Pereaksi geser merupakan pereaksi yang ditambahkan dalam larutan cuplikan untuk menentukan kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dan mengamati pergeseran puncak serapan yang terjadi. Secara tidak langsung berguna untuk menentukan kedudukan gula atau metil yang terikat pada salah satu gugus hidroksil fenol. Keuntungan utama cara ini adalah sangat sedikitnya jumlah flavonoid yang diperlukan untuk analisis lengkap (biasanya 0,1 mg) Penambahan pereaksi geser atau pereaksi diagnostik, adanya hidroksilasi, glikolasi, metilasi dan asetilasi dapat mengubah karakter resapan dari senyawa flavonoid. Dengan melihat perubahan-perubahan ini maka dapat digunakan untuk memperkirakan struktur flavonoid. 1. Efek hidroksilasi. Penambahan gugus hidroksil pada cincin A pada flavon atau flavonol menghasilkan pergeseran batokromik yang nyata pada pita resapan I atau pita resapan II pada spektra flavonoid. Apabila gugus hidroksil tidak ada pada flavon atau flavonol, panjang gelombang maksimal muncul pada panjang gelombang yang lebih pendek dibanding jika ada gugus 5 OH , sedang subtitusi gugus hidroksil pada posisi 3, 5 dan 4 mempunyai sedikit efek atau tidak sama sekali pada spektra UV. Pita absorpsi I isoflavon mempunyai intensitas yang lemah, sedangkan pita II intensitas kuat. Pita absirbsi II dari isoflavon biasanya antara 245 270 nm dan relatif tidak mempunyai efek pada cincin B dengan adanya hidroksilasi. 2. Efek natrium metoksida. Natrium metoksida merupakan basa kuat yang dapat mengiionisasi semua gugus dalam flavonoid. Degradasi atau pengurangan kekuatan spektra setelah waktu tertentu merupakan petunjuk yang baik akan adanya gugus yang peka terhadap basa. Spektra isoflavon yang mempunyai gugus hidroksi pada cincin A akan memperlihatkan pergeseran batokromik baik pada pita I maupun pita II. Puncak pada spektra UV senyawa 3 4 dihidroksi isoflavon akan mengalami penurunan intensitas beberapa menit setelah penambahan natrium metoksida. Adanya perbedaan kecepatan dekomposisi 4 monohidroksi isoflavon dapat digunakan untuk menentukan bahwa dekomposisi yang berjalan cepat menunjukkan adanya 3 4 dihidroksi isoflavon. Penambahan natrium metoksida pada flavon dan flavonol dalam metanol umumnya menghasilkan pergeseran batokromik untuk semua pita serapan. Walaupnun demikian pergeseran batokromik yang besar pada serapa pita I sekitar 40 65 nm tanpa penurunan intensitas, menunjukkan adanya gugus 4 OH bebas. Dan flavonol yang tidak mempunyai gugus 4 OH bebas juga memberikan pergeseran pada pita serapan I, dengan penurunan intensitas. Dalam hal ini pergeseran batokromik disebabkan adanya gugus 3 OH bebas. Jika suatu flavonol mempunyai 3 dan 4 OH bebas, maka spektra
dengan natrium metoksida akan mengalami dekomposisi. Pengganti natrium metoksida
yang baik ialah laruan NaOH 2M dalam air. 3. Efek natrium asetat. Natrium asetat merupakan basa lemah dan hanya akan mengionisasi gugus yang sifat keasamannya tinggi, khususnya untuk mendeteksi adanya gugus 7 OH bebas. Natrium asetat hanya dapat mengionisasi isoflavon khusus pada gugus 7 OH. Gugus 3 atau 4 OH pada flavonol. Oleh sebab itu interpretasi terhadap pergeseran spektra isoflavon untuk penambahan natrium asetat menjadi sederhana. Adanya 7 OH isoflavon menyebabkan pergeseran batokromik 6 20 nm pada pita II setelah penambahan natrium asetat. Adanya natrium asetat dan asam borat akan membentuk kompleks dengan gugus orto hidroksil paa cincin B menunjukkan pergeseran batokromik pada pita serapan I sebesar 12 30 nm. Gugus orto hidroksil pada cincin A juga dapat dideteksi dengan efek natrium asetat dan asam borat. Adanya pergesaran batokromik sebesar 5 10 nm pada pita II menunjukkan adanya gugus orto hidroksi pada posisi C6 dan C7 atau C7 dan C8. 4. Efek aluminium klorida. Pereaksi ini dapat membentuk kompleks tahan asam antara gugus hidroksi dan keton yang bertetangga dan membentuk kompleks tidak tahan asam dengan gugus orto hidroksi, perekasi ini dapat digunakan untuk mendetekasi kedua gugus tersebut. Adanya gugus 3, 4 dihidroksil pada isoflavon atau flavanon dan dihidroflavonol tidak dapat dideteksi dengan AlCl3 karena cincin B mempunyai sedikit atau tidak ada konyugasi dengan kromofor utama. Jika isoflavon, flavanon (dan mungkin dihidroflavonol) mengandung gugus-gugus orto hidroksil pada posisi 6, 7 atau 7, 8 maka spektra AlCl3 menunjuikkan pergeseran batokromik (biasanya pada pita I maupun pita II) dengan membandingkan terhadap spektra AlCl3 / HCl. Pita serapa II spektra UV dari semua 5 OH isoflavon dapat dideteksi dengan penambahan AlCl3 atau HCl, kecuali 2 karboksil 5, 7 dihidroksil isoflavon. Adanya gugus tersebut ditandai dengan pergeseran batokromik pada pita II 10 14 nm (relatif terhadap spektra metanol). Spektra isoflavon yang tidak mempunyai gugus 5 OH bebas tidak berefek setelah penamabahan AlCl3 / HCl. Pada flavon dan flavonol, adanya gugus orto hidroksil pada cincin B dapat diketahui jika penambahan asam terhadap spektra AlCl3menghasilkan pergeseran hipsokromik sebesar 30 40 nm pada pita I (atau pita Ia jika terdiri dari dua puncak). Dengan adanya pergeseran batokromik pada pita Ia (dalam AlCl3/ HCl) dibandingkan dengan pita I (dalam metanol) sebesar 35 55 nm, menunjukkan adanya 5 OH flavon atau flavonol 3 OH tersubtitusi.
