Anda di halaman 1dari 16

MAKALAH

PRODUKSI L-ASPARAGINASE DARI Citrobacter C6 DALAM INDUSTRI


Mata Kuliah Teknologi Enzim dan Industri

Oleh :
Hanni Tsaaqifah
BTK/ P051150071

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI


SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2016

PENDAHULUAN
1. Latar Belakang
Konstruksi plasmid merupakan hal yang cukup krusial dalam bidang
molekuler terutama untuk manipulasi genetik. Dalam banyak kasus, plasmid
dikonstruksi secara in vitro dengan digesting (pemotongan) fragmen DNA
menggunakan enzim restriksi pada situs spesifik dan meligasi (penyambungan)
fragmen yang dihasilkan. Konstruksi DNA biasanya diamplifikasi dalam E. coli
untuk menganalisis strukturnya (Chino, 2010).
Plasmid biasanya juga digunakan dalam teknologi DNA rekombinan
menggunakan E. coli sebagai inang, sehingga dalam rekayasa genetika plasmid
sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan
ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan
produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim (Stanfield,
1996). Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid
memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning, yaitu replication
origin, marker yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten
antibiotik), dan daerah yang mampu disisipi oleh fragmne DNA dari luar (Lodish,
2000).
Menurut Ojo (2009), plasmid didistribusi secara luas pada seluruh prokariota
dengan ukuran bervariasi dari

1 x 106 D sampai ukuran 200 x 106 D. Plasmid

adalah materi genetik otonom yang dapat bereplikasi secara independen dari
kromosom utama serta dapat dipisahkan secara fisik dari kromosom. Plasmid
umumnya bersifat tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup
individu bakteri, tetapi sering menyandikan sifat tambahan untuk sel, seperti untuk
resistensi terhadap antibiotik dan aktifitas metabolit. Plasmid bakteri sebagian besar
berbentuk dsDNA sirkuler yang ditutup secara kovalen di masing-masing untai
(Royston, 1972).
Dewasa ini telah berkembang teknologi DNA rekombinan. Teknologi tersebut
dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya
memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar.
Salah satu teknik yang digunakan adalah teknik restriksi DNA. Molekul DNA

rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat
tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan
DNA kromosom. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut
endonuklease restriksi. Selanjutnya vektor yang telah direstriksi akan disambung
dengan potongan DNA menggunakan enzim ligasi. Penemuan tentang teknologi
DNA rekombinan memungkinkan pengisolasian individual gen untuk dimanipulasi
serta dipindahkan dari satu organisme ke organisme lain atau disebut dengan
transformasi (Muladno, 2002).
Menurut Mizawarti (2003), kloning merupakan suatu prosedur untuk
memperoleh replika yang dapat sama dari sel atau organisme tunggal. Kloning
dilakukan

dengan

mentransformasikan

atau

memasukkan

fragmen

DNA

rekombinan dari penggabungan fragmen DNA dengan vektor, biasanya adalah


plasmid, ke dalam sel kompeten atau sel bakteri. Sel bakteri yang banyak
digunakan sebagai sel kompeten dalam kloning adalah E. coli DH5 yang
merupakan salah satu jenis E. coli yang telah 20 mengalami rekayasa sehingga
mampu mengenali gen bla (-laktamase) sebagai penanda resistensi ampisilin
(Wibowo, 2002).
Di dalam biologi molekuler, terdapat gen pelapor yang berfungsi untuk
melaporkan apakah suatu transformasi dapat berjalan atau tidak. Untuk proses
eksperimen rekayasa genetika, konfirmasi transformasi dan ekpresi suatu gen asing
ke dalam sel inang sangatlah penting. Bagi para peneliti sangatlah penting untuk
dapat mengetahui dengan cepat apakah proses transformasi telah berlangsung bik
atau tidak, dan apakah gen target dapat diekspresikan tanpa masalah. Dari itu di
dalam biologi molekuler dikenal adanya gen pelapor yaitu gen yang dapat berperan
sebagai indikasi keberhasilan upaya kloning (Koerniati, 2012).
Oleh karena itu konstruksi suatu plasmid dinilai sebagai hal yang cukup
penting dalam rekayasa genetika karena dengan mengkonstruksi plasmid tertentu
kita dapat mendapatkan suatu plasmid yang memiliki karakter tertentu dengan sifat
yang kita inginkan untuk dapat dipindahkan dari organisme satu ke organisme lain
dengan cepat dan efisien. Berdasarkan hal tersebut, praktikum ini bertujuan untuk
mempelajari teknik konstruksi plasmid serta transformasi bakteri. Plasmid yang
digunakan pada praktikum ini adalah pGEM-T Easy yang berasal dari

