BAB I

PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.
Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Pratiwi,S. 2008).
Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu
berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal
yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa
mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain
Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae,
Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose
adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan
bersifat tahan asam sehingga akan digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA).
Penularan oleh bakteri Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan
pernafasan (Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok
Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini
disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama
(carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan
asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam
karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol
fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay, 1994).

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 1

Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang
sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan lilin
dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin
dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam
alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam
akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen blue (Dwidjoseputro, 2005).
Sebagai tenaga analis kesehatan dibutuhkan keterampilan dalam membuat
spesimen yang berguna dalam pemeriksaan spesimen di laboratorium. Bakteri
umumnya memiliki warna yang transparan maka dari itu diperlukan pewarnaan
bakteri agar bentuk dan struktur bakteri dapat terlihat lebih jelas jika diamati
dengan mikroskop cahaya. Hal tersebut yang melatarbelakangi penulis untuk
mengangkat permasalahan ini sebagai masalah yang akan dibahas dalam laporan
praktikum dengan judul Pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA) .

B. TUJUAN PERCOBAAN

Untuk dapat Melihat bentuk (morfologi) dan sifat tahan asam pada dari
bakteri.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 2

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan

sifat-sifat yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hamper tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di suspensikan.
Salah satu cara unutk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah di
identifikasi adalah dengan cara metode pengenceran atau pewarnaan. Hal tersebut
berfungsi untuk mengetahuisifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkaian pengecetan atau pewarnaan (Dwidjoseputro, 2005).
Bakteri juga merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik.
Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan
kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup
sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik
pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah dalam proses
identifikasi bakteri (Pratiwi,S. 2008).
Pengamatan morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, dan warna
koloni. Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam.
Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan
tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus,
sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah
melengkung dan melengkung (Hadioetomo, 1993).
Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di
dalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis
biakan atau pun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil
pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka
penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasi
sebagian mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun
biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media memproduksi tipe
metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test
yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Pratiwi, S. 2008).

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 3

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat

kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop
dengan pembesaran 1.000 X atau lebih. Sel bakteri memiliki panjang yang
beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel
spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1
sampai 0,3 m. Bentuk bakteri bermacam macam yaitu elips, bulat, batang dan
spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat
pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran,
bentuk, susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri
dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar
& Chan, 2007).
Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa
karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun
biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam
yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural.
Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan
larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah
difiksasi,

dinamakan

pewarnaan

sederhana.

Prosedur

pewarnaan

yang

menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba

disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya
mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel.
Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan
pengecatan kapsul ( Pelczar, 2007 ).
Prinsip dasar dari teknik pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara
komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut
kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan
yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram.

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 4

Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial

memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan
metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri
(Volk & Wheeler, 1984).
Pewarnaan diferensial artinya pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu
macam zat warna, seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Sedangkan
pewarnaan khusus artinya pewarnaan yang dipakai untuk mewarnai bagian-bagian
sel atau bakteri tertentu yang sukar diwarnai dengan menggunakan pewarnaan
biasa. Pewarnaan khusus dipakai untuk mewarnai bagian-bagian sel kuman atau
kuman tertentu yang sukar diwarnai (Fardiaz, 1992).
Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal
sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan
pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA)
karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan
pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya
adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat
diisolasi dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika positif
terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain menyerang manusia juga
menyerang hewan seperti marmut, dan kera. Penularannya dapat melalui udara
yang masuk ke saluran pernafasan (Pelczar dan Chan, 1988).
Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan
pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan
pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah
besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan
pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel
terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika
proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam
sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997).

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 5

Mycobacterium

tuberculosis berbentuk

batang

langsing,

lurus

atau

berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non
motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun, sekali
mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat
dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut sebagai
Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang juga memiliki
sifat tahan asam, yaitu spesies Nocardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, dan
protozoa Isospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak
berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini
menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari
antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam dinding sel
mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M.
tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga. Mikobakteria dapat
tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk
tipe pathogen. Sel mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid,
protein, dan polisakarida (Thomas, 1999).
Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang
panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat
(2-8 minggu), suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu normal manusia.
Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg yolk,
serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel adalah bakteri
batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 3 m. Pada media buatan, bentuk kokoid
dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Segera setelah
diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat didekolorisasi oleh alkohol,
tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara umum
dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Media untuk membiakan
mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif. Media selektif
berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi
yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua
media nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 6

dan 7H11), media telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media)
(Jawetz et al., 2001).
Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari
oksidasi

beberapa

senyawa

sederhana.

