Anda di halaman 1dari 12

Studi Mutasi A3243G DNA Mitokondria dan Pewarisannya

pada Penderita Diebetes Melitus Tipe 2 Menggunakan PCR-RFLP


Iman Permana Maksum*, Toto Subroto*, Anas Subarnas**,
Budhi Prihartanto**Amelia Fauziana*, Neti*
*Jurusan Kimia FMIPA Unpad
** Jurusan Farmasi FMIPA Unpad
Jalan Raya Jatinangor-Sumedang Km 21
Jatinangor, Jawa Barat
ABSTRAK
Diabetes mellitus tipe 2 (DM tipe 2) merupakan salah satu penyakit kronis yang
banyak terjadi di Indonesia dengan jumlah penderita yang semakin meningkat. Keterlibatan
faktor genetik dan faktor lingkungan menjadikan studi genetik mengenai penyakit ini menjadi
sangat penting. Salah satu bentuk DM tipe 2 ini adalah Maternal Inherited Diabetes and
Deafness (MIDD) yang disebabkan oleh adanya mutasi DNA mitokondria (mtDNA).
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi mutasi heteroplasmi A3243G pada gen
tRNALeu mtDNA manusia Indonesia dan pewarisannya pada penderita DM tipe 2 dengan
memanfaatkan teknologi PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction–Restriction Fragments
Length Polymorphism). Sampel yang digunakan adalah sel darah yang diambil secara acak
dari 101 subjek manusia Indonesia penderita DM tipe 2 dan dua generasi keturunan dari
sampel positif mutasi A3243G. mtDNA diisolasi dari sel limfosit, dan gen tRNALeu mtDNA
diamplifikasi dengan teknik PCR menggunakan primer D1/D2. Fragmen 294 pb hasil PCR
dimurnikan dengan metode presipitasi etanol dan dikarakterisasi dengan menggunakan enzim
restriksi ApaI untuk mengidentifikasi mutasi A3243G. Hasil penelitian ini menunjukkan
adanya mutasi heteroplasmi A3243G pada gen tRNALeu DNA mitokondria penderita diabetes
mellitus tipe 2 di Indonesia dengan tingkat prevalensi 2% dan tidak dapat mendeteksi mutasi
pada dua generasi selanjutnya dikarenakan tingkat mutasi heteroplasmi yang rendah.

PENDAHULUAN
Faktor genetik sangat berperan dalam timbulnya penyakit diabetes mellitus tipe 2
selain karena faktor lingkungan. Gen-gen pada DNA mitokondria manusia (mtDNA) menjadi
salah satu kemungkinan penyebab diabetes mellitus tipe 2 karena fosforilasi oksidatif yang
terjadi di mitokondria memainkan peranan yang penting dalam sekresi insulin oleh sel β
pankreas saat terjadinya respon glukosa dan nutrien yang lainnya dalam tubuh [Kadowaki et

1 Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya


pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP
al., 1994]. Mutasi gen pada mtDNA ini menyebabkan suatu bentuk diabetes tipe 2 yang
dikenal dengan MIDD (Maternal Inherited Diabetes and Deafness). Bentuk diabetes ini
dikarakterisasi oleh diagnosis pada usia di atas usia 25 tahun, terjadi gangguan pada sekresi
insulin dan sering diikuti oleh melemahnya indera pendengaran [Malecki et al., 2001].

Beberapa penelitian mengenai mutasi gen mtDNA yang berhubungan dengan diabetes
mellitus tipe 2 ini telah dilakukan di berbagai populasi di Jepang, Korea, China, Prancis,
Australia, Inggris, Belanda dan Polandia dan terdapat beberapa mutasi gen yang telah
dilaporkan, diantaranya yang paling banyak ditemukan adalah mutasi titik A3243G pada gen
tRNALeu [Malecki et al., 2001; Ohkubo et al., 2001 ; Lee et al., 1997; Froguel & Hager, 1995;
Ng et al., 2001; t’Hart et al., 1994; and Saker et al., 1997]. Mutasi ini terjadi pada sisi
pengikatan DNA mitokondria untuk protein promotor terminasi transkripsi pada batas antara
RNA ribosom 16S dan gen tRNALeu. Mutasi ini tidak hanya mempengaruhi sintesis dari
tRNALeu tetapi juga menggangu mekanisme pengikatan faktor terminasi transkripsi, yang
dapat menyebabkan terganggunya sintesis dari protein-protein mitokondria [Kadowaki et al.,
1994].

