Anda di halaman 1dari 9

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

“ PENENTUAN KADAR KOLESTEROL


DENGAN METODE CHOD-PAP “

Disusun oleh:
Hayu Ajeng Anggana Raras (098114004)
Amelia Felicia Cornelius Putri (098114005)
Kenny Ryan Limanto (098114006)

LABORATORIUM BIOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2010
PERCOBAAN V
PENENTUAN KADAR KOLESTEROL
DENGAN METODE CHOD-PAP

A. TUJUAN
Menentukan kadar kolesterol dalam serum tikus dengan metode CHOD-PAP

B. DASAR TEORI
Kolesterol adalah salah satu jenis lemak atau senyawa lipid di dalam tubuh.
Tubuh memeperoleh kolesterol dari sumber makanan eksogen (diet) dan sintesis
lemak endogen (diproduksi oleh tubuh). Kolesterol dalam beberapa lemak di dalam
darah seperti trigliserida dan fosfolipid merupakan senyawa organic yang tidak larut
di dalam plasama (cairan) darah, tetapi terikat oleh sutau protein yang disebut
lipoprotein. Ada 5 jenis protein, yaitu kilomikron, very low density lipoprotein
(VLDL), intermediet density lipoprotein (IDL), low density lipoprotein (LDL), dan
high density lipoprotein (HDL). Kelima jenis lipoprotein tersebut, kilomikron dan
VLDL lebih banyak mengandung porsi trigliserida, sedangkan LDL dan HDL lebih
banyak mengandung porsi kolesterol (Mayes, 1995).
Kolesterol adalah salah satu sterol yang penting dan terdapat banyak di alam.
Dari rumus kolesterol dapat dilihat bahwa gugus hidroksil yang terdapat pada atom C
nomor 3 mempunyai posisi β oleh karena itu dihubungkan dengan garis penuh.

H H

HO
cholesterol

Kolesterol terdapat pula pada hampir semua sel hewan dan semua manusia. Pada
manusia kolesterol terdapat dalam darah, empedu, kelenjar adrenal bagian luar
(adrena kortex) dan jaringan syarat (Poedjiadi, 1994).
Serum adalah cairan tubuh yang mengandung system kekebalan terhadap
suatu kuman. Serum terdapat dalam darah berupa cairan bening pada darah yang
membeku (Seda, 2008).
Biosintesis kolesterol dapat dibagi menjadi 5 tahap:
i. Sintesis mevalonat, suatu senyawa 6- karbon dan asetil Ko-A.
ii. Enam isoprenoid mengadakan kondensasi untuk membentuk senyawa
skualena.
iii. Unit isoprenioid dibentuk dari mevalonat melalui pelpasan CO2.
iv. Skualena mengalami siklisasi untuk mengahsilakn senyawa steroid
induk.
v. Kolesterol dibenruk dari kolesterol setelah melewati beberapa tahap
selanjutnya termasuk pelepasan 3 gugus metil.
Sementara itu, pemeriksaan kadar kolesterol total menggunakan penetapan
kadar kolesterol serum dengan metode enzimatik Fotometrik test CHOD-PAP
(Cholesterol Oxidase Phenol Aminoantipyrin). Prinsip metode ini adalah penguraian
kolesterol dan esternya menjadi peroksida dengan hidrolisa dan oksidasi enzimatik.

enzimkolesterol esterase
kolesterol ester kolesterol + asamlemak

kolesterol enzimkolesterol oksidase


(bebas + ester) - 4 - kolestenon + H2O2
O2

H2O2 + fenol + enzimperoksidase 4-(p-benzoquinonemonoimin)


4-aminofenon fenazon
(Anonim, 2007).
C. ALAT DAN BAHAN
Alat:
1. Mikrolab – 200
2. Sentrifuge
3. Mikropipet
4. Tabung reaksi

Bahan:
1. Serum/plasma darah tikus
2. Reagen:
- Buffer fosfat pH 6,5 100 mmol/l
- Fenol 5 mmol/l
- 4-aminoantipirin 0,25 mmol/l
- Kolesterol esterase ≥150 kU/l
- Kolesterol oksidase ≥100 kU/l
- Peroksidase ≥ 5 kU/l

D. SKEMA KERJA
Ambil serum sebanyak 10 µl , ditambah reagen sebanyak 1 ml, divortex

Diamkan selama operating time (10 menit)

Ukur aktivitas serum dengan mikrolab-200 (λ= 505 nm)

