DIAGNOSTICO MOLECULAR
TRABAJO DE INVESTIGACION
CATEDRATICO:
ALUMNO:
INTRODUCCIÓN
La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requieren la purificación, al menos
parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmente un gran
esfuerzo ya que una célula contiene miles de sustancias diferentes, la molécula que
buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse a concentraciones muy
bajas. En este tema se presenta una visión general de las técnicas más usuales
empleadas para la purificación de proteínas, aunque muchas de ellas son aplicables a
la separación de la mayoría de las moléculas biológicas.
Las enzimas o las proteínas producidas por los microorganismos pueden ser
intracelulares, periplásmicas o secretadas al medio de cultivo. Para enzimas
extracelulares, el grado de purificación requerido es mínimo y los procesos a gran
escala pueden rendir toneladas de producto proteico.
Muchas otras enzimas sin embargo, son producidos en mezclas intracelulares mas
complejas y representan un mayor desafío implicado en la purificación proteica. Los
productos para un uso terapéutico deben presentar unas características de purezas
muy exigentes y exactas. De nuevo, la ingeniería genética ha sido capaz de ayudar
en esta tarea. En el caso de las proteínas terapéuticas, hay grandes ventajas si la
proteína de interés puede ser secretada, bien al periplasma, bien al medio. Esto
provoca una enorme reducción del nivel de proteínas contaminantes y otras
macromoléculas de forma que se puede obtener el producto puro tras solo dos o
tres pasos de purificación.
DESARROLLO
PROTEÍNA
Las proteínas desempeñan un papel fundamental en los seres vivos y son las
biomoléculas más versátiles y más diversas.
Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan:
Las proteínas de todo ser vivo están determinadas mayoritariamente por su genética
(con excepción de algunos péptidos antimicrobianos de síntesis no ribosomal), es
decir, la información genética determina en gran medida qué proteínas tiene una
célula, un tejido y un organismo.
CARACTERÍSTICAS
Los prótidos o proteínas son biopolímeros, es decir, están constituidas por gran
número de unidades estructurales simples repetitivas (monómeros). Debido a su gran
tamaño, cuando estas moléculas se dispersan en un disolvente adecuado, forman
siempre dispersiones coloidales, con características que las diferencian de las
disoluciones de moléculas más pequeñas.
Todas las proteínas tienen carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno y casi todas
poseen también azufre. Si bien hay ligeras variaciones en diferentes proteínas, el
contenido de nitrógeno representa, por término medio, 16% de la masa total de la
molécula; es decir, cada 6,25 g de proteína contienen 1 g de N. El factor 6,25 se utiliza
para estimar la cantidad de proteína existente en una muestra a partir de la medición
de N de la misma.
La síntesis proteica es un proceso complejo cumplido por las células según las
directrices de la información suministrada por los genes.
Las proteínas son largas cadenas de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos entre
el grupo carboxilo (-COOH) y el grupo amino (-NH2) de residuos de aminoácido
adyacentes. La secuencia de aminoácidos en una proteína está codificada en su gen
(una porción de ADN) mediante el código genético. Aunque este código genético
especifica los 20 aminoácidos "estándar" más la selenocisteína y —en ciertos Archaea
— la pirrolisina, los residuos en una proteína sufren a veces modificaciones químicas
en la modificación postraduccional: antes de que la proteína sea funcional en la célula,
o como parte de mecanismos de control. Las proteínas también pueden trabajar juntas
para cumplir una función particular, a menudo asociándose para formar complejos
proteicos estables.
FUNCIONES
Son proteínas:
Es la manera como se organiza una proteína para adquirir cierta forma. Presentan una
disposición característica en condiciones fisiológicas, pero si se cambian estas
condiciones como temperatura, pH, etc. pierde la conformación y su función, proceso
denominado desnaturalización. La función depende de la conformación y ésta viene
determinada por la secuencia de aminoácidos.
