Metode Penelitian

Penelitian ini direncanakan dilakukan dengan tiga tahapan yaitu tahap perisapan, tahap
pengujian dan tahap pengujian. Variabel yang diamati antara lain konsentrasi amonia,
konsentrasi nitrit dan konsentrasi nitrat.

1. Tahap Persiapan
Persiapan Isolat. Penyiapan strain isolat mikroba dengan Menumbuhkan isolat
Pseudomonas sp. LS3K di tumbuhkan pada medium agar yang selanjutnya di kulturisasi pada
medium cair dengan penambahan sumber nitrogen berupa amonium sulfat dan sodium nitrit
dan sodium nitrat selama 4 hari pada suhu ruang. Selama kulturisasi dilakukan pengamatan
terhadap grafik pertumbuhan bakteri (CFU).
Pembuatan Basal Medium (BM) mengikuti zhang et al. (2011) menggunakan 50 ml
larutan trace element yang dibuat dengan komposisi per liternya antara lain: 5 g K 2HPO4, 2,5 g
MgSO4.7H2O, 2,5 g NaCl, 0,05 g MnSO4.4H2O, 0,05 g FeSO4. 7H2O yang di buat dengan pH
7,2.

2. Tahap Pelaksanaan
Pembuatan Medium Nitrifikasi (MN) yang dibuat dari 50 ml BM, Amonium sulfat dan
aquadest. Pengujian kemampuan nitrifikasi. Untuk mengetahui bagaimana pengaruh sumber
karbon dan rasio C/N terhadap efisiensi proses nitrifikasi isolat Pseudomonas sp. LS3K, maka
dilakukan faktor percobaan tunggal pada sebuah reaktor yang berisi MN dengan faktor sumber
karbon (sodium citrate dan glukosa) dengan rasio C/N menggunakan masing-masing adalah 5,
10, 15, dan 20 berdasarkan perbandingan molekul C dan N (amonium sulfat : sodium citrate
dan amonium sulfat : glukosa). Semua percobaan di atas dilakukan 3 ulangan dengan inokulasi
1 % (v/v) dalam 300 mL. Selama 96 jam inkubasi pada suhu ruang, kultur sampel secara

periodik

konsentrasi

amonium

(NH4+-N),

nitrit

(NO2+-N),

nitrat

(NO3+-N)

dan

grafik

pertumbuhanya (CFU). Bila terjadi penurunan konsentrasi amonium maka bisa diestimasikan
bahwa amonium telah dioksidasi oleh bakteri dan telah terjadi proses nitrifikasi.
Pengujian kemampuan denitrifikasi
Pembuatan Medium Denitrifikasi (MD) yang dibuat dari 50 ml larutan BM ditambah
sodium nitrat dan aquadest. Pengujian karakteristik kemampuan denitrifikasi secara
aerobik. Untuk mengetahui bagaimana pengaruh sumber karbon dan rasio C/N terhadap
efisiensi proses denitrifikasi isolat Pseudomonas sp. LS3K, maka dilakukan faktor percobaan
tunggal pada sebuah reaktor yang berisi MD dengan faktor sumber karbon (sodium citrate dan
glukosa) dengan rasio C/N menggunakan masing-masing adalah 5, 10, 15, dan 20 berdasarkan
perbandingan molekul C dan N (sodium nitrat : sodium citrate dan sodium nitrat : glukosa).
Semua percobaan di atas dilakukan 3 ulangan dengan inokulasi 1 % (v/v) dalam 300 mL.
Selama 96 jam inkubasi pada suhu ruang, kultur sampel secara periodik konsentrasi amonium
(NH4+-N), nitrit (NO2+-N), nitrat (NO3+-N) dan grafik pertumbuhanya (CFU). Bila terjadi
penurunan konsentrasi nitrat maka bisa diestimasikan bahwa nitrat telah direduksi oleh bakteri
dan telah terjadi proses denitrifikasi.
Pengujian kemampuan nitrifikasi dan denitrifikasi aerobik.
Pembuatan Medium Nitrifikasi dan Denitrifikasi (MND) yang dibuat dengan 50 ml
larutan BM ditambah amonium sulfat, sodium nitrat dan aquadest. Pengujian karakteristik
kemampuan nitrifikasi dan denitrifikasi secara aerobik. Untuk mengetahui bagaimana
pengaruh sumber karbon dan rasio C/N terhadap efisiensi proses nitrifikasi

isolat

Pseudomonas sp. LS3K, maka dilakukan faktor percobaan tunggal pada sebuah reaktor yang
berisi MND faktor sumber karbon (sodium citrate dan glukosa) dengan faktor rasio C/N
menggunakan masing-masing adalah 5, 10, 15, dan 20 berdasarkan perbandingan molekul C
dan N (amonium sulfat + sodium nitrat : sodium citrate dan amonium sulfat + sodium nitrat :
glukosa). Semua percobaan di atas dilakukan 3 ulangan dengan inokulasi 1 % (v/v) dalam 300

mL. Selama 96 jam inkubasi pada suhu ruang, kultur sampel secara periodik konsentrasi
amonium (NH4+-N), nitrit (NO2+-N), nitrat (NO3+-N) dan grafik pertumbuhanya (CFU).
Aplikasi pada ekskreta ayam petelur.
Pembuatan media ekskreta. 150 g ekstkreta (yang terlebih dahulu dihitung rasio C/Nnya)
dicampur dengan 150 ml aquadest, diaduk sampai homogen dan dimasukan ke dalam
erlenmayer (500 ml) kemudian dilakukan sterilisasi dengan menggunakan autoklaf. Pengujian
nitrifikasi dan denitrifikasi secara aerob. Penambahan jenis karbon dan rasio C/N larutan
ekskreta di buat berdasarkan data hasil sumber karbon dan rasio C/N yang terbaik pada
pengujian nitrifikasi dan denitrifikasi secara aerobik. Larutan isolate mikroba ditambahkan 1%
(v/v). diinkubasi dan diaerasi selama 96 jam dan dilakukan pengamatan setiap 6 jam kultur
sampel secara periodik diamati konsentrasi amonium (NH4+-N), nitrit (NO2+-N),nitrat (NO3+-N)
dan grafik pertumbuhanya (CFU).

3. Metode Perhitungan
Konsentrasi Amonium. Pengukuran kadar amonium menggunakan metode nessler
(APHA, 1998). Prinsip percobaan: pereaksi Nessler bila bereaksi dengan amonium dalam
larutan basa akan membentuk dispersi koloid yang berwarna kuning coklat. Intensitas warna
yang akan terjadi berbanding lurus dengan konsentrasi amonium. Warna yang terbentuk diukur
secara berkala menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 425 nm.
Konsentrasi Nitrat. Pengukuran konsentrasi nitrat dilakukan dengan menggunakan
metode Brusin (APHA 1998). Prinsip dari metode brushin adalah pembentukan gugus kromofor
(N-NO3) yang berwarna kuning oleh senyawa nirat dan larutan brushin (C23H25N2O4) dalam
kondisi asam pekat sehingga bersifat elektrofilik inaktiv. Intensitas warna kuning yang akan
terukur pada spektrofotometer berbanding lurus dengan konsentrasi nitrat. Semakin tinggi
intensitas warna kuning yang terukur maka akan semakin banyak atau tinggi pula ion nitrat

yang

terbentuk

menjadi

senyawa

kompleks.

Warna

yang

terbentuk

diukur

secara

spektrofotometer pada panjang gelombang 410 nm.

Konsentrasi Nitrit. Pengukuran konsentrasi nitrat dilakukan dengan menggunakan
metode NED (N-(1-naftil) etilendiamin dihidroklorida) (06-6989.9-2004). Prinsip pengukuran
kadar nitrit dengan metode NED (N-(1-naftil) etilendiamin dihidroklorida) adalah berdasarkan
pembentukan warna kemerah-merahan yang terjadi karena adanya reaksi antara nitrit ((N-NO2)
dengan asam sulfanilat dan N-(1-naftil) etilendiamin dihidroklorida pada kisaran pH 2,0 sampai
5,2. Warna yang terbentuk diukur secara spektrofotometer pada panjang gelombang 453 nm.
Pengukuran Jumlah Koloni (Colony Forming Unit / CFU/ml). Pengukuran jumlah koloni
di hitung menggunakan metode CFU (Waluyo, 2008). Langkah yang dilakukan dengan cara
diambil isolat yang telah ditumbuhkan dalam 100ml stock medium cair dengan penambahan
(NH4)2SO4 dengan kadar yang berbeda yaitu 0%, 2,5%, 5%, 7,5% dan 10% dari shaker. Isolat
diambil sebanyak 1ml untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam 9 ml aquades steril sebagai
pengenceran 10-1 dan dilakukan sampai 10-3 kemudian divortex. Selanjutnya diambil sebanyak
0,1ml dari setiap pengenceran kemudian ditumbuhkan dalam medium agardan diratakan
menggunakan decglaski. Jumlah koloni dihitung dengan manual yang dapat tumbuh.

Analisis Data
Penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimental dengan menggunakan rancangan
acak lengkap (RAL) pola searah dengan perlakuan pertama menggunakan sumber karbon
sodium citrate, perlakuan kedua menggunakan sumber karbon glukosa dan aplikasinya pada
ekskreta ayam petelur. Masingmasing perlakuan dilakukan replikasi sebanyak tiga kali
pengulangan dengan waktu pengamatan setiap 6 jam selama 96 jam . Data hasil penelitian
dianalisis statistik menggunakan analisis varians (ANOVA) dan apabila terdapat perbedaan di
antara nilai rerata perlakuan maka dilanjutkan dengan uji beda Duncans Multiple Range Test
(DMRT) (Steel and Torry, 1995).