I.

Hari/tanggal : Selasa, 5 April 2010

II. Judul Praktikum : Pewarnaan Tahan Asam ( Zeihl neelsen )
III.Tujuan Praktikum
1. Melihat morfologi dan sifat tahan asam dari bakteri
2. Untuk mencari BTA
IV. Dasar Teori
Pemeriksaan dahak secara mikroskopik dengan pewarnaan
Basil Tahan Asam (BTA) merupakan pemeriksaan yang sederhana,
cepat, murah, dan cukup sensitif untuk mendukung diagnosis
penyakit tuberkulosis serta untuk menilai kemajuan pengobatan.
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan metoda pewarnaan
BTA terbaik yang dapat digunakan secara rutin terutama di
laboratorium dengan beban pekerjaan yang cukup tinggi.
Sensitivitas, spesifisitas, nilai prediksi positif dan negatif tiga
macam metode pewarnaan BTA, yaitu Tan Thiam Hok, Ziehl
Neelsen, dan Fluorokrom, dibandingkan terhadap hasil biakan
dahak pada medium padat Lowenstein Jensen sebagai baku emas.
Intepretasi hasil pewarnaan mengacu pada skala IUTLD.
Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis didapatkan pada 27
dari 98 spesimen sputum (27,6%) berasal dari 98 penderita
tersangka tuberculosis. Sensitivitas metoda pewarnaan Tan Thiam
Hok, Ziehl Neelsen, dan Fluorokrom adalah 62,9%, 81,5%, dan
92,6%, sedangkan spesifisitasnya berturut-turut adalah 92,9%,
91,6%, dan 91,1%. Nilai prediksi positif berturut-turut adalah
77,3%, 78,6%, dan 71,4%, sedangkan nilai prediksi negatif adalah
86,8%, 92,9%, dan 96,8%. Dari penelitian ini didapatkan bahwa
Ziehl Neelsen merupaka metoda terbaik dan dapat dilakukan di
laboratorium sederhana.
Salah satu bahan yang digunakan untuk mendiagnosa adalah
dahak atau sputum. Dahak yang diperiksa paling sedikit 3-5 cc.
Jika jumlah kuman kurang dari 5000 dalam 1 cc dahak, maka itu
tidak akan kelihatan di bawah mikroskop.

1
 Dahak yang diambil ialah dahak yang kental kuning
kehijauan sebanyak 3-5 cc, dengan waktu pengambilan sebagai
berikut :
♣ Dahak sewaktu, penderita datang berobat dengan keluhan
apa saja ke poliklinik.
♣ Dahak pagi, yang diambil besok paginya begitu bangun tidur
♣ Dahak sewaktu, yang diambil sewaktu penderita mengantar
dahak pagi tersebut.
Ludah tidak dapat diperiksa karena ludah berasal dari
kelenjar dalam rongga mulut. Biasanya dalam ludah tidak
terdapat kuman TB.
Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat
warna karbol-fuchsin (fuchsin basayang dilarutkan dalam suatu
campuran phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam
klorida dalam alkohol. Sediaan sel bakteri pada gelas alas disiram
dengan cairan karbol fuchsin kemudian dipanaskan sampai keluar
uap. Setelah itu, zat warna dicuci dengan asam alkohol dan
akhirnya diberi warna kontras (biru atau hijau). Bakteri-bakteri
tahan asam (spesies Mycobakterium dan beberapa Actinomycetes
yang serumpun) berwarna merah dan yang lain-lain akan
berwarna sesuai warna kontras.
Mycrobakteria adalah bakteri aerob berbentuk batang,
yang tidak membentuk spora. Walaupun tidak mudah diwarnai
bakteri ini tahan terhadap penghilangan warna (deklorisasi) oleh
asam atau alkohol dan karena itu dinamakan basil tahan asam.
Ciri –ciri khas Mycobakterium tuberculosis dalam jaringan, basil
tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0,4
x 3 µm. Pada perbenihan buatan terlihat bentuk coccus dan
filamen. Mycobakteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai gram
positif atau gram negatif. Sekali diwarnai dengan zat warna basa,
warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan alkohol, meski
dibubuhi dengan iodium. Basil tuberkel yang sebenarnya ditandai
oleh sifat tahan asam misalnya 95 % etil alkohol yang
mengandung 3 % asam hidroklorida (asam alkohol) dengan cepat

2
 akan menghilangkan warna semua bakteri kecuali Mycobakteria.
Sifat tahan asam ini bergantung pada integritas struktur selubung
berlilin. Pada dahak atau irisan jaringan, Mycobakteria dapat
diperlihatkan karena memberi fluoresensi kuning jingga setelah
diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya auramin,
rodamin).

V. Alat dan Bahan

 Alat
o Mikroskop
o Ose
o Lampu spritus
o Objek gelas
o Gelas sediaan
 Bahan
o Sputum/dahak
o Carbol Fuchsin
o Alkohol 70%
o methylen blue 0,3%
o Minyak Immersi

VI. Metode Kerja :

1. Pakailah masker sebelum mulai praktikum
2. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
3. Diambil kaca sediaan yang bersih, bebas lemak dan tidak ada
goresan.
4. Disiapkan sebuah kaca sediaan yang diberi tanda ukuran 2X3
cm sebagai pola.
5. Diletakkan kaca pola dibawah kaca sediaan.
6. Lampu speritus dinyalakan dan ose dipanaskan sampai
membara mulai ujung sampai kepangkal.