LISIS CELULAR
Para obtener proteínas intracelulares de los microorganismos existen tres métodos
generales; enzimáticos, químicos o físicos. No todas las metodologías pueden ser
utilizadas en procesos a gran escala. Quizás el ejemplo mas destacado es la
sonicación, que es el método más empleado en la obtención de proteínas en el
laboratorio.
• Álcali.
Este método ha sido utilizado con considerable éxito para la extracción de proteínas
bacterianas a pequeña y gran escala. Por ejemplo la enzima terapéutica L-
asparaginasa puede liberarse por tratamiento de Erwinia chrysanthemi a un pH
alcalino entre 11.0 y 12.5, durante 20 minutos.4 el éxito del tratamiento depende de la
estabilidad en álcali del producto a obtener. El elevado pH puede inactivar las
proteasas y este método también es valioso en la inactivación lisis de
microorganismos manipulados por ingeniería genética.
3
(R. Kobayashi, T. Miwa, S. Yamamoto, and S: Nagasaki, Eur. J. Appl. Miccrobiol. Technol., 1982, 15, 14.)
4
(T. Atkinson, B. J. Capel, and R. F. Sherwood, in `safety in industrial microbiology`, ed c. h. Collins and A.
J. Beale, butterworth, Oxford, 1992, p. 161.)
• Detergentes.
Los detergentes, tanto iónicos, como es el caso del lauril sulfato sódico, colato sódico
(aniónico) y el bromuro de cetiltrimetilamonio (catiónico), o no-iónicos, por ejemplo el
tritón X-100, X-450 o incluso el Tween, se han utilizado para favorecer la lisis celular.
Los detergentes iónicos son más reactivos que los detergentes no-iónicos y pueden
ocasionar la desnaturalización de muchas proteínas.
La presencia de detergentes puede afectar también a las etapas posteriores de
purificación, en particular a la precipitación proteica por tratamiento con sales. Esto
puede superarse en muchos casos con el uso de cromatografía de intercambio iónico
o por ultrafiltración
el tritón X-100 ha sido empleado para la liberación a gran escala del colesterol
oxidasa a partir de Nocardia sp.5y el colato sódico se ha utilizado para solubilizar
pululanasa una enzima ligada a membrana, a partir de células intactas de Krebsiella
pneumoniae.6
• Choque osmótico.
5
(B. C.Buckland, W. Richamond, p. Cunnill, and M. D. Lilly, in `industrial Apsects of Biochemestry`, ed. B.
Spencer, North Holland Publishing company, Amsterdam, 1974. P.65.)
6
(6 K. H. Kroner, H. Hustedt, S. Granda, and M-R. Kula, Biotechnol. Bioeng., 1978, 20, 2967.)
7
Neu and L. A. Heppel, J. Biol. Chem., 1965, 240, 3685.
8
S. E. Charm and C. C. Matteo, Methods Enzymol., 1971, 22, 476.
Un elevado número de factores influyen en la proporción de células lisadas, entre ellos
el tamaño y concentración de bolas de vidrio, el tipo, la concentración y la edad de las
células, la velocidad de agitación, el flujo a través de la cámara, la temperatura de
ruptura y la disposición de los discos del agitador, habiéndose investigado todos ellos
para levaduras10 y para bacterias.11
Tamización sólida
El método implica la extrusión del material celular congelado a través de un orificio de
pequeño diámetro y a una presión elevada, manteniendo la temperatura próxima a
-20°C. Se ha descrito un proceso semicontinuo, basado en una prensa X a escala de
laboratorio, el cual presenta un peso de 10 Kg de pasta celular bacteriana por hora a
una presión de 150 MPa y con una deficiencia del 90 % en la ruptura.12
Tamización líquida
Las células en una suspensión líquida son forzadas a pasar a través de un orificio de
pequeño diámetro bajo una presión muy elevada. Para trabajos a pequeña escala se
puede emplear una versión continua de la Prensa Frech
PURIFICACIÓN INICIAL
Centrífugas
Existen diferentes centrífugas con rangos de capacidad desde las de menos de 1 ml
hasta aquellas que superan varios litros, capaces de aplicar una fuerza centrífuga
superior a 100.000 g. Sin embargo, para la eliminación de células bacterianas, de
restos celulares o de los precipitados proteicos es suficiente disponer de 20.000 g.
