 : 10) Fase diam : Silika yang diimpregnasi dengan 0,1
mol/L KOH dan dikeringkan.

TD

= Kloroform : Aseton (80 : 20)

TE

= Etil asetat : Metanol : Larutan amonia kuat (85 : 10 : 5)

TF

= Etil asetat

TL

= Aseton, Fase diam : Silika yang diimpregnasi dengan 0,1 mol/L KOH dan
dikeringkan.

TAD = Kloroform : Metanol (90 : 10)


TAE = Metanol
TAF = Metanol : N-butanol (60 : 40) ditambahkan 0,1 mol/L NaBr

TAJ = Kloroform : Etanol (90 : 10)


TAK = Kloroform : Sikloheksana : Asam asetat (4 : 4 : 2)
TAL = Kloroform : Metanol : Asam propionat (72 : 18 : 10)
(Moffat et al., 2005).
2. Metode Uji Konfirmasi Golongan Benzodiazepin

Metode KLT Densitometri

Fase diam : Plat KLT silika gel GF254

Fase Gerak :
Sistem A (TD) : Kloroform : Aseton (80:20 v/v)
Sistem B (TC) : Kloroform : Metanol (90:10 v/v)
Sistem C (TB) : Sikloheksan : Toluen : Dietilamin (75:15:10 v/v/v)
Sampel ditotolkan sebanyak 2 L pada plat kemudian dielusi dengan sistem
fase gerak yang dipilih hingga mencapai batas atas jarak pengembangan. Plat
selanjutnya dikeluarkan dari dalam kolom, diangin-anginkan, dan diamati dibawah
UV254 nm. Ditandai spot yang tampak dan dihitung nilai Rfnya. Selanjutnya plat
disemprot dengan larutan H2SO4 2 N dan dipanaskan di dalam oven pada suhu
800C selama 5 menit. Plat kemudian diamati dibawah UV366 nm. Apabila plat
disemprot dengan reagen potassium iodoplatinat acidified, maka golongan
benzodiazepin akan memberikan spot berwarna ungu.

Tabel Nilai Rf golongan benzodiazepin dengan sistem A, B, dan C (UNODC, 2012).

D. ALAT DAN BAHAN


1 Alat
Beaker glass
Gelas ukur
Ballfiller
Corong
Kertas saring
pH meter
Heater
Vortex/sentrifuse
Tabung sentrifugasi/ vortex
KLT Spektrofotodensitometer
Kertas saring
Chamber
Pipet Kapiler
Plat KLT Silika Gel GF 254
Oven
Pipet ukur
3.1.2 Bahan
Urine
Buffer fosfat pH 5 dan 7
NaOH
Dietileter
Asam sulfat anhidrat
Fase Gerak methanol: buffer fosfat (25:75)
sistem TE (etilasetat-metanol-amonia pekat (85:10:5)

E. PROSEDUR KERJA
Metode Uji Konfirmasi
Uji konfirmasi dilakukan dengan menggunakan 2 sistem fase gerak yaitu
sistem TE (etilasetat-metanol-amonia pekat (85:10:5) dan TB (SikloheksanaToluena-Dietilamin (75:15:10). Fase diam yang digunakan yaitu plat silika GF254.
Digunakan fase gerak sistem TE dan TB dikarenakan fase gerak sistem TE
dan TB memiliki selisih Rf yang besar sehingga dalam pemisahan senyawa opiat
mampu memisahkan dengan jelas ketiga golongan yang termasuk senyawa opiat
(morfin, kodein, heroin) dan senyawa Benzodiazepin (Nitrazepam, Flurazepam dan
Diazepam), dengan demikian nilai Rf dapat dihitung dengan jelas.
Pada fase gerak sistem TE merupakan campuran dari Etil asetat : Metanol :
Larutan amonia kuat (85 : 10 : 5) . Fase diam yang digunakan yaitu plat silika
GF254. Dan pada fase gerak system TB merupakan campuran dari Sikloheksana :
Toluen : Dietilamina (75 : 15 : 10) Fase diam : Silika yang diimpregnasi dengan 0,1
mol/L KOH dan dikeringkan
Plat KLT silika GF254 dipotong 8 x 10 cm dan diberi tanda
batas atas 1cm; batas bawah 1 cm; batas kiri 1 cm; jarak antar
totolan 1 cm

Plat dicuci dengan metanol dan diaktivasi pada suhu 1100 C


selama 30 menit

Disiapkan 2 chamber untuk elusi dan masing masing


dijenuhkan dengan fase gerak TE dan TB selama 30 menit
hingga chamber jenuh

Larutan standar, fraksi nol, fraksi asam dan fraksi basa serta seri
pembanding ditotolkan pada plat sebanyak 2L

Dilakukan elusi pada plat

Plat dikeringkan dalam oven suhu 60OC selama 10 menit


Plat dideteksi dengan Spektrofotodensitometer pada panjang
gelombang 210 nm
Plat kemudian dideteksi dengan Spektrofotodensitometer pada
rentang panjang gelombang 200 400 nm

Ditentukan panjang gelombang optimum senyawa yang


dideteksi

Dihitung harga hRfc berdasarkan data dari


spektrofotodensitometer, analisis spektrum, dan dibandingkan
dengan literatur