bakteri Escherichia coli. Vektor ini berukuran 3018 pb (pasang basa) dan memiliki
poly A/T (AAAAAAAA/TTTTTTTT) (Promega, 2006). Sedangkan teknik
transformasi terdilakukan dengan memasukkan vektor kloning (pGEM-T Easy yang
mengandung gen SL16) dan vektor ekspresi (pGEM-T Easy yang mengandung gen
pGLO) selanjutnya ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli DH5 (kompeten).
2. Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui dan mempelajari teknik isolasi
plasmid, restriksi plasmid, pembuatan sel kompeten serta transformasi bakteri.
Selain itu dapat membedakan hasil ekspresi antara sel yang telah disisipi vektor
kloning (mengandung gen SL16) dengan vektor ekspresi (mengandung gen pGLO).
METODOLOGI
1. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum acara isolasi plasmid dilakukan pada tanggal 17 dan 24 Februari
2016, sedangkan pembuatan sel kompeten dan transformasi pada tanggal 2
Maret 2016. Seluruh kegiatan dilakukan di Laboratorium Biorin Pusat Antar
Universitas IPB.
2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu collection tube, tube PCR,
mikropipet (ukuran 2P, 20P, 200P dan 1000P) dan tip, erlenmeyer, setrifuge,
inkubator, pengering vakum, vortex, alat spin down, Thermocycler, heat block,
timbangan, hot plate, comb, cetakan agar, dan gel doc.
Bahan yang digunakan pada praktikum antara lain kultur Escherichia coli
yang mengandung pGEM-T Easy, kultur Escherichia coli DH5, vektor kloning
pSL16, vektor ekspresi pGLO, media LB dan ampisilin, larutan A (suspensi),
larutan B (lisis solution), larutan C (neutralizing), Phenol Chlorofom
Isoamilalcohol (PCI), NaOAc (2M; pH 5,2), EtOH absolut dan 70%, ddH 2O,
RNAse, enzim EcoR1, agarose, buffer TAE 1 x, buffer TFB, DMSO, dan
arabinosa.
3. Cara Kerja