Las centrífugas de cámara hueca tienen un rotor tubular que provoca un flujo de
extracto elevado, el cual se bombea en el fondo y fluye hacia la superficie de la
cámara. El material particulado se deposita en las paredes del rotor y los extractos
clarificados salen por la parte superior y son recogidos en un recipiente receptor.
La facilidad para cambiar el rotor o la utilización de un mecanismo de transporte para
recuperar el sedimento han contribuido a la popularidad de este tipo de centrífugas.
15
P. P. Gray, P. Dunnill, and M. D. Lilly, in proceedings of the IVth International Fermentation Symposium,
ed. G. Terui, Socety for Fermentation Technology, Osaka, Japan, 1972, 347.
16
J. J. Higgins, D. J. Lewis, W. H. Daly, F. G. Mousqueira, P. Dunnill, and M. D. Lilly, Biothenol. Bioeng.,
1987, 20, 159.
17
R. F. Sherwood, R. G. Melton, S. M. Alwan, and P. Hughes, Eur. J. Biochem., 1985, 148, 447.
18
T. Atkinson, G. T. Banks, C. J. Bruton, M. J. Comer, R. Jakes, T. Kamalagharan, A. R. Whitaker, and
G.P. Winter, J Appl. Biochem., 1979, 1, 247.
19
M. J. Comer, C. J. Bruton, and T. Atkinson, J Appl. Biochem., 1979, 1, 259.
21
P. M. Hammond, T. Atkinson, M. D. Scawen, J Chromatogr., 1986, 366, 79.
22
C. R. Goward, R. Hartwell, T. Atkinson, and M. D. Scawen, Biochem. J., 1986, 237, 415
Los rotores de estos instrumentos que carecen de la facilidad para descarga del
sedimento durante el proceso son difíciles de limpiar y ello puede resultar en una
perdida de producto cuando se necesitan estos sólidos.
Centrifugas de ese tipo son comercializadas por De Laval Separator Co. (Nueva
York; USA) wesfalia separator Ltd. (wolver ton, UK) y por Bird machine co. (south
Walpole, Massachusetts, USA). Existe una revisión del desarrollo y la construcción de
separadores para centrifugas en gran escala.23
Centrifugas de cestillo
Las membranas con una estructura de poro asimétrica son bastante menos propensas
a ensuciarse. Este tipo de membranas se han utilizados para separar arilacilamidasa
de restos celulares de Pseudomonas. Membranas de este mismo tipo también se han
usado en mayor escala para obtener L-asparaginasa a partir de Erwinia chrysanthemi.
Esta misma estructura se empleo también para clarificar un extracto producido
mediante la lisis alcalina de estas bacterias.
23
H. Hemford and W. Kohlstette, Chem. Ind., 1985, 108, 412.
24
M. Hoare, P. Dunnill, and D. J. Bell, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1983, 413, 254.
SEPARACIÓN ACUOSA BIFÁSICA
PRECIPITACION
Sulfato amónico
Solventes orgánicos
La adición de solventes orgánicos a soluciones acuosas reduce la solubilidad de las
proteínas al disminuir la constante dieléctrica del medio. Siendo los más utilizados el
etanol, la acetona y el 2-propanol, que es el más empleado. Debido a que las
proteínas se desnaturalizan en presencia de solventes orgánicos es aconsejable
trabajar a temperaturas inferiores a 0⁰C.
Existen otros agentes precipitantes orgánicos que pueden ser empleados para el
fraccionamiento de proteínas; entre ellos nos encontramos los polímeros
acuosolubles, de los cuales es el polietilenglicol el más ampliamente utilizado. Este
compuesto presenta las siguientes ventajas: no es toxico, no es inflamable y además
no produce la desnaturalización de proteínas.48 Se usa fundamentalmente en el campo
del procesamiento de sangre.49
CROMATOGRAFIA
48
K. C. Ingham, methods Enzymol. 1984, 104, 351.
49
Y. L. Hao, W. Hoenig, and M. Wickerhauser, in `Methods of Plasma Fractionation`, ed. J. Curling,
Academic press, New York, 1980, p. 57.