Penambahan

CO2 meningkatkan

pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan

pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk
menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung tumbuh
lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23C, untuk menghasilkan
pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk cepat asam daripada bentuk
patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada
bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil
tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup selama periode waktu
yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi,
virulensi, temperatur petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan
atau seluler lainnya (Fardiaz, 1992).
Teknik

pewarnaan

Ziehl-Neelsen,

yaitu

dengan

menggunakan

zat

warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada
pemberian

warna

pertama,

yaitu carbol

fuchsin,

BTA

bersifat

mempertahankannya. Carbol fuchsinmerupakan fuksin basa yang dilarutkan

dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan
dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna ke
dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk
melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu
BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama
tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk
menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna
merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol
fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat
warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru
(Lay, 1994).

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 7

Menurut Entjang (2003), pada pewarnaan bakteri dengan metode ZiehlNeelsendapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu :
1.
Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut
bakteri tahan asam (acid fast).
2.
Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri
tidak tahan asam (non acid fast).
Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai
sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang
tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai
menunjukkan warna yang kontras dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan
perbesaran sampai 1000x sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat
yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens (Kurniawati et al., 2005).
Larutan

kimia

yang

digunakan

adalah

alkohol asam

3% , carbol

fuchsin 0,3%, serta methylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai fungsi
antara lain asam alkohol digunakan sebagai peluntur, carbol fuchsin mempunyai
fungsi membuka lapisan lilin agar menjadi lunak sehingga cat dapat menembus
masuk ke dalam sel bakteri M. tuberculosis. Methylen blue berfungsi sebagai cat
lawan dan pada pemberian methylen blue pada bakteri akan tetap berwarna merah
dengan latar belakang biru atau hijau (Jutono dkk., 1980).

Negatif: apabila tidak ditemukan BTA.

Positif: apabila terdapat 1 9 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 1: apabila terdapat 10 90 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 2: apabila terdapat 1 9 BTA / 1 lapang pandang.
Positif 3: apabila terdapat > 10 BTA / 1 lapang pandang

BAB III
METODE PRAKTIKUM

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 8

A. ALAT DAN BAHAN

1. Alat
a. Kaca Preparat hapus dari sputum penderita 1 yang sudah difiksasi.
b. Satu obor kecil yang terdiri dari kapas yang dipintal pada ujung
c.
d.
e.
f.

kawat.
Pipet Tetes 3 buah.
Mikroskop.
Korek api.
Pensil warna (merah,biru, dan ungu).

2. Bahan
a. Satu set pewarnaa Ziehl-Neelsen, yang terdiri dari :
1. Larutan karbol fuchsin
2. Alkohol asam
3. Larutan methylen blue
b. Spiritus.
c. Kertas saring atau tissue.
B. PRINSIP PRAKTIKUM
Adapun prinsip dasar dari pewarnaan ini yaitu berdasarkan pada Dinding
bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus
cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan lilin dan lemak itu
dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin dan lemak
yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam alkohol warna
fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan
mengambil warna biru dari methylen blue.
C. CARA KERJA
1. Letakkan kaca benda tersebut mendatar pada rak pewarnaan dan tuangi dengn
larutan krbol fuchsin sampai seluruh kaca benda tergenang dengan zat warna.
2. Panasi zat warna tersebut sampai menguap, dinginkan dan panasi lagi. Hal
tersebut diulangi sebanyak 3 kalu dalam 10 menit.
3. Cuci dengan air mengalir.
4. Lunturkan dengan alcohol asam 3 %. Pelunturan dilakukan sampai preparat
Nampak berwarna merah muda.
5. Segera cuci dengan air mengalir.
6. Beri zat warna kontras, yaitu larutan methylen blue 0,5%, selama 1 menit.
7. Cuci dengan air mengalir.

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 9

8. Keringkan dengan kertas isap dan lihat dibawah mikroskop dengan

penambahan oil emersi.

BAB IV
HASIL PRAKTIKUM
A. TABEL PENGAMATAN
No.

Bentuk

Sifat BTA

Berwarna

sel

(+/-)

1.

Basil

Merah

2.

Coccus

Ungu

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Warna latar Warna Sel epitel

belakang
dan PMN

Page 10

Biru

Biru Tua

B. GAMBAR
A

BAB V
PEMBAHASAN
Adakalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna,
kemudian dicuci dengan asam encer, maka semua zat warna terhapus. Akan tetapi
ada juga preparat yang tahan asam encer, misalnya bakteri-bakteri TBC dan basilbasil berspora. Maka dapat dikatakan bahwa itu adalah bakteri tahan asam. Untuk
menetukan sifat bakteri yang termasuk bakteri tahan asam dan bakteri tidak tahan
asam harus diwarnai dengan pewarnaan khusus. Pada umumnya, bakteri tahan
asam merupakan bakteri yang lapisan paling luar selnya terdiri dari lapisan lilin,
sehingga menyebabkan zat warna sukar masuk ke dalam sel bakteri.
Hal inilah yang mendasari dilakukannya percobaan pewarnaan bakteri tahan
asam (BTA). Pewarnaan BTA merupakan pewarnaan yang dilakukan untuk
mengidentifikasi Bakteri Tahan Asam. Pewarnaan ini tidak spesifik untuk

