Anda di halaman 1dari 11

LAPORAN PRAKTIKUM

BIOLOGI MOLEKULER I

ISOLASI DNA

Oleh:
Annisa Nurul Chaerani
411109059

DIII ANALIS KESEHATAN


SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN
JENDERAL AHMAD YANI
CIMAHI
2010

1
ISOLASI DNA

A. Hari/ tanggal Praktikum

Selasa/ 22 Juni 2010

B. Tujuan

Untuk mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA

C. Prinsip
Sentrifugasi
DNA diikatkan dalam suatu fasa yaitu silica, setelah itu dilakukan
pencucian dengan buffer kemudian di elusi (dilarutkan).

D. Dasar Teori

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan


berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan
secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas.
Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan
berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria
dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.
Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya
mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda
dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang
tua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan
struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan

2
berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki
protein histon

DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu
DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel
berinti, seperti darah, semen, rambut, tulang, liur dan lain-lain. Bahan yang
paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut
beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh.

DNA genom yang diisolasi dapat digunakan untuk identifikasi DNA


suatu organisme, baik dengan metode PCR (polymerase chain reaction) atau
menggunakan enzim endonuklease restriksi (”DNA fingerprinting”). Hasil
pemeriksaan dari kedua teknik tersebut kemudian dapat digunakan untuk
diagnosis penyakit infeksi yang disebabkan oleh virus atau bakteri, mendeteksi
adanya mutasi gen yang menimbulkan penyakit keganasan, penyakit herediter,
menentukan jenis kelamin prenatal serta sebagai alat bantu forensik dalam
bidang kedokteran.

Darah (whole blood) dan sumsum tulang mamalia mengandung baik


sel-sel berinti (sel darah putih) maupun sel-sel tidak berinti (sel darah merah).
Untuk mengisolasi DNA dari darah dan sumsum tulang, sel darah merah yang
tidak mengandung DNA genom harus dilisiskan dahulu agar dapat dipisahkan
dari sel darah putih. Sel-sel darah putih yang sudah dipisahkan kemudian
dilisiskan dengan bantuan bahan pengawet DNA yaitu, deterjen anionik yang
dapat melarutkan komponen seluler. Bahan pengawet DNA juga dapat
mengurangi aktivitas Dnase yang terdapat di dalam sel. Bila perlu dapat
ditambahkan Rnase untuk menyingkirkan kontaminasi RNA.

Selanjutnya dengan presitasi garam, DNA genom dipisahkan dari


protein plasma dan inti. Akhirnya DNA genom diisolasi dengan presipitasi
dengan alkohol dan pelarutan kembali endapan yang terbentuk dari larutan
dapar yang mengandung suatu bahan pengawet DNA. Hasil isolasi DNA
dikatakan baik apabila didapatkan DNA yang murni dan utuh.

3
Jumlah DNA yang didapat dari darah umumnya > dari 35 µg DNA per
mL darah. Dari 150 µL sediaan, hasil DNA yang diharapkan berkisar antara
2,5 sampai 7,5 mg. DNA yang diperoleh sangat tergantung pada jumlah sel
darah putih dalam sampel darah atau sumsum tulang. Jumlah sel darah putih
dalam sampel bervariasi, tapi rata-rata terdapat 7 × 106/ mL darah. Setiap sel
rata-rata mengandung 6 pikogram DNA. Hasil yang didapat mungkin lebih
rendah, bila sampel darah dikumpulkan tanpa EDTA atau penyimpanannya
tidak tepat, atau bila sampel disimpan lebih dari 5 hari sebelum digunakan
dalam prosedur isolasi DNA ini.

Pengukuran serapan DNA dilakukan pada panjang gelombang 260 nm


(A 260). Pada A260 = 1, konsentrasi DNA adalah 50 mg/mL. Konsentrasi DNA
(mg/mL) = A260 × 50 mg/m; Kemurnian DNA ditentukan dengan indeks
kemurnian. DNA dikatakan murni bila memiliki indeks kemurnian > 1,75.
Indeks Kemurnian = A260 / A280.

4
E. Alat dan Bahan
1. Spektrofotometer (Gene Quant)
2. Mikrosentrifuge
3. Mikrotube
4. Mikropipet
5. Binding buffer
Komposisi : Guanidin 6 molar
Urea 10 molar
Tris HCl 10 mmol
Tripton x 20%, pH 4,4
6. Proteinase K
7. Isopropanol
8. Inhibitor removal buffer
Komposisi : Guanidin HCl 5 molar
Tris HCl 20 mmol, pH 6,6
9. Wash buffer
Komposisi : NaCl 20 mmol
Tris HCl 20 molar, pH 7,5
10. Elution buffer
11. Sampel darah

5
F. Cara Kerja
1. Sampel dipipet sebanyak 200 µL dimasukkan ke dalam mikroube dan
ditambahkan 200 µL binding buffer untuk mengikat DNA.
2. Ditambahkan 40 µL protease K (pelisis sel), homogenkan dengan
mixer (mix max plus) selama 5 detik. kemudian diinkubasi pada suhu
70oC selama 10 menit.
3. Supernatan dipindahkan ke dalam mikrotube yang mengandung silica.
4. Ditambahkan 100 µl isopropanol untuk melarutkan DNA, disentrifuge
8000 g selama 1 menit.
5. Ditambahkan 500 µL inhibitor removal buffer untuk menghilangkan
pengotor-pengotor, disentrifuge 13.000 rpm selama 10 detik.
6. Ditambahkan 500 µL wash buffer, disentrifuge 13.000 rpm selama 10
detik. Wash buffer dilakukan 2x untuk meyakinkan proses
pembersihan. Buang supernatan.
7. Ditambahkan 200 µl elution buffer, disentrifuge 8000 g selama 1
menit. Pada saat penambahan elution buffer harus dipanaskan terlebih
dahulu agar DNA lebih mudah larut. Setelah itu pindahkan isolat DNA
ke dalam tube yang baru.
8. Selanjutnya pengukuran konsentrasi dan kemurnian dengan
spektrofotometer atau disimpan pada suhu -4oC untuk penundaan
identifikasi, pada suhu -200C (3 bulan) dan pada suhu -80oC (untuk
penyimpanan lebih lama).
9. Untuk pengukuran konsentrasi dan kemurnian, DNA harus diencerkan
terlebih dahulu. Dengan pengeceran 1/10 menggunakan larutan DD
H2O (Double Destilat H2O/aquabidest).

Pengenceran 1/10 : Isolat DNA 7 µL + DD H2O 63 µL

6
10. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh dengan
spektrofotometer:
a. Kuvet dibilas dengan aquadest.
b. Kemudian dibilas dengan DD H2O.
c. Kuvet diisi DD H2O diset sebagai blanko, pada kuvet terdapat
huruf Q, harus menghadap ke depan. Saat pengujian blanko
absorbance harus = 0, kemudian tekan set ref.
d. Masukkan isolat DNA yang telah diencerkan, tekan enter.
e