Optimización del salto de escala y de la calidad del proceso
Los niveles de pureza deben ser extremadamente elevados, y esto podría eliminar
ciertos abordajes para el salto de escala. La demostración de pureza es una
consideración importante para lograr un proceso de calidad y ha conducido a la
necesidad de complejas estratégicas para el análisis de la pureza de las proteínas
incluso donde estas proteínas de uso farmacéutico se han producido mediante
tecnología de DNA recombinante.51
51
V. R. Anicetti, B. A. Keyt, and W. S. Hancock, Trend Biotechnol., 1989, 7, 342.
Selección de la metodología
Para obtención y separación de proteínas a gran escala se puede emplear cualquier
de las técnicas cromatrograficas disponibles: filtración a través de geles, intercambio
iónico, interacción hidrofobica , afinidad, inmunoafinidad, y electroenfoque.
En este sentido, etapas en las que se produce una concentración del producto, como
es la cromatografía de afinidad, hidrofobica o de intercambio iónico deben realizarse
antes que aquellas que causan una dilución, como es el caso de la filtración a través
de geles. La cromatografía de interacción hidrofobica puede realizarse posteriormente
a una de intercambio iónico con un cambio mínimo en el tampón, puesto que la
mayoría de las proteínas se unen mas fuertemente a un soporte hidrofobica a fuerzas
iónicas altas.
Elección de la matriz
Quizás la decisión mas importante que se debe tomar cuando se diseña un proceso de
purificación a gran escala sea la concerniente a la selección del tipo de matriz de
cromatografía. Una matriz de cromatografía a gran escala deberá ser hidrofilica,
macroporosa, rígida, con partículas esféricas, químicamente estable, ligandos
delicados y de fácil modificación.
Algunos geles, como los basados en agarosa o celulosa, son productos naturales;
otros, como aquellos basados en dextranos entrecruzados o agarosa, son productos
Naturales modificados; un tercer grupo esta basado en componentes totalmente
sintéticos tales como la poliacrilamida, el polihidroxietilmetacrilato o el poliestireno.
Los geles pueden clasificarse además en macroporosos, como los geles de agarosa o
de celulosa, o microporos como los geles de dextrano o de poliacrilamida con enlaces
entrecruzados. Los geles macroporosos son de mayor utilidad en la cromatografía de
afinidad o de intercambio ionico o para el fraccionamiento de moléculas de gran
tamaño, virus, proteínas muy grandes, o micro proteínas.
Las moléculas de tamaño, incapaces de atravesar los poros, pasan a través de los
espacios intersticiales y eluyen en primer lugar. Las moléculas más pequeñas que
pueden pasar a través de los poros, se eluyen posteriormente, en orden decreciente
de tamaño.
Vt = V0 + Vi + Vm (2)
El volumen de elución de una proteína puede por tanto variar entre, V0 para
una proteína que no penetra en los poros del gel, y Vi para aquellas que son capaces
de entrar en la matriz. Así es posible calcular un coeficiente de partición efectivo, Kav,
el cual varía entre 0 y 1.
Para el trabajo a gran escala, la rigidez es quizás el factor más importante ya que
determina la velocidad de flujo que se puede utilizar.
Por esta razón, la mayoría de las aplicaciones del gel filtración se limitan a proceso de
eliminación de sales, empleando geles de baja porosidad, aunque sean rígidos como
es el caso de Sephadex G-25 y G.50.
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
Adsorbido en presencia
de 0,2 mM Zn2+ y tris
Carboxipeptidasa G2 C1H 0,1 M, eluido con
10 mM EDTA pH 5,8y
Proción rojo H-8BN después, con tris-C1H
0,1 M pH 7.3
Los colorantes son, a menudo, estructuras del tipo de la antraquinona, que unen
proteínas por la interacción con los dominios de unión a nucleótidos de las
deshidrogenasas. Han sido aislados muchos otro tipos de proteínas con estos
colorantes, 56 por lo que se piensa que la interacción específica para cada caso debe
ser mas variable y, en las mayoría de los casos, desconocida.