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 11

Mycobacterium tuberculosis karena hasil pewarnaan BTA juga akan positif

terhadap genus Mycobacterium lain. Bakteri BTA berwarna merah dan bakteri
non BTA berwarna biru atau ungu.
Pada praktikum kali ini dilakukan pengecetan Bakteri Tahan Asam (BTA) yang
menggunakan tiga jenis cat Ziehl Neelson (ZN) yaitu carbol fuchsin 0,3 %, asalm
alcohol 3 % dan methylene blue 0,5 %. Dalam pengecatan ini digunakan sample
sputum. Sebelum dibuat apusan, objek glass difiksasi untuk menghilangkan lemak
yang menempel pada permukaanya dan untuk menghilangkan kontaminan lain
yang ada pada objek glass. Apusan yang dibuat tidak boleh terlalu tebal agar
bakteri tidak bertumpuk-tumpuk sehingga proses pengamatan bentuk sel bakteri
menjadi lebih mudah, tetapi apusan yang dibuat juga tidak boleh terlalu tipis.
Pewarnaan BTA ini dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Ziehl Neelson
yng menggunakan 3 jenis warna sebagai berikut :
Pada Pewarnaan pertama ini dengan menggunakan zat warna Carbol Fuchsin.
Karbol fuchsin merupakan pewarna dasar, yang mengandung fenol untuk
membantu melarutkan dinding sel. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk
membantu pemasukan zat warna kedalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan.
Tujuan memberikan pewarna karbol fuksin adalah untuk mewarnai seluruh sel
bakteri. Setelah memberikan pewarna karbol fuksin kemudian di panaskan di atas
penangas air, tetapi jangan sampai terlalu panas, mendidih atau kering. Tujuan
dari memanaskan sampel di atas penangas air yaitu supaya pewarna karbol fuksin
masuk menembus dinding sel bakteri, karena dinding bakteri yang tahan asam
mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar di tembus pewarna bakteri. Karena
pengaruh fenol dari pewarna karbol fuksin dan juga pemanasan maka lapisan lilin
dan lemak dapat ditembus pewarna karbol fuksin. Dengan pemanasan
menyebabkan pelebaran pori pori lemak bakteri tahan asam sehingga pewarna
karbol fuksin dapat masuk sewaktu dicuci dengan larutan pemucat, dan zat warna
pertama tidak mudah dilunturkan. Menunggu selama 10 menit setelah pewarnaan
dengan warna carbol fuchsin dan dilakukan pemanasan bertujuan agar cat ini
dapat diserap dan melekat sempurna pada dinding bakteri dan dinding selnya
kembali seperti semula setelah dilakukan pemanasan. Setelah 10 menit dibilas

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 12

dengan aquades. Pencucian dengan menggunakan aquades mengalir bertujuan

untuk menutup kembali lemaknya.
Kemudian sampel di tetesi asam alkohol 3 % dan didiamkan selama 30 detik .
Penambahan alkohol ini berfungsi untuk membilas atau melunturkan zat warna
(decolorization) pada sel bakteri (mikroorganisme). Saat sel-sel bakteri sudah
mampu menyerap warna carbol fuchsin maka dinding sel tersebut akan kembali
tertutup dalam pada suhu semula. Sehingga sebelum dilakukan penambahan asam
alcohol ditunggu sampai 10 menit. Saat penambahan asam alcohol ini, maka
bakteri yang bukan BTA akan dilunturkan kembali warna carbol fuchsin tersebut
karena tidak mampu mengikat kuat seperti halnya bakteri BTA. Bakteri tahan
asam pada saat dicuci dengan asam alkohol warna karbol fuksin tidak lepas atau
hilang, sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan lepas atau hilang.
Menunggu selama menit setelah penambahan larutan asam alkohol bertujuan
agar zat warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. Dan
setelah 30 detik dicuci kembali dengan air mengalir atau aquadest.
Setelah itu, sampel di tetesi atau di genangi dengan pewarna tandingan metilen
biru dan didiamkan selama 1 menit. Methylene Blue merupakan pewarna
tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali selsel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan asam alkohol.
Zat warna methylene blue masuk ke dalam sel bakteri non BTA yang
permeabilitas dinding selnya membesar akibat lapisan lipid pada bakteri non BTA
terekstraksi oleh asam alkohol, sehingga menyebabkan sel bakteri non BTA
tersebut menjadi berwarna biru. Pada bakteri BTA dinding selnya sudah
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes
dinding sel dan membran menurun sehingga zat warna methylene blue tidak dapat
masuk sehingga sel bakteri BTA berwarna merah. Menunggu selama 1 menit
setelah penambahan pewarna methylene blue bertujuan agar cat ini dapat diserap
sempurna pada dinding bakteri non BTA sehingga ada perbedaan warna antara
bakteri BTA dan Non BTA.