3. 1. Isolasi Plasmid
Isolasi plasmid dilakukan dengan metode ABC. Sebanyak 1,5 mL kultur E. coli
yang mengandung plasmid pGEM-T Easy pembawa gen G disentrifugasi dengan
kecepatan 4000 rpm selama 15 menit pada suhu ruang. Supernatan dibuang, pelet
ditambahi dengan 250 L solution A, dihomogenkan dengan dibolak-balik,
selanjutnya ditambahi sebanyak 250 L solution B, tube dibolak-balik dan di
tambahi 250 L solution C, tube dibolak-balik kembali. Tube yang berisi campuran
pellet dengan solution ABC disentrifugasi kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit
pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dipindah ke tube baru, ditambahi
NaOAC sebanyak 0,1 x vol dan EtOH absolut sebanyak 2 x vol. Tube yang berisi
campuran supernatan, NaOAC dan EtOH di masukkan dalam freezer selama 2 jam.
Kemudian di sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 25 menit pada suhu
4C, pellet yang terbentuk ditambahi dengan 600 L EtOH 70%. Tube di
sentrifugasi kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4C. Supernatan
dibuang dan tube dikeringkan dengan vacuum dryer selama 30 menit di inkubator
suhu 37 C. Tube kering yang mengandung pellet kemudian ditambahi ddH 2O
sebanyak 80 L dan 3 L RNAse, tube diinkubator selama 10 menit pada suhu
37C, kemudian didinginkan di freezer.
3. 2. Elektroforesis Hasil Isolasi
Sebanyak 0,3 gram agarose ditimbang dan dilarutkan dalam 30 mL TAE 1 kali.
Gel agarose tersebut dipanaskan ke dalam microwave, lalu gel didinginkan sampai
suam-suam kuku. Gel dituang ke dalam tangki pencetak yang sudah dilengkapi
dengan comb. Apabila gel sudah padat, comb ditarik dan gel siap untuk digunakan.
Gel diletakkan pada alat elektroforesis dengan posisi yang tepat, sebanyak 5 L
plasmid hasil isolasi ditambah dengan 1 L loading dye, disuspensi di parafilm.
Selanjutnya dipipet dan dimasukkan ke dalam sumuran. Tangki elektroforesis
ditutup dan diatur voltase dan waktunya. Gel di stainning di dalam larutan EtBr
selama 15 menit, kemudian direndamdlam air selama 10 menit. gel tersebut
diletakkan pada gel doc untuk di cek hasil elektroforesisnya.
3. 3. Restriksi dan Ligasi

Restriksi dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi EcoR1 (5 U/L tiap


reaksi) dengan komposisi reaksi pemotongan atau digest pada tabel 1. Campuran
reaksi (tabel 1) dimasukkan ke dalam collection tube dan diinkubasi pada suhu
37C selama semalam. Hasil restriksi diketahui menggunakan elektroforesis.
Tabel 1. Komposisi digest dengan enzim EcoR1 untuk 1 kali reaksi

Komposisi

Jumlah

DNA SL16

3 L

EcoR1

0.5 L

Buffer EcoR1 10x

2 L

ddH2O

14.5 L

Total Reaksi

20 L

3. 4. Pembuatan Kompeten sel


Pembuatan sel kompeten dilakukan berdasarkan metode Sambrook dkk. (1989).
Kultur E.coli DH5 diinkubasi semalam pada suhu 37 C. Sebanyak 0,3 mL
subkultur E.coli ditumbuhkan pada media LB cair kemudian diinkubasi kembali
pada shaker incubator suhu 37 C selama 3 jam. Pertumbuhan sel dipantau melalui
pembacaan densitas optik (OD) pada panjang gelombang 600 nm (OD600) hingga
mencapai angka 0,4-0,6 dengan spektrofotometer.
Sebanyak 1,5 mL hasil subkultur E.coli dipindahkan pada collection tube dan
diinkubasi pada es selama 10 menit. tabung kemudian disentrifugasi selama 10
menit pada kecepatan 5000 rpm, suhu 4 C. Pellet yang terbentuk ditambahi dengan
495 L buffer TFB (Transformation Buffer) kemudian diinkubasi dalam es selama
10 menit. Tube disentrifugasi kembali dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit
pada suhu 4 C. Pelet kemudian diresuspensi dalam 41,25 L buffer TFB ( x
buffer TFB) dan 3,3 L larutan DMSO (8% x buffer TFB), lalu diinkubasi dalam
es selama 10 menit.
3. 5. Transformasi
Proses transformasi dilakukan berdasarkan Sambrook dkk. (1989). Sebanyak
50 L sel kompeten dicampur 3 L vektor kloning (pSL16) atau 5 L vektor
ekspresi (pGLO) dan diinkubasi dalam es selama 25 menit. Proses heat shock