Puesto que la cromatografía de afinidad presenta una alta selectividad, es por lo que
se pueden purificar proteínas varios miles de veces en un solo paso. A menudo, es
posible separar formas activas e inactivas de una proteína, mediante el uso de un
anticuerpo o pseudosubstrato, o eliminar una pequeña cantidad de impureza de un
producto puro. Existen otros muchos ejemplos sobre la utilidad de esta metodología en
procesos a gran escala, entre ellos están los descritos por Hill y Hirtenstein y Clonis.64
56
M. D. A. Scawen and T. Atkinson in `Reactive Dyes in Protein and Ensyme Technology`, ed. Y. D.
Clonis, C. R. Lowe, T. Atkinson, aand C. J. Bruton, Macmillan, London, 1987, p.76.
61
G. W. Jack and R. Blazek, J. Chem. Tech. Biotechnol., 1987, 39, 1.
62
G. Q. Jack, R. Blazek, K. james, J. E. Boyd, and L. R. Micklem. J. Chem. Biothecnol., 1987, 39, 45.
Se pueden usar iones metálicos inmovilizados, como Zn2+ o Ni2+, para separar
proteínas. Esta separación depende de la interacción entre el ion metálico y los
residuos de histidina de la superficie proteica. El ion se inmoviliza quelandolo a un
grupo iminodiacetato que, a su vez, está unido a una matriz adecuada, normalmente
agarosa. Las proteínas unidas se pueden eluir usando un ligando competitivo, como
por ejemplo el imidazol. 65
Los criterios para elegir una matriz de cromatografía de afinidad son similares a
aquellos que se usan para cromatografía de intercambio iónico. Como resultado de
ello, las más usadas matrices macroporosas, como Sefarosa o Trisacryl. La matriz ha
de ser activada químicamente para unir covalentemente al ligando. Existen muchos
métodos para hacerlo, 66 pero el más habitual es el de bromuro de cianógeno.
También se pueden adquirir matrices activadas de los proveedores de productos de
cromatografía si no se desea hacerlo por uno mismo. Los colorantes tienen la
desventaja de que pueden ser acoplados directamente a la agarosa sin previa
activación. 56, 67
Los métodos para eluir una proteína ligada pueden ser específicos, mediante el uso de
un substrato o cofactor, o no específicos, por ejemplo modificando el pH o la
concentración salina. La elución no-especifica se utiliza habitualmente cuando
adsorbentes muy selectivos se unen a un solo componente; con adsorbentes menos
selectivos se unen a un solo componente; con adsorbentes menos selectivos, la
elución especifica proporciona mayor grado de purificación. Para la elución se puede
emplear, un substrato o ligando libre, cambios en el pH o la fuerza iónica, la adición de
agentes desnaturalizantes o caotropicos (por ej., KSCN, urea, hipoclorito de
guanidino), o cambios en la polaridad de los solventes, por adición de un modificador
orgánico, como es el etilenglicol.
Se prefiere el método mas suave, que, por lo general, se encuentra de forma empírica,
siendo importante en muchos casos las consideraciones económicas. Aunque los
procesos de purificación por afinidad pueden realizarse directamente o en columnas,
se lleva a cabo generalmente en estas ultimas.
Las interacciones hidrofobicas son más fuertes a fuerza iónica alta, con lo que, a
menudo, la absorción puede ser llevada a cabo tras la precipitación salina o la
cromatografía de intercambio iónico, sin necesidad de modificar la concentración
salina de la muestra. Las proteínas ligadas se puede eluir alterando el pH del
solvente, la fuerza iónica o mediante el empleo de un agente caotropico o un
modificador orgánico tal como el etilenglicol.