Penelitian ini merupakan bagian dari upaya untuk mendapatkan data base varian
normal dan tidak normal mtDNA manusia Indonesia dan produk translasinya dengan
memanfaatkan teknologi PCR. Pada penelitian sebelumnya telah ditemukan 67 variasi
nukleotida mtDNA 41 manusia Indonesia normal baik pada daerah penyandi maupun non
penyandi, yaitu pada posisi 5.042-6384 (fragmen X), 11.580-13.200 (fragmen F), 15.978-
16.420 (fragmen M) urutan Anderson [Triraharjo, 1998; Puspasari, 1998; Gaffar, 1998;
Rachmayanti, 2000; Wayan, 2001; Maksum, I.P., 2002].Selanjutnya dilakukan penelitian
mengenai analisis urutan nukleotida manusia Indonesia yang mempunyai hubungan keluarga
menurut garis keturunan ibu. Penelitian tersebut menganalisis pola variasi urutan nukleotida
0,4 kb daerah D-loop mtDNA pada tiga generasi segaris keturunan ibu yang mempunyai
homologi 100 % [Maksum, 2003].

Pada penelitian ini, analisis mutasi A3243G gen tRNALeu akan dikembangkan ke
penggunaan metode PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi ApaI dan diharapkan dapat
mendeteksi mutasi heteroplasmi yang terjadi dan pewarisannya ke generasi berikutnya melalui
segaris keturunan ibu sehingga potensi mutasi tersebut dapat terdeteksi pada usia muda.

2 Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya


pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP
METODE PENELITIAN

Bahan dan penyiapan mtDNA templat

Sampel diambil dari darah 101 penderita diabetes mellitus (DM) tipe 2 manusia
Indonesia dan dua keturunan segaris keturunan ibu dari sampel positif mutasi A(3243)G. 101
Sampel penderita DM tipe 2 tersebut dianalisis dengan PCR-RFLP untuk dipelajari mutasi
A(3243)G yang menunjukkan fenotip MIDD. Sebagai kontrol digunakan sampel darah
manusia normal.

MtDNA templat disiapkan menggunakan metode lisis sel limfosit dengan bufer lisis
yang terdiri atas Tris-HCl 50 mM pH 8,5; EDTA 1 mM pH 8,0; proteinase K 0,04 mg/mL,
dan tween-20 0,5% [Noer, et al., 1994]. Sebelumnya sel limfosit diperoleh dengan cara
mencuci sampel darah sebanyak 500 µ L dengan 500 µ L bufer TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0;
EDTA 1 mM, pH 8,0), pencucian dilakukan secara berulang sampai diperoleh pelet putih.
Lisis sel dilakukan dengan metode maniatis.

Amplifikasi mtDNA secara in vitro (PCR)

Amplifikasi fragmen 294 pb gen tRNALeu mtDNA dilakukan dengan teknik PCR
menggunakan primer D1/D2. Campuran reaksi mengandung enzim Taq DNA Polymerase 1
unit, mtDNA templat hasil lisis, sepasang primer masing-masing 1 µ M, bufer PCR 10x (Tris-
HCl 10 mM, pH 9,0, NaCl 50 mM, Triton x-100 0,1%), dNTP 200 µ M, MgCl2 2 µ M dan
ddH2O steril. Proses PCR akan dilakukan dalam mesin PCR Automatic Thermal Cycler 30
siklus. Tahap awal PCR adalah denaturasi awal yang akan dilakukan pada suhu 94oC selama 5
menit, kemudian masuk ke program siklus PCR dengan masing-masing siklus terdiri tiga
tahap yaitu denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, penempelan primer (annealing) pada
suhu 56oC selama 30 detik, dan perpanjangan primer (extension) pada suhu 72oC selama 50
detik. Akhir dari semua siklus dilakukan tambahan proses extension pada suhu 72oC selama 10
menit [Zhang et al., 2001]. Hasil dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v)
dengan DNA marker pUC19/HinfI dan visualisasi dengan bantuan lampu ultra violet.