dilakukan pada suhu 42 C selama 45 detik menggunakan heatblock dan tabung


langsung dimasukkan dala es selama 5 menit. sel kemudian dipulihkan dengan
menambahkan 100 L medium Yeast Tripton atau medium LB cair dan diinkubasi
pada shaker pada suhu 37 C selama 20 menit dengan kecepatan 250 rpm.
Selanjutnya ditambahi dengan 50 L arabinosa untuk vektor ekspresi pGLO.
Seluruh campuran kemudian ditumbuhkan dalam media LB padat yang
mengandung antibiotik ampisilin dan diinkubasi selama semalam pada suhu 37C.
Selain itu dibuat kontrol positif dan negatif. Kontrol positif adalah bakteri E.
coli DH5 (tidak mengandung plasmid) yang ditumbuhkan pada medium LB tanpa
antibiotik sedangkan kontrol negatif adalah bakteri E. coli DH5 (tidak
mengandung plasmid) yang ditumbuhkan pada medium LB dengan antibiotik
(ampisilin), kedua kontrol diinkubasi selama semalam pada suhu 37C. Koloni
yang terbentuk diamati pada hari selanjutnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Isolasi Plasmid
Pada praktikum ini dilakukan isolasi plasmid pGEM-T Easy yang mengandung
gen G

pada E. coli DH5 . Inti dari isolasi plasmid adalah menghancurkan

membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar sehingga didapat DNA
kromosomal serta DNA ekstrakromosomal (plasmid). Dalam proses mengisolasi
plasmid dari bakteri, ada tiga tahap penting yang dilakukan, yaitu melisis membran
sel bakteri, ektraksi DNA, pengendapan DNA.

Gambar 1. Tahapan lisis sel dan penghilangan debris sel pada isolasi plasmid

Praktikum ini menggunakan metode ABC dalam melakukan isolasi plasmid


dimana digunakan larutan A, larutan B, dan larutan C. Pada tahap pertama larutan A

mengandung Tris Cl, EDTA dan glukosa untuk meresuspensi membran sel bakteri.
EDTA akan mengikat ion logam dan glukosa akan membuat larutan menjadi
hipertonis, sehingga sel mulai menggembung, integritas membran mulai terganggu.
Proses lisis diawali dengan pemberian larutan B yang mengandung SDS + NaOH
dimana SDS (Sodium Dodesil Sulphate) merupakan detergen yang berperan untuk
melisis dinding atau membtan sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH
sebagai larutah basa berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA. Terjadinya lisis
ditandai dengan terbentuknya lendir.
Tahap selanjutnya adalah penambahan larutan C yang terdiri dari CH 3COOK
dan asam asetat glasial yaitu untuk menciptakan kondisi netral yang sebelumnya
basa. Maka dilakukan pemisahan dengan larutan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl
Alcohol) yang berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organk dan komponen lipid.
Proses ekstraksi dengan PCI (25:24:1) akan memberikan hasil terbentuknya 3 fase,
yaitu fase atas (DNA dan RNA), fase tengah (protein) dan fase bawah ( fenolkloroform). Ekstraksi dilakukan karena terdapat senyawa selain DNA plasmid
seperti RNA, protein, senyawa organik dan beberapa komponen lipid. Penambahan
etanol 70% berfungsi untuk mengikat air. Selanjutnya ditambah dengan RNAse
untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen RNA.

Open sirkuler
Linier
Superheliks
Gambar 2. Elektroforegram hasil isolasi plasmid dari E.coli yang mengandung plasmid
pS16 pembawa gen G dengan marker 2 dan 3.
Hasil elektroforegram menujukkan bahwa pita plasmid terlihat pada sebagian

kelompok yaitu kelompok 5, 8. 11 dan 12 yang artinya isolasi plasmid telah


berhasil. Untuk kelompok lain tidak terlihat adanya pita plasmid yang menandakan
bahwa isolasi plasmid tidak berhasil. Hal tersebut dimungkinkan karena pelet yang
terbentuk kurang banyak sehingga plasmid tidak diperoleh. Pada praktikum ini