65
E. Sulkowski, Trends Biotechnol., 1985, 3, 1.
66
M. Wilchek, T. Miron,and J. Kohn, Methods Enzymol., 1984, 104, 3.
67
C. R. Lowe and J. C. Pearson, Methods Enzymol., 1984, 104, 97.
68
S. Shaltiel, Methods Enzymol., 1984, 104, 69.
64
E. A. Hill and M. d. Hirstenstein, in `Advances in Biotechnological Processes`ed. A. Mizrahi and A. van
Wezwl, Ala R. Liss, New York, 1983, p.31.ç64 Y. D. Clonis, Biol Technology, 1987, 5, 1290.
Los iones utilizados se pueden agrupar en series dependiendo de si promueven
interacciones hidrofobicas (efecto de eliminación de sales) o si se rompe la estructura
del agua (efecto caotropico) para debilitar la fuerza de interacción hidrofobica.
La eficacia de las matrices de HPLC se deriva del pequeño tamaño de sus partículas
(3 a 50µm), necesitándose presiones elevadas para generar velocidades de flujo
adecuadas. Por ello, se necesitan partículas muy rígidas y, en este sentido, se han
realizado dos aproximaciones para resolver este problema. Las matrices de sílice son
los suficientemente rígidos y pueden ser activadas de forma adecuada como
monocloro-o monoalcoxi-silanos para producir una superficie hidrofilica que puede
posteriormente modificarse.71 sin embargo, presentan la desventaja de ser inestables a
pH superior a 8; este problema se ha solucionado mediante el recubrimiento de un
polímero para reducir las disponibilidad de las partículas inorgánicas al solvente, o
más específicamente por estabilización de la superficie con sirconio. Las segunda
aproximación ha sido el desarrollo de soportes poliméricos rígidos con enlaces entre
cruzados, como el monobeads (pharmacia) o el TSK-PW (tosoHaas).
69.
C. Horvath, `High Performance Liquid Chromatography: Advances and perspectives, Vol. 3`, Academic
Press, New York, 1983.
70
J. F. Kennedy, Z. S. Rivera, and C. A. White, J. Biotechnol., 1989, 9, 83.
71
R. E. Majors, in ` High Performance Liquid Chromatography: Advances and perspectives, Vol. 1`, ed. C.
Horvath, Academic Press, New York, 1981, p. 2.
Otra aproximación del problema de las velocidades de flujo y la presión en
separaciones de alta resolución ha sido la cromatografía de perfusión.72
ULTRAFILTRACION
72
N. B. Afeyan, S. P. Fulton, N. F. Gordon, I. Mazsaroff, L. Varady, and F. E. Regnier, Biol. Technology,
1990,8, 203.
73
S. J. Brewer and B. R. Larsen in `Separations for Biotechnology`, ed. M. S. Virrall and M. J. Hudson,,
Ellis Horwood, Chichester, 1987, p. 113.
74
S. Ohlson, L. Hansson, M. Glad, K. Mosbach, and P-O. Larsson, Trends Biotechhnol., 1989, 7, 179.
De esta forma, la purificación final se simplifica. Estos altos niveles de expresión
pueden provocar que la proteína se produzca como granulos denso e insolubles
denominados cuerpos de inclusión. Se ha observado con muchas proteínas
recombinantes, como por ejemplo, laurogastrona, la interleuquina 2, la proquimosina y
los interferones. Tras la rotura celular, se pueden sedimentar los gránulos a pocas
revoluciones produciendo un material insoluble que contiene hasta un 50% de la
proteína buscada. La solubilización y re naturalización de este material, especialmente
cuando tiene enlaces disulfuro, Es difícil y requiere condiciones muy controladas. La
solubilizacion precisa del uso de pH alto, urea o cloruro de guanidino; la eliminación de
estos reactivos hace que la proteína precipite en solución acuosa.