Karakterisasi hasil PCR dengan enzim ApaI (RFLP)

Pemurnian hasil PCR akan dilakukan dengan metode presipitasi etanol [Sambrook, et
al., 1989]. Hasil PCR murni akan dikarakterisasi dengan enzim ApaI (15 unit) dalam bufer
3 Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya
pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP
10x yang diinkubasi pada suhu 37oC selama overnight. Hasil inkubasi akan dianalisis
menggunakan elektroforesis gel agarosa 2% (b/v) dengan DNA marker pUC19/HinfI dan
dapat dilihat secara visual dengan bantuan lampu ultra violet.

Analisis Homologi daerah Hiper Variabel I D-Loop mtDNA


Pada penelitian ini amplifikasi 0,4 kb daerah D-loop menggunakan primer M 1/M2
[Aquadro and Greenberg, 1983]. Campuran reaksi PCR dilakukan di dalam tabung mikro
yang terdiri atas templat mt DNA hasil lisis, primer M1 /M2, bufer PCR 10 x, 2 unit enzim Taq
DNA Polymerase, dNTP dan ditambah ddH2O steril. Proses PCR dilakukan dengan mesin
Automatic Thermal Cycler 30 siklus. Tahap awal dari proses PCR adalah denaturasi awal yang
dilakukan pada suhu 94 °C selama 1 menit, kemudian masuk ke program siklus PCR dengan
masing-masing siklus terdiri tiga tahap yaitu denaturasi yang dilakukan pada suhu 94 °C
selama 1 menit, annealing yang dilakukan pada suhu 50 °C selama 1 menit dan extention atau
polimerisasi pada suhu 72 °C selama 1 menit. Akhir dari semua siklus dilakukan tambahan
polimerisasi pada suhu 72 °C selama 4 menit. DNA hasil PCR disimpan pada suhu –20 °C.
Hasil amplifikasi dari proses PCR tersebut selanjutnya dianalisis dengan elektroforesis
gel agarosa 1,2 % (b/v) dengan penanda kontrol yang digunakan adalah pUC19/HinfI .

Sekuensing

Sekuensing DNA merupakan tahapan akhir penentukan urutan nukleotida fragmen


hasil amplifikasi. Sekuensing dilakukan dengan metode Dideoksi Sanger menggunakan
Automatic DNA Sequencer yang berdasarkan pada metode Dye Terminator Labeling.
Tahapan sekuensing DNA yang dilakukan pada penelitian ini meliputi : (1) penyiapan
DNA templat, (2) proses amplifikasi melalui PCR dengan menggunakan primer universal T7,
(3) pemurnian DNA dengan kolom Sephadex G-50 , (4) elektroforesis pada gel
poliakrilamida, dan (5) pembacaan elektroforegram hasil sekuensing.

Direct Sequencing

Direct sequencing merupakan tahapan untuk menentukan urutan nukleotida fragmen


hasil amplifikasi dengan PCR tanpa melalui proses kloning. Metode sekuensing yang
digunakan sama seperti proses sekuensing biasa, tetapi ada beberapa perbedaan dalam

4 Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya


pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP
tahapan-tahapan reaksinya, yaitu pada penyiapan DNA templat dan proses amplifikasi dengan
PCR.
HASIL DAN PEMBAHASAN