Ukur serapan blanko dan standar sebelum melakukan pengukuran sampel


E. DATA DAN ANALISA
Kadar Rerata
Keterangan Absorbansi (x - ) (x - ̅ )2
(mg/ dL)
Standar 1 - 1,420 abs
Standar 2 187 0,474 abs
Standar 3 612 0,650 abs
Sampel 1.1 27 - -18.833 354,682
Sampel 1.2 11 - -34,833 1213,338
Sampel 2.1 57 - 11,167 124,702
45,833
Sampel 2.2 46 - 0,167 0,028
Sampel 3.1 61 - 15,167 230,038
Sampel 3.2 73 - 27,167 738,046
∑(x − ̅ ) = 2660,834

∑(x − x̅)2 2660,834


SD = = = 23,069
n−1 n−1
mg mg
Range ∶ x ± SD = 45,833 ± 23,069 = 68,902 dL − 22,764 dL
SD 23,069
CV = x100% = x100% = 50,333%
x 45,833

Larutan standar serum 1 serum2


F. PEMBAHASAN
Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk menetapkan kadar kolesterol
dalam serum tikus menggunakan metode CHOD-PAP. Prinsip pengukurannya adalah
kolesterol diukur setelah melalui proses oksidasi dan hidrolisis enzimatik. Indikator
kuinonimin dibentuk dari hidrogen peroksida dan 4-aminofenanzon yang berasal dari
fenol dan peroksidase.
Reaksi :

O
Cholesterol Esterase / CHE + C OH
+ H2O
R
O
air asamlemak
C
R O HO
kolesterolester kolesterol