Uno de los primero ejemplos fue la fusión de algunos residuos de arginina al extremo
carboxi-terminal de la urogastrona. Esto hace convertirse a la proteína en
extremadamente básica y unirse frecuentemente a una matriz de intercambio ionico
cationico. Al unirse a este tipo de matrices solo un 10% de las proteínas totales
celulares, se puede obtener una gran purificación al eluir dicha columna. La columna
de poliargininas puede ser eliminada tras la purificación mediante una carboxi-
peptidasa A inmovilizada; al ser introducida la proteína tratada otra ves en la misma
columna la posición en la que eluye cambia, pero no la de los contaminantes que se
hubiese podido arrastrar. Se han descrito otras funciones que permiten purificar
posteriormente por afinidad
80
R. Wetzel, L. J. Perrry, and C. Veilleux, Biol Technology, 1991, 9, 731.
Cola Matriz o ligando Condiciones de Condiciones de
unión elución
poliargininaa S-Seforosa pH 4-8 Gradinete de NaCl
polifenialaninab Fenil sefarosa (NH4) SO41m, pH7
Etilenglicol
polihistidinac Nitroltriacetato pH8 +-HCl de
Gradiente de pH
sefarosa (Ni2+) guanidino
bajo +-HCl de
guanidino
Dipeptido His-Trp4 Iminodiacetato pH8 Gradiente de pH
2+
sefarosa (Ni ) bajo
Péptido Anticupero anti Flag NaCl 0.15 M, CaCl EDTA, pH 7.4
antigenicocFlagTM pH7.8 2 1Mm
b-galactosidasaf Sefarosa TPEG 1.6 M NaCl, pH7 Borato 0.1 M
Colramfenicol p- NaCl 0.3M pH 7.8 Cloramfenicol 5mM
acetiltransferasag amonicloranfenicol
sefarosa
Proteína Ah Sefarosa con IgG pH 7.6 Acido acético 0.5 M
Gltation S- Sefarosa con pH7.3 Agente reductor de
j.k
trasnferasa glutation tioles
S.J. Brewer and H.M Sassenfeld, trends. Biotechnol., 1985, 3, 119. b M. person, M.G.
Bergstrand, l. bulow, and K. Moosbach, Anal. Biochem. , 1988, 172, 330. E. Hochui, W.
Bannwarth, H. dobeli, R. gentz , and D. Stuber, Bio/Technology, 1988, 6, 1321.
d
M.C.smith, T.C. furman, T.D. INGOLIA, AND c. Pidgeon, J. boil. Chem.., 1988, 263,
7211. Ct.p. Hopp, K.S. Prickett, V.L. Price, R.T.Libby, C.J. March, D.L. Urdal, and P.J.
Colon, Bio/Technology, 1988, 6, 1204. A.Ullman, Gene, 1984, 29, 27.gJ. A. Knott, C.A.
Sullivan, and A. Weston . Sankar and A.G. Porter, J.Virol, 1991, 65, 2993.kD.B. Smith
and K.S.Johnson, Gene, 1988,67,31.
Los problemas de purificación de fusiones por afinidad son, en 1 lugar los derivados de
las condiciones necesarias para la posterior elución y, en 2 lugar, los inherentes al
eliminación de la cola de afinidad una ves que sea purificada la proteína. Un ejemplo
son las funciones de la proteína A, que aunque se han aplicado con éxito al factor de
crecimiento similar a la insulina (IGF-1)84, a la fosfatasa alcalina proteína muy estable,
y, con menor éxito a la galactosidasa, 85 adolecen de 2 ventas. La 1 es que si se
utilizan las condiciones extremas de pH o grandes concentraciones de sustancias
caotropicas que se requieren para eluir a la proteína A de la IgG inmovilizada ne la
columna, las proteínas de fusión pueden desnaturalizarse.
CONCLUSION
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del
análisis de los ácidos nucleicos y proteínas. Y así como el microscopio
permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis
nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas (de los cual se trato
este trabajo) al final del procedimiento.
CAPITULO 17
Etapas posteriores de procesamiento: extracción y purificación de proteínas
M.D. SCAWEN, T. ATKINSON, P.M. HAMMOND, Y R.F. SHERWOOD
Página: Proteína
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