Pemilihan dan Pengambilan Sampel Sel Darah dan Sel Epitel


Sampel adalah sel darah dari 101 subjek penderita diabetes mellitus tipe 2 di Rumah
Sakit Cimbuleuit, Rumah Sakit Pindad, Laboratorium Klinik Prodia, dan Laboratorium Klinik
Pramita, Bandung. Pemilihan sel darah sebagai sampel dikarenakan sel ini mempunyai jumlah
organel mitokondria yang cukup banyak [Thorpe, 1984]. Alasan lainnya adalah karena sampel
darah relatif mudah untuk diambil dan telah digunakan sebagai sampel pada penelitian yang
dilakukan oleh Ohkubo et al.[2001], Lee et al. [1997], dan Malecki et al. [2001] untuk
menganalisis mutasi A3243G mtDNA yang berhubungan dengan diabetes mellitus di Jepang,
Korea, dan Polandia. Sampel diambil secara acak dari penderita yang positif diabetes mellitus
tipe 2 dengan rentang usia 25 tahun ke atas. Tetapi pada penelitian Shanske et al. (2004)
menemukan bahwa sel darah memiliki persentase heteroplasmi yang lebih rendah dan sedimen
urin memiliki persentase heteroplasmi lebih tinggi dibandingkan darah, begitu juga
dibandingkan dengan rambut, kulit dan mukosa. Bersasarkan penelitian tersebut, maka
diambil sampel darah dan sampel urin dari sampel positif mutasi A(3243)G menggunakan
PCR-RFLP dengan enzim restriksi ApaI dimana dua keturunannya segaris keturunan ibu ikut
dianalisis pola pewarisan mutasi A(3243)G pada penelitian ini.
Amplifikasi Templat mtDNA secara Invitro dengan PCR

Templat mtDNA hasil lisis selanjutnya diamplifikasi untuk mendapatkan gen tRNALeu
secara invitro dengan metode PCR menggunakan primer D/D2 [Zhang et al., 2002]. Hasil
PCR kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v) menggunakan metode
EtBr staining seperti yang telah dilakukan Zhang et al. [2002] juga merujuk pada Sambrook et
al. [1989] dan sebagai penanda kontrol digunakan (marker) pUC19/HinfI. Semua sampel
memberikan hasil amplifikasi fragmen DNA berukuran 294 pb gen tRNALeu mtDNA.

Karakterisasi Templat mtDNA hasil PCR dengan ApaI


Sebanyak 200 ng DNA hasil pemurnian selanjutnya dikarakterisasi dengan 15 unit
enzim restriksi ApaI untuk mengetahui adanya mutasi A3243G mtDNA karena mempunyai

5 Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya


pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP
sisi pengenalan nukleotida GGGCCC. Dalam volume total 50 µ L campuran templat mtDNA,
enzim, bufer dan ddH2O diinkubasi pada suhu 370C selama overnight.

Hasil inkubasi kemudian dianalisis kembali dengan elektroforesis gel agarosa 2% (b/v)
dengan marker pUC19/HinfI. Hasil elektroforesis hasil pemotongan enzim restriksi ApaI
terhadap 101 sampel menunjukkan 2 sampel mempunyai mutasi A3243G. Hal ini ditunjukkan
oleh adanya 3 pita hasil karakterisasi elektroforesis gel agarosa, 2 pita hasil pemotongan
enzim restriksi ApaI, dan 1 pita utuh 294 pb (dapat ditunjukkan pada Gambar 2).

Gambar 1Fragmen hasil PCR-RFLP. Karakterisasi hasil PCR-RFLP 7 sampel (lajur 2-8) dengan
elektroforesis gel agarosa 2% (b/v) menggunakan penanda kontrol pUC/HinfI (lajur 1).
Sampel pada lajur 5 menunjukkan adanya 3 pita yaitu fragmen utuh 294 pb , berikut 2 pita
182 pb dan 112 pb dibawahnya yang diperkirakan merupakan hasil pemotongan enzim
restriksi ApaI.

Terpotongnya fragmen mtDNA 294 pb gen tRNALeu oleh enzim restriksi ApaI menjadi
2 fragmen 182 pb dan 112 pb menunjukkan adanya mutasi A3243G pada sampel tersebut. Hal
ini terjadi karena mutasi A3243G menyebabkan terbentuknya 6 nukleotida sisi pengenalan
enzim restriksi ApaI pada urutan pasang basa 3242-3247, yaitu GGGCCC, sedangkan untuk
subjek normal mempunyai urutan GAGCCC pada posisi tersebut. Masih adanya pita utuh 294
pb pada sampel hasil PCR-RFLP yang terpotong oleh enzim restriksi ApaI menandakan bahwa
mutasi tersebut bersifat heteroplasmi, yang artinya dalam sel terdapat campuran antara
mtDNA yang termutasi dan mtDNA yang normal.