tidak terjadi kesalahan pada proses running elektroforesis karena marker yang
dipakai terlihat jelas.
Dari hasil elektroforesis dari kelompok yang berhasil, DNA plasmid yang
terbentuk ada beberapa macam karena terbentuknya lebih dari 1 pita. Kemungkinan
pita-pita tersebut adalah DNA plasmid dimana plasmid berbentuk superheliks (ccc
= Covalently Closed Circular) yang bermigrasi paling jauh dari sumur, pita DNA
plasmid yang berada di tengah berbentuk linear, sedangkan yang bermigrasi paling
dekat dengan sumur adalah pita DNA plasmid yang berbentuk open sirkuler.
Semakin kompak suatu DNA maka akan bermigrasi semakin cepat sehingga pada
saat yang bersamaan akan bermigrasi lebih jauh dibandingkan dengan bentuk yang
kurang kompak. DNA superheliks lebih kompak dibandingkan dengan DNA
plasmid dalam keadaan open sirkuler atau linier.
2. Restriksi Plasmid
Enzim restriksi merupakan endonuklease yang memecah ikatan fosfodiester
pada situs pengenalan spesifik (Wong, 1997). Pada praktikum ini digunakan enzim
restriksi EcoR1 yang memiliki tipe pemotongan sticky end. EcoRI yang ditemukan
pada strain Escherichia coli yang mengenali urutan DNA 5-GAATTC-3.

Plasmid pGEMT Easy


Gen SL16

Gambar 3. Elektroforegram hasil restriksi plasmid pSL16 menggunakan enzim EcoR1;


marker DNA ladder 1 kb (M).

Hasil elektroforegram menunjukkan bahwa plasmid pSL16 yang disediakan


berhasil dipotong oleh enzim retriksi EcoR1. DNA plasmid yang merupakan DNA
sirkuler telah berhasil dipotong menjadi DNA linier yang ditunjukkan dengan
munculnya 2 pita pada sumuran.

Hasil pemotongan plasmid pSL16 yang mengandung gen G dengan enzim


restriksi EcoR1 menghasilkan 2 pita dengan ukuran basa yang berbeda. Fragmen
pertama berukuran 3000 pb dan fragmen kedua berukuran 1500 pb.Pita yang
berukuran 3000 pb merupakan fragmen dari plasmid pGEM-T Easy sedangkan
fragmen DNA yang berukuran 1500 pb merupakan fragmen dari gen SL16.
Berdasarkan hasil elektroforegram, dapat diketahui bahwa EcoRI memiliki dua
situs pengenalan restriksi dimana satu situs pengenalan restriksi terdapat pada
tempat yang sama.

Gambar 4. Circle Map vektor pGEM-T Easy (Promega, 2011)


Pada gambar terlihat bahwa vektor linier pGEM-T Easy memiliki beberapa
situs enzim restriksi yang spesifik dapat melepas insert yang masuk, baik dengan
menggunakan 1 enzim (single digest) maupun 2 enzim. Pada praktikum ini
melakukan single digest dengan enzim restriksi EcoR1.
Dewasa ini sering digunakan plasmid pGEM-T Easy dalam teknologi DNA
rekombinan. Plasmid ini merupakan suatu vektor linear yang memiliki tambahan
nukleotida T pada kedua ujung 3 atau ujung T overhang. Plasmid ini memiliki
ukuran 3015 pasang basa dengan dua promotor yaitu SP6 RNA polimerase
promotor dan T7 TNA polimerase promotor. Plasmid pGEM-T Easy memiliki gen
lac-Z yang dapat menyandi enzim

-galkturosidase yang dapat merubah

Isopropil- -galaktopiranosida (IPTG) dan 5-bromo-4-kloro-3-indolyl- galaktopiranosida (X-gal) yang ditambahkan menjadi berwarna biru. MCS
(Multiple Cloning Site) pada plasmid merupakan bagian dari lac-Z. Apabila gen
lac-Z tersisipi oleh fragmen DNA lain, maka akan merusak susunan basa gen lac-Z

sehingga tidak tersisipi sehingga tidak dapat diekspresikan dan menyebabkan


koloni berwarna putih (Sambrook, 1989).
3. Pembuatan Sel Kompeten
Tahap ini menggunakan kultur E.coli DH5 untuk membuat sel kompeten.
Pembuatan sel kompeten diawali dengan pencampuran subkultur E.coli DH5 OD
(0,4-0,6) dengan TFB (Transformation Buffer) yang mengandung CaCl2. Larutan
TFB berfungsi untuk mengganggu keseimbangan kalsium dalam membran
sehingga sel bakteri sehingga membran berhasil terbuka dan DNA insert dapat
masuk. Selain TFB, digunakan juga larutan DMSO (Dimetyl Sulfoksida) yang
merupakan pelarut polaritas aprotik yang efektif melarutkan berbagai bahan kimia
organik dan anorganik. Menurut Zhiming (2005), penambahan DMSO dapat
meningkatkan efisiensi transformasi.
Sel kompeten adalah sel (dalam praktikum ini E. coli DH5) yang telah
mengalami perubahan dalam hal tingkat permeabilitasnya. Artinya, membran sel
dari E. coli tersebut mampu dilewati oleh plasmid DNA, sehingga DNA yang telah
masuk tersebut akan bertambah dan bertambah seiring pembelahan sel mikroba
tersebut.
4. Transformasi
Pada praktikum ini digunakan E. coli DH5 sebagai sel inang, merupakan
strain umum yang sering digunakan untuk tujuan kloning karena menghasilkan
efisiensi transformasi yang cukup tinggi dan stabil. Selain itu pada strain tersebut
memungkinkan dilakukan seleksi koloni biru-putih karena kemampuannya
melakukan -complementation dimana subunit dari enzim

-galakturosidase

yang disandi oleh gen lac-Z yang mengalami transkripsi (Sambrook, 2001).
Proses transformasi dimulai dengan pencampuran sel kompeten dengan hasil
ligasi. Praktikum ini menggunakan dua perlakuan. Pertama, sel kompeten
diligasikan dengan vektor untuk kloning (pGeM-T Easy + gen SL16) dan yang
kedua sel kompeten diligasikan dengan vektor untuk ekspresi (pGEM-T Easy +
pGLO). Teknik transformasi yang digunakan adalah kejut panas (heat shock) yaitu
dilakukan dengan cara meletakkan campuran tersebut pada suhu 42C selama 45
detik dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu dingin selama 10 menit untuk
meningkatkan efisiensi dari transformasi (Singh, 2010).
Saat diberi kejut panas diharapkan materi genetik yang berada di sekitar sel
kompeten akan melekat pada membran sel kompeten tersebut. Perlakuan kejut
panas diketahui bertujuan untuk membuka pori pada dinding sel bakteri. Inkubasi

dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel. Penambahan


media LB setelah perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan
nutrisi dari bakteri setelah mengalami perlakuan yang ekstrem.
Untuk mengetahui sel yang telah mengalami transformasi maka dilakukan
seleksi transforman dengan memanfaatkan sifat yang dibawa sebagai marka seleksi.
Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung ampisilin. Dengan adanya
ampisilin, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang
telah memasukkan plasmid. Inkubasi selama 18 jam akan menumbuhkan koloni
bakteri yang berasal dari sel tunggal. Semua bakteri yang tumbuh dalam koloni
tersebut akan memiliki sifat yang sama sebagai bakteri transforman.
Untuk itu pada praktikum ini dibuat kontrol positif dan negatif untuk seleksi
transforman sekaligus memastikan bahwa medium yang dipakai benar-benar
berfungsi. Untuk kontrol positif dibuat dengan menumbuhkan E. coli DH5 tanpa
plasmid pada medium LB tanpa ampisilin. Sedangkan untuk kontrol negatif
dilakukan dengan menumbuhkan Kontrol E. coli DH5 tanpa plasmid pada
medium LB dengan ampisilin. Untuk transformasi pada vektor pGLO dilakukan
penambahan arabinosa sebagai substrat yang nantinya ketika koloni tumbuh, koloni
tersebut akan berpendar di bawah sinar uv.
Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan
sel non-transforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid. Hasil
dari penumbuhan hasil transforman pada media LB baik untuk kontrol +, kontrol -,
ligasi dengan pSL16 maupun ligasi dengan pGLO dapat dilihat pada gambar 4.

Kontrol positif

Kontrol negatif

Vektor pGLO

Vektor pSL16

Gambar 4. Hasil penumbuhan kontrol + dan transforman pada medium LB + ampisilin dan
kontrol pada medium LB tanpa ampisilin.

Berdasarkan hasil tersebut menandakan proses transformasi berhasil karena


terdapat koloni sel yang tumbuh. Koloni yang tumbuh adalah sel yang telah
dimasuki oleh vektor plasmid rekombinan (hasil ligasi). Pada praktikum ini
digunakan 2 macam vektor rekombinan. Pertama, plasmid pGEM-T Easy yang
telah diligasikan dengan gen SL16 yang selanjutnya disebut sebagai vektor kloning.
Kedua adalah pGEM-T Easy yang telah diligasikan dengan pGLO yang selanjutnya
disebut sebagai vektor ekspresi.
Pada kontrol positif menandakan koloni non-transforman (tidak tersisipi
plasmid) tumbuh pada medium LB tanpa ampisilin. Sebaliknya untuk kontrol
negatif koloni non-transforman (tidak tersisipi plasmid) tidak tumbuh pada medium
LB dengan ampisilin karena sel ini tidak memiliki karakter resisten terhadap
antibiotik yang dibawa oleh plasmid. Hasil tersebut sudah sesuai dengan teori yang
sudah dijelaskan sebelumnya.
Untuk koloni transforman (yang mengandung plasmid) menunjukkan
keberhasilan. Pertama, transforman pSL16 tumbuh pada medium LB+ampisilin.
Begitu juga dengan transforman pGLO tumbuh pada medium LB+ampisilin. Selain
itu untuk pGLO menunjukkan koloni yang berpendar di bawah sinar uv karena
pGLO memproduksi gfp yang memanfaatkan substrat arabinosa sehingga mampu
berpendar.
Tabel 2. Perbedaan koloni sel hasil transformasi yang terbentuk

Plate
Kontrol E. coli DH5 tanpa
plasmid
Kontrol E. coli DH5 tanpa
plasmid
E. coli DH5 mengandung

Media
LB + ampisilin

Koloni
-

LB

Tumbuh

LB + ampisilin

Tumbuh tidak berpendar

pSL16
E. coli
pGLO

DH5

mengandung LB + ampisilin

pada uv transluminator
Tumbuh dan berpendar
pada uv transluminator

Gfp adalah sekelompok protein dengan struktur mirip satu sama lain yang
berpendar hijau apabila disorot/dipapar dengan cahaya biru. Protein ini pertama kali
diisolasi dari ubur-ubur Aequorea victoria yang mampu memendarkan cahaya hijau
(pGLOTM, 2014).
Pada praktikum ini digunakan vektor pGLO untuk ekspresi. Vektor ekspresi
merupakan vektor yang mana disamping dapat bereplikasi sendiri juga
mengandung sinyal-sinyal ekspresi, sehingga gen yang di klon juga akan
ditranskripsi menjadi mRNA dan kemudian ditranslasi menjadi protein. Vektor
ekspresi memungkinkan untuk produksi protein hewan, manusia atau tanaman di
dalam bakteri. Tiga sinyal ekspresi yang paling penting adalah : (1) Promotor
transkripsi, (2) terminator transkripsi, dan (3) tempat pengikatan ribosom. Vektor
untuk kloning pSL16 merupakan vektor yang hanya mampu melakukan replikasi
sendiri tetapi tidak mengandung sinyal-sinyal ekspresi.
SIMPULAN
1. Hasil isolasi plasmid berhasil dilakukan pada kelompok 5, 8, 11 dan 12 dan
terbentuk 3 pita hasil isolat. Dari hasil elektroforegram menunjukkan bahwa
terdapat 3 bentuk plasmid yaitu open sirkuler (pita paling atas), linier (pita yang
di tengah) dan superheliks (pita paling bawah) dengan jarak migrasi yang
berbeda.
2. Hasil restriksi pSL16 (pGEM-T Easy + gen SL16) dengan enzim EcoR1
diperoleh 2 pita dengan ukuran berbeda. Pita pertama merupakan pita dari
plasmid pGEM-T Easy yang berukuran 3000 pb, sedangkan pita kedua
berukuran 1500 pb yang merupakan pita dari gen SL16. Dari sini dapat
diketahui bahwa EcoRI memiliki dua situs pengenalan restriksi dimana satu situs
pengenalan restriksi terdapat pada tempat yang sama.
3. Dari hasil kontrol positif menunjukkan bahwa koloni non-transforman (tidak
tersisipi plasmid) tumbuh pada medium LB tanpa ampisilin. Pada Kontrol
negatif koloni non-transforman (tidak tersisipi plasmid) tidak tumbuh pada

medium LB + ampisilin karena sel ini tidak memiliki karakter resisten terhadap
antibiotik yang dibawa oleh plasmid.
4. Hasil transforman pada sel yang tersisipi vektor untuk kloning (pSL16) dan
vektor untuk ekspresi (pGLO) menunjukkan hasil yang positif karena koloni
tumbuh pada media LB+ampisilin. Untuk koloni yang tersisipi pGLO, berpendar
di bawah sinar uv karena mengandung gen gfp yang mampu memanfaatkan
substrat arabinosa.

DAFTAR PUSTAKA
Chino, A., Kenji Watanabe, dan Hisao Moriya. 2010. Plasmid construction using
recombination activity in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. PloS
ONE 5(3).
Koerniati, S., dan Hani Widhianata. 2012. Construction and transformation of HVA1
gene expression vector into Indonesia elite rice varieties. AgroBiogen 8(2): 5461.
Lodish, H., Arnold B., S. Lawrence Z., Paul M., David B. James D. 2000. Molecular
cell biology. Wh Freeman Company.
Mizawarti. 2003. Penerapan teknik-teknik kloning gen dalam kehidupan manusia.
Perpustakaan Digital Universitas Sumatra Utara.
Muladno. 2002. Seputar teknologi rekayasa genetika. Bogor: Pustaka Wirra Usaha
Muda.
Ojo, O. Abayomi dan B. A. Oso. 2009. Isolation of plasmid-DNA from synthetic
detergent degraders in wastewater from a tropical environment. African Journal
of Microbiology Research 3(3); 123-127.

pGLOTM

Bacterial

Transformation.

2014.

Advanced

Biology

with

Vernier.

(www.vernier.com).
Promega. 2006. Life Science Catalog. Promega Corporation. USA: Woods Hollow Road
Madison. (www.promega.com)
Royston C. Clowes. 1972. Molecular structure of bacterial plasmid. Bacteriological
Reviews 36(3): 361-405.
Sambrook, J., E. F Fritsch & T. Manniatis. 1989. Molecular cloning a laboratory
manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbour laboratory Press.
Sambrook, J. Russel, David W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd
Edition. Vol. 1,2,3. New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Stanfield WD, Jaime SC, Raul JC. (1996). Molecular and cell biology. New york: Mc
Graw-Hill.
Singh, M., A. Yadav., X, Ma dan E. Amoah. 2010. Plasmid DNA transformation in
Escherichia coli: Effect of heat shock temperature, duration, and cold incubation
of CaCl2 treated cells. International Journal of Biotechnology and Biochemistry
6(4): 561-568.
Wibowo, Mangunwardoyo. Transformasi fragmen DNA kromosom Xanthomonas
campestris ke dalam Escherichia coli. MAKARA 6(1).
Wong, D, W. S. 1997. The ABC of gene cloning. New York: International Thomson
Publishing.
Zhiming, Tu et al. 2005. An improved system for competent cell preparation and high
efficiency plasmid transformation using different Escherichia coli strains.
Electronic Journal of Biotechnology 8(1).