Penafsiran spektrum UV dengan penambahan NaOMe
(Karkham, 1988)
Penafsiran spektrum UV dengan penambahan NaOAc
(Karkham, 1988)
Penafsiran spektrum UV dengan NaOAc / H3 BO3 (Karkham, 1988)
Penafsiran spektrum UV dengan penambahan AlCl3 dan AlCl3 /HCl
(Markham, 1988)
Resume Jurnal
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA FLAVONOID PADA EKSTRAK ETANOL 96%
DAUN SRIKAYA (Annona squamosa L.) Identifikasi menggunakan pereaksi geser pada isolat ASF431 dengan penambahan pereaksi geser NaOH menunjukkan suatu pergeseran batokromik pada pita I sebesar 54 nm tanpa adanya penurunan intensitas terhadap spektrum metanol menunjukkan adanya gugus OH bebas pada posisi atom C nomor 4. Pembentukan pita baru di panjang gelombang 329 nm pada penambahan NaOH menunjukkan adanya gugus OH bebas pada atom C nomor 7. Penambahan pereaksi geser AlCl3/HCl menghasilkan pergeseran batokromik pada pita I sebesar 43 nm, hal ini menunjukkan adanya OH bebas pada atom C nomor 5. Terjadinya pergeseran sebanyak 21 nm pada penambahan AlCl3 terhadap spektrum AlCl3/HCl mengarah adanya orto dihidroksi pada cincin A atau cincin B. Penambahan pereaksi geser NaOAc memberikan penambahan pergeseran panjang gelombang sebesar 10 nm tanpa disertai penurunan intensitas pada pita II yang memastikan adanya gugus OH bebas pada posisi atom C nomor 7. Pemeriksaan pada pereaksi geser NaOAc/H3BO3 memperlihatkan terjadi pergeseran kecil batokromik pada panjang gelombang pita I sebesar 4 nm. Hal ini menunjukkan kemungkinan adanya orto dihidroksi cincin A pada posisi atom C nomor 6,7 atau 7,8. Berdasarkan data di atas, isolat ASF431 merupakan suatu senyawa flavonol 3-OH tersubtitusi dengan gugus OH pada atom C nomor 5, 7, 4 dan kemungkinan terdapat orto dihidroksi pada cincin A atau B (Markham, 1988). Diperoleh data berdasarkan referensi spektrum isolat ASF431 mempunyai kemiripan dengan spektrum senyawa quercitrin, sehingga kemungkinan isolat ASF431 mempunyai kemiripan struktur dengan senyawa quercitrin (Mabry, Markham, dan Thomas, 1970). Hasil pemeriksaan isolat ASF322 dalam larutan metanol memperlihatkan serapan maksimum panjang gelombang 258 nm untuk pita II dan 358 nm untuk pita I, hal mengarah kepada suatu senyawa golongan flavonoid yaitu senyawa flavonol 3-OH tersubstitusi, flavonol 3OH bebas atau khalkon. Hasil identifikasi menggunakan pereaksi geser pada isolat ASF322 dengan penambahan NaOH menunjukkan pergeseran batokromik pada pita I sebesar 53 nm tanpa disertai penurunan intensitas menunjukkan adanya gugus OH bebas pada posisi atom C nomor 4. Penambahan pereaksi geser AlCl3/HCl menghasilkan pergeseran batokromik pada pita I sebesar 41 nm, hal ini menunjukkan adanya gugus OH bebas pada posisi atom C nomor 5. Penambahan pergeseran sebanyak 33 nm pada penambahan AlCl3 terhadap pergeseran AlCl3/HCl mengarah adanya orto dihidroksi pada cincin B. Penambahan pereaksi geser NaOAc memberikan penambahan pergeseran panjang gelombang sebesar 14 nm tanpa disertai penurunan intensitas pada pita II yang memperlihatkan adanya gugus OH bebas pada posisi atom C nomor 7. Pemeriksaan pada pereaksi geser NaOAc/H3BO3 memperlihatkan terjadi pergeseran batokromik pada panjang gelombang pita I sebesar 19 nm. Hal ini menunjukkan kemungkinan adanya orto dihidroksi pada cincin B (Markham, 1988). Berdasarkan data di atas, isolat ASF322 merupakan suatu senyawa flavonol 3-OH tersubstitusi dengan gugus OH pada atom C nomor 5, 7, 4 dan kemungkinan terdapat suatu orto dihidroksi pada cincin B.