Rendahnya tingkat heteroplasmi untuk mutasi A3243G pada gen tRNALeu mtDNA
pada penderita diabetes mellitus tipe 2 di dalam penelitian ini sama halnya dengan hasil yang
6 Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya
pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP
telah diteliti di berbagai negara, sedangkan apabila tingkat heteroplasmi yang tinggi biasanya
menimbulkan fenotip untuk penyakit lain, yaitu MELAS (Mitochondrial
Encephalomyophathy Lactic Acidosis and Stroke likes Episodes) atau komplikasi keduanya
[Urata et al., 1998].
Selanjutnya, untuk sampel yang positif terdapat mutasi heteroplasmi A3243G
kemudian ditelusuri lebih lanjut mengenai data riwayat kesehatan dan silsilah keluarganya.
Hal ini dilakukan untuk mengamati gambaran klinis yang dimiliki oleh penderita DM tipe 2 di
Indonesia yang mempunyai mutasi tersebut, MIDD sendiri ditandai oleh diabetes non
obesitas, tidak mengalami ketoasidosis, dan adanya gangguan pada indera pendengaran
(ketulian), serta untuk membuktikan bahwa mutasi heteroplasmi ini diwariskan secara
maternal sehingga pada penelitian ini diharapkan dapat mendeteksi adanya mutasi
heteroplasmi yang diwariskan ke generasi berikutnya melalui segaris keturunan ibu sehingga
potensi mutasi tersebut dapat terdeteksi pada usia muda.

Studi pola pewarisan maternal mutasi A3243G gen tRNALeu mtDNA


Penyiapan templat mtDNA
Sampel dalam penelitian ini diambil dari penderita diabetes melitus tipe 2 yang positif
mutasi A3243G mtDNA pada penelitian tahun pertama yaitu sampel Yn sebagai generasi I
dan sampel keturunannya berdasarkan segaris ibu yaitu anak perempuan (Gc) sebagai generasi
II dan cucu perempuan (Ch) sebagai generasi III.

Gambar 2 Silsilah keluarga Yn. Sampel penelitian diambil dari sampel Yn sebagai generasi I dan
keturunannya yang segaris ibu yaitu anak perempuannya (Gc) sebagai generasi II dan cucu
perempuannya (Ch) sebagai generasi III.

7 Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya


pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP
Sampel yang digunakan sebagai templat mtDNA pada penelitian ini adalah sel limfosit
darah sampel Yn, Gc dan Ch dan sel epitel dari urin sampel Yn. Untuk mempelajari pola
pewarisan maternal mutasi heteroplasmi A3243G mtDNA pada tiga generasi segaris
keturunan ibu maka terlebih dahulu dilakukan analisis homologi daerah D-loop mtDNA
sebagai pembuktian keturunan berdasarkan segaris keturunan ibu.. Hasil analisis homologi
urutan nukleotida daerah D-loop mtDNA sampel Yn dan Ch menunjukkan tingkat homologi
100% sedangkan tingkat homologi daerah D-loop mtDNA antara sampel Yn dan At adalah
96,6%.

Gambar 3 Hasil analisis homologi sampel Yn, Ch dan At dengan urutan nukleotida Anderson
(Cambridge) sebagai standar. Analisis homologi dilakukan dengan menggunakan program
Megalign DNASTAR. Tanda merah menandakan homologi 100%, tanda biru dan hijau
menunjukkan varian.

Analisis Mutasi A3243G mtDNA dengan metode PCR-RFLP Pada Tiga Generasi Segaris
Keturunan Ibu

8 Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya


pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP
Pada penelitian ini dilakukan analisis mutasi A3243G mtDNA dengan metode PCR-
RFLP terhadap keturunan sampel Yn berdasarkan segaris keturunan Ibu yaitu anak perempuan
(Gc) sebagai generasi II dan cucu perempuan (Ch) sebagai generasi III dari sampel Yn.

Gambar 4 Elektroforegram hasil PCR-RFLP dari Generasi II dan III dari sampel Yn yang positif
mutasi A3243G mtDNA pada penelitian sebelumnya. Karakterisasi hasil PCR-RFLP 2
sampel (lajur 2 dan 3) dengan elektroforesis gel agarosa 2% (b/v) menggunakan penanda
kontrol pUC/Hinf1 (lajur 3). Sampel Gc dan Ch tidak menunjukkan adanya fragmen
tambahan selain fragmen 294 pb.

Dari hasil PCR-RFLP ini ternyata tidak terdeteksi mutasi A3243G mtDNA pada generasi
II dan III yang segaris keturunan ibu. Tidak terdeteksinya mutasi A3243G mtDNA pada
generasi II dan III ini disebabkan level heteroplasmi rendah dan metode PCR-RFLP tidak
sensitif mutasi heteroplasmi tersebut. Urata et al. (2001) menyatakan identifikasi mutasi
A3243G dengan metode PCR-RFLP menggunakan enzim ApaI dan penandaan etidium
bromida hanya mendeteksi level heteroplasmi 5-10% sedangkan diabetes melitus yang
disebabkan mutasi A3243G mtDNA memiliki level heteroplasmi 1-2%. White et al. (2004)
menyatakan bahwa limit deteksi PCR-RFLP fluoresens adalah hingga heteroplasmi 5%,
sedangkan untuk metode PCR-RFLP dengan elektroforesis gel agarosa dan penandaan etidium
bromida hanya dapat mendeteksi mutasi dengan sensitivitas hanya 20% dan konsisten dengan
penelitian lain yaitu Hancock et al. (2002). Faktor lain yang menyebabkan tidak terdeteksinya
mutasi A3243G mtDNA pada generasi II dan III dikarenakan jaringan yang digunakan sebagai
sumber templat untuk analisis mutasi bukan berasal dari jaringan yang terserang sehingga
level heteroplasmi A3243G pun sangat rendah pada jaringan tersebut dan tidak terdeteksi
dengan metode PCR-RFLP. Mutasi A3243G mtDNA bersifat heteroplasmi dan level

9 Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya


pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP
heteroplasmi tertinggi terdapat pada jaringan yang terserang. Oleh karena itu, sampel uji yang
paling baik adalah jaringan yang terserang Pada penyakit MIDD, jaringan yang terserang dan
memiliki mutation load A3243G mtDNA tertinggi adalah sel β -pankreas sedangkan jaringan
ini bukan merupakan jaringan yang umum digunakan sebagai sampel untuk diagnosis.
Sehingga permasalahannya adalah dibutuhkan suatu metode yang dapat mendeteksi mutasi
A324G mtDNA dengan tingkat heteroplasmi yang sangat rendah.
Selain itu, tidak terdeteksinya mutasi A3243G mtDNA pada generasi II dan III
disebabkan mutation load (level ambang kritis dari mtDNA mutan) pada sampel generasi II
dan III belum terlampaui dimana sel belum mengekspresikan kerusakan rantai respirasi
mitokondria [Attardi et al., 1995]. Terdapat bukti bahwa ciri klinis pada penyakit mitokondria
berkaitan dengan mutation load pada individu yang terserang [Chinnery et al., 1997].
Oleh karena itu, perlu dikembangkan teknik analisis mutasi A3243G mtDNA dengan
tingkat heteroplasmi sangat rendah yang dapat dijadikan sebagai metode diagnosis rutin
sehingga dapat digunakan untuk mendiagnosis secara dini penyakit yang diakibatkan mutasi
A34243G mtDNA.

KESIMPULAN
Dari hasil-hasil penelitian yang telah dilakukan hingga saat ini, maka dapat ditarik kesimpulan
sebagai berikut:
1. Dengan teknologi PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi ApaI dan teknologi DNA
rekombinan menunjukkan adanya mutasi heteroplasmi A3243G pada gen tRNALeu
DNA mitokondria penderita diabetes mellitus tipe 2 di Indonesia dengan tingkat
prevalensi 2%.
2. Metode PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi ApaI dengan penandaan EtBr dan
karakterisasi dengan elektroforesis agarosa 2% tidak dapat mengidentifikasi mutasi
heteroplasmi A3243G pada gen tRNALeu DNA mitokondria dari dua generasi segaris
keturunan ibu dari penderita diabetes melitus tipe 2 di Indonesia yang positif mutasi
A3243G mtDNA.