3
7. Dengan menggunakan ose steril lalu diambil bagian sputum
yang kental berwarna putih kekuninggan atau putih kehijauan,
lalu diletakkan pada kaca sediaan.
8. Sputum diratakan
9. Kemudian tangkai ose digoyangkan pelan-pelan untuk
melepaskan sisa partikel sputum yang melekat pada ose.
10. Letakkan ose berdekatan pada api spiritus, setelah kering
barulah dibakar sampai pijar.
11. Keringkan sediaan pada suhu kamar, jangan dikeringkan
di atas nyala api. sediaan dilewatkan diatas nyala api lampu
speritus sebanyak 3 X selama 3-5 detik.
12. Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan dengan apusan
menghadap ke atas.
13. Tuangkan Carbol Fuchsin sampai menutupi seluruh
permukaan kaca sediaan.
14. Panaskan kaca sediaan secara hati-hati dengan caara
melewatkan nyala api pada bagian bawah kaca sehingga keluar
uap(jangan sampai mendidih) selama 3 menit.
15. Sediaan dibiarkan hingga dinginn selama 5 menit.
16. Sediaan dicuci dengan air mengalir.
17. Tuangkan asam alkohol 70% di atas kaca sediaan sampai
warna merah dari fuchsin hilang.
18. Sediaan dicuci dengann air mengalir
19. Tuangkan larutan methylen blue 0,3% diatas sediaan dan
biarkan selama 10-20 detik atau larutan methylen blue 0,1%
selama 1 menit.
20. Sediaan dicuci dengan air mengalir dan keringkan pada suhu
kamar.
21. Sediaan yang sudah kering diperiksa dibawah mikroskop.
22. Teteskan satu tetes minyak emersi diatas sediaan, periksa
dengan okuler 10X dan objektif 100X.
23. Carilah basil tahan asam (BTA) yang berwarna merah dengan
latar belakang biru.

4
 24. Periksa paling sedikit 100 lapangan pandang dengan cara
menggeserkan sediaan dari kiri ke kanan atau dari kanan ke
kiripada garis lurus.
25. Foto hasil pengamatan dan buatkan laporan

VII. Pembahasan
Pewarnaan Basil Tahan Asam (BTA) merupakan uji
makroskopik yang memiliki nilai diagnosa yang tinggi karena
pemeriksaan tersebut dapat memangkas isolasi bakteri yang akan
memakan waktu sampai 8 minggu. Cara pengambilan spesimen
harus di perhatikan, contohnya dalam pengambilan sampel darah
atau dahak / sputum bukan hanya harus dilakukan secara aseptik
untuk menghindari kontaminasi, namun juga harus diperhatikan
waktu pengambilannya, karena infeksi bakteri memiliki siklus
tertentu. Hati-hati dengan hasil false positive dan false negative.
False positif maksudnya dalam sampel seharusnya tidak
ditemukan bakteri namun dalam pelaporan / pengerjaan
ditemukan bakteri. Hal ini bisa terjadi bila dalam pengerjaan
terjadi kontaminasi. False negatif maksudnya dalam sampel
seharusnya terdapat bakteri namun dalam pengerjaan / pelaporan
tidak ditemukan bakteri. Hal ini bisa terjadi karena kurangnya
ketelitian dalam penggunaan ose.
Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3%
dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan
diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih
atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin
selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci
dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam
alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan
dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama
1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue
0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1
menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir.

5
 Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan
lemak yang sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan
pemanasan maka lapisan lilin dan lemak itu dapat ditembus cat
basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin dan lemak yang
terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam
alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak
tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen
blue.
Pembacaan hasil dilakukan dengan menggunakan skala IUATLD
sebagai berikut :
• Tidak ditemukan BTA dalam 100 lapangan pandang : Negatif
• Ditemukan 1-9 BTA/ 100 lapangan pandang : Ditulis jumlah
kuman yang ditemukan.
• Ditemukan 10-99 BTA/ 100 lapangan pandang : + (1+)
• Ditemukan 1-10 BTA/ 1 lapangan pandang : ++ (2+)
• Ditemukan > 10 BTA/ 1 lapangan pandang : +++ (3+)

VIII. Hasil Pengamatan

Basil Tahan

Asam

IX. Kesimpulan
Setelah dilakukan pewarnaan di laboratorium secara
mikroskopik, dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen dapat dilakukan
6
identifikasi bakteri tahan asam, dimana bakteri akan terbagi
menjadi dua golongan:
ϕ Bakteri tahan asam, adalah bakteri yang pada pengecatan
Ziehl-Neelsen tetap mengikat warna pertama, tidak luntur oleh
asam dan alkohol, sehingga tidak mampu mengikat warna
kedua. Dibawah mikroskop tampak bakteri berwarna merah
dengan warna dasar biru muda.
ϕ Bakteri tidak tahan asam, adalah bakteri yang pada
pewarnaan Ziehl-Neelsen, warna pertama, yang diberikan
dilunturkan oleh asam dan alkohol, sehingga bakteri akan
mengikat warna kedua. Dibawah miskroskop tampak bakteri
berwarna biru tua dengan warna dasar biru yang lebih muda.
ϕ Interpretasi hasil : BTA : warna merah dan Non BTA : warna
biru