+ O2 Cholesterol Oxidase / CHO + HO OH

oksigen hidrogen
peroksida
HO O
kolesterol cholestene-3one
N
N NH2
HO OH + + OH Peroxidase/ POD NH
hidrogen O + H2O
peroksida O
4-aminofenanzon kuinonimin air
Pertama-tama, darah tikus diambil pada bagian pembuluh darah sekitar mata
tikus menggunakan jarum berongga. Kemudian darah tikus ditampung di dalam
tabung sentrifuge dan kemudian di-sentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm, selama 15
menit (ini merupakan waktu dan kecapatan yang optimum dalam memisahkan antara
plasma darah dan serumnya). Prinsip dari sentrifuge adalah memisahkan serum dan
plasma berdasarkan prinsip BJ, dimana plasma berwarna lebih merah tua pekat,
sehingga berada pada bagian bawah tabung (BJ besar), sedangkan serum yang
berwarna merah bening (BJ kecil) akan berada pada bagian atas tabung.
Pada percobaan ini, reaksi yang terjadi adalah enzim kolesterol esterase akan
memperantarai hidrolisis kolesterol ester menjadi kolesterol bebas dan asam lemak.
Kemudian kolesterol bebas ini akan dioksidasi oleh enzim kolesterol oksidase yang
akan menghasilkan kolestenon dan hidrogen peroksida. Pada tahap selanjutnya,
hidrogen peroksida inilah yang akan bereaksi dengan 4-aminofenanzon dan fenol
membentuk kompleks kuinonimin yang berwarna merah muda. Reaksi ini akan
menimbulkan zat warna yang intensitasnya sebanding dengan kadar glukosa, yang
kemudian dapat diukur secara fotometrik.
Prinsip dari pengujian ini adalah dengan menembakkan panjang gelombang
tertentu (dalam percobaan ini, digunakan λ = 546 nm) pada suatu senyawa. Karena
cahaya yang ditembakkan mengandung energi ( = ℎ ), hal ini akan membuat
λ
elektron dari senyawa tersebut akan tereksitasi ke orbital yang lebih tinggi. Setelah
mengalami eksitasi, elektron tersebut akan turun kembali ke ground state (keadaan
dasar), sambil melepaskan emisi yang kemudian dapat diukur oleh Microlab-200.
Salah satu yang memegang peran dalam pengujian ini adalah gugusan kromofor
(ikatan rangkap terkonjugasi), yang dapat menangkap panjang gelombang tertentu.
Setelah serum didapat , diambil sebanyak 10 µL dan ditambahkan reagen
sebanyak 1000 µL dan di-gojog dengan tujuan agar serum dan reagen homogen.
Larutan direplikasi sebanyak 2, sehingga masing-masing tabung berisi 10 µL serum
dan 1000 µL reagen. Larutan blanko dibuat dengan mengambil aquadest sebanyak 10
µL. Tujuan dari pembuatan larutan blanko adalah untuk membuktikan bahwa
aquadest (pelarut) yang digunakan tidak memiliki daya absorbansi (sama dengan nol)
sehingga ketika kita mengukur sampel, hanya kadar yang ingin kita ukur saja (kadar
kolesterol) saja yang terbaca. Kemudian dibuat juga larutan standard yang berisi 1000
µL reagen dan 10 µL larutan standard kolesterol. Larutan standard ini sebagai
pembanding kedua sampel yang ada. Kemudian campuran tersebut didiamkan selama
10 menit (operating time). Hal ini dimaksudkan agar supaya didapatkan hasil optimal
di mana reagen dan serum bereaksi optimal.
Setelah itu, dilakukan pengukuran aktivitas serum dengan Microlab-200 pada
panjang gelombang 546 nm. Pada panjang gelombang inilah, diharapkan dihasilkan
daya absorbansinya optimal. Pada saat akan menggunakan Microlab, pipa perlu dicuci
dengan aquadest dengan tujuan supaya tidak terkontaminasi senyawa/ bahan-bahan
sebelumnya karena dapat mengganggu dalam pembacaan selanjutnya.
Pada data percobaan, standar 1 tidak dapat diukur kadarnya, karena larutan
yang digunakan telah habis. Hal ini dikarenakan pipeting dari praktikan yang salah.
Pada perhitungannya, didapatkan range kadar kolesterol sebesar 24,824 mg/ dL –
66,892 mg/dL. Dari range tersebut, angka yang tidak masuk dalam range data adalah
sampel 1.2 (11 mg/ dL) dan sampel 3.2 (73 mg/ dL). Berdasarkan dengan pustaka
yang diperoleh, dikatakan bahwa tikus putih mempunyai kadar kolesterol normal
sebesar 10-54 mg/dL (Kotiah, 2007).
Dari percobaan ini, ada angka-angka yang tidak sesuai dengan kadar
kolesterol normal pada tikus putih. Hal ini mungkin disebabkan pengerjaan praktikan
yang tidak teliti, sehingga angka yang dihasilkan tidak pada range hitung. Dari
percobaan ini, didapatkan nilai presisi (akurasi) sebesar 50,333%. Hal ini menandakan
percobaan yang dilakukan oleh praktikan tidak valid. Untuk mendapatkan nilai yang
valid, angka CV/ presisi harus kurang dari sama dengan 2%. Hal ini mungkin
dikarenakan pipeting dari praktikan yang tidak tepat, maupun pencucian alat yang
tidak bersih, sehingga dimungkinkan tertinggalnya zat pengotor yang mengacaukan
nilai kadar kolesterol yang didapatkan dengan alat Microlab-200.
Fungsi dari kolesterol adalah memebentuk membrane-membran sel prekusor
hormone steroid, pembentukan vitamin D, dan hormron-hormrno reproduksi.
G. KESIMPULAN
1. Dari percobaan yang telah dilakukan didapatkan data sebagai berikut:
a. Range kadar kolesterol yang didapat sebesar 22,764 mg/ dL – 68,902 mg/ dL,
b. Kadar rata-rata dari kolesterol yang diuji sebesar 45,833 mg/ dL.
2. Kadar kolesterol terbesar sebesar 73 mg/ dL, kadar kolesterol terkecil sebesar 11
mg/ dL.
3. Reaksi dalam percobaan ini adalah

H. DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2007, http://cantik-sehat.com/news/2007/02/20/perasan-segar-buncis/,
diakses pada tanggal 26 april 2010
Kotiah, A., PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK LIDAH BUAYA TERHADAP
KADAR KOLESTEROL HDL DAN LDL SERUM TIKUS PUTIH
HIPERKOLESTEROLEMI , http://digilib.unnes.ac.id/gsdl/collect/
skripsi/archives/HASH0172/9cec3420.dir/doc.pdf, diakses pada tanggal 26
April 2010
Mayes, D., 1995, Biokimia Harper edisi 22, 302-303, EGC, Jakarta
Poedjiadi, 1994, Dasar-Dasar Biokimia, 74-75, Erlangga, Jakarta
Yogyakarta, 25 April 2010
Praktikan

Hayu Ajeng Anggana R


(098114004)

Amelia Felicia C
(098114005)

Kenny Ryan L
(0988114006)