DAFTAR PUSTAKA

10 Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya


pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP
Anonymous. 2002. Konsensus pengelolaan diabetes melitus tipe 2 di indonesia
2002.PERKENI. Bandung

Froguel, P., Hager, J. 1995. Human diabetes and obesity: tracking down the genes. Tibtech.
13: 52-55.

Kadowaki, T., Kadowaki, H., Mori, Y., Tobe, K., Sakuta, R., Suzuki, Y., Tanabe, Y., Sakura,
H., Awata, T., Goto, Y., Hayakawa, T., Matsuoka, K., Kawamori, R., Kamada, T., Horai, S.,
Nonaka, I., Hagura, R., Akanuma, Y., Yazaki, Y. 1994. A subtype of diabetes mellitus
associated with a mutation of mitochondrial DNA. NEJM. 330: 962-968.

Lee, H.C., Song, Y.D., Li, H., Park, J.O., Suh, H.C., Lee, E., Lim, S., Kim, K., Huh, K. 1997.
Mitochondrial gene transfer ribonuclaic acid (tRNA)Leu(UUR) 3243 and tRNALys 8344 mutations
and diabetes mellitus in Korea. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 82 (2):
372-374.

Maksum, I.P. 2002. Tiga mutasi spesifik yang lestari daerah D-loop DNA mitokondria
manusia indonesia pada tujuh generasi segaris keturunan ibu. Tesis. Bidang Studi Magister
Kimia Program Pascasarjana ITB.

Malecki, M., Klupa, T., Wanic, K., Frey, J., Cyganek, K., Sieradzki, J. 2001. Search for
mitochondrial A3243G tRNALeu mutation in Polish patients with type 2 diabetes mellitus.
Med Sci Monit. 7(2): 246-250.

Ng, M.C., Lee, S.C., Ko, G.T.C., Li, J.K.Y., So, W.Y., Hashim, Y., Barnett, A.H., Mackay,
I.R., Critchley, J.A.J.H., Cockram, C.S., Chan, J.C.N. 2001. Familial early-onset type 2
diabetes in China patients. Diabetes Care. 24: 663-671.

Noer, A.S., Martasih, F., Mulyani, S., Muktiningsih, dan Wirahadikusumah, M.1994. Analisis
variasi urutan nukleotida D-loop mtDNA manusia dari beberapa daerah di Indonesia, Proc. 1st
joint seminar on chemistry UKM-ITB, Malaysia.

Ohkubo, K., Yamano, A., Nagashima, M., Mori, Y., Anzai, K., Akehi, Y., Nomiyama, R.,
Asano, T., Urae, A., Ono, J. 2001. Mitochondrial gene mutations in the tRNALeu(UUR) region
and diabetes: prevalence and clinical phenotypes in Japan. Clinical Chemistry. 47: 1641-1648.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, vol.
1,2,3,. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York

‘tHart, L.M., Lemkes, H.H., Heine, R.J., et al. 1994. Prevalence of maternally inherited
diabetes and deafness in diabetic population in the Netherlands. Diabetologia. 37: 1169-70.

Thorpe, N.D. 1984. Cell biology. John Wiley & Sons Inc. New York Urata, M., Wakiyama,
M., Iwase, M., Yoneda, M., Kinoshita, S., Hamasaki, N., Kang, D. 1998. New sensitive
method for the detection of the A3243G mutation of human mitochondrial deoxyribonucleic

11 Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya


pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP
acid in diabetes mellitus patients by ligation mediated polymerse chain reaction. Clinical
Chemistry. 44 : 2088-2093.

Zhang yong, Li Jianfeng, Wang fengyan. 2001. The study of A3243G and G13513A
mitochondrial DNA pointmutation in patients with cerebral infartion, Chin Med J., 114 (10):
129-135.

12 Studi Mutasi A(3243)G DNA Mitokondria dan Pewarisannya


pada Penderita Diebetes Melitus Tipe II Menggunakan PCR-RFLP