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 13

Kemudian, setelah didiamkan selama 1 menit kemudian dibilas dengan air

mengalir atau aquadest. Objek yang telah dibasuh aquades kemudian dikeringkan
dengan menggunakan kertas saring atau tissue, tidak ditiup-tiup karena
dikhawatirkan ada kontaminasi bakteri lain yang menempel pada objek glass.
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan
terhadap kaca objek dengan menggunakan aquades. Pembilasan ini bertujuan
untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan.
Sampel yang sudah di keringkan, di tetesi dengan emersi oil. Minyak emersi
adalah minyak yang di pakai untuk olesan pada mikroskop, yang fungsinya untuk
memperjelas objek, dan melindungi mikroskop dari debu atau kotoran. Minyak
emersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air, sehingga
objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas dibandingkan dengan tanpa minyak
emersi. Lalu diamati dengan mikroskop, dengan pembesaran 10X dan 100X.

Berdasarkan pada hasil pengamatan dengan mikroskop lensa objektif

pembesaran 10X terlihat lapang pandang berwarna ungu, ditemukan sel epitel
tenggorokan yang terkelupas saat pasien mengeluarkan sputum, dan sel bakteri
belum terlihat. Sedangkan pada hasil pengamatan dengan menggunakan
mikroskop lensa objektif pembesaran 100X terlihat sel epitel yang ukurannya
semakin besar, dan ditemukan bakteri BTA berwarna merah dan bakteri non BTA
berwarna ungu. Sehingga Pada preparat sputum ditemukan bakteri tahan asam
(BTA) berbentuk Basil berwarna dan bakteri tidak tahan asam (non BTA)
berbentuk Coccus berwarna ungu. Dengan latar belakang berwarna biru dan sel
epitel dan PMN berwarna biru tua. Dari hasil tersebut dapat didiagnosa bahwa
sputum tersebut 2+.
Adapun hal-hal yang harus diperhatikan pada saat pewarnaan BTA ini yaitu
pada fase yang paling kritis adalah dekolorisasi yang mengakibatkan warna yang
tidak terikat oleh sel bakteri lepas dari sel, pemberian asam alkohol jangan sampai
berlebih karena akan menyebabkan overdekolorization sehingga sel BTA hampir
Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 14

sama dengan Non BTA yang menyebabkan sulit membedakannya, tetapi jangan
juga terlalu sedikit dalam memberikan alkohol (underdecolorization) karena tidak
akan melunturkan warna secara sempurna sehingga sel Non BTA bisa saja
berwarna ungu mendekati warna sel BTA. Saat pemanasan juga tidak boleh
sampai mendidih karena akan menyebabkan sel bakteri lisis. Dan kaca obyek
harus selalu dicuci dengan aquades atau air mengalir diantara penambahan
pewarna untuk menghilangkan kelebihan warna dan mempersiapkan pewarna
berikutnya.

BAB VI
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan pada percobaan kali ini, maka dapat kami dapat
tarik kesimpulan bahwa pada preparat sputum yang diuji cobakan telah ditemukan
bakteri tahan asam (BTA) berbentuk Basil berwarna dan bakteri tidak tahan asam
(non BTA) berbentuk Coccus berwarna ungu. Dengan latar belakang berwarna
biru dan sel epitel dan PMN berwarna biru tua. Dari hasil tersebut dapat di
diagnosa bahwa sputum tersebut 2+.

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 15

DAFTAR PUSTAKA
Ball, A.S. 1997. Bacterial Cell Culture : Essential Data. John Wiley & Sons, New
York.
Dwidjoseputro,D. 2005. Dasar - Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan.
Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan dan
Sekolah Tenaga Kesehatan Yang Sederajat. Bandung : Citra Aditya Bakti.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga.
Jawetz, Melnick, Adelbergs. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Salemba
Medika.
Jutono, dkk. 1980. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum Untuk Perguruan
Tinggi. Yogyakarta: Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM.
Kurniawati et al., 2005.Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen, dan
fluorokrom sebagai Metode Pewarnaan Basil Tahan Asam untuk

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 16

Pemeriksaan Mikroskopis Sputum. Makara Kesehatan. Vol 9, June 2005 :

29-33.
Lay, Bibiana.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Rajawali.
Pratiwi, S. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga.
Pelczar, and Chan M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.
Thomas Dormandy (1999). The White Death: A History of Tuberculosis. ISBN 08147-1927-9 HB - ISBN 1-85285-332-8 PB
Volk & Wheeler. 1984. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima Jilid I. Jakarta :
Erlangga.

Laporan Praktikum Bakteriologi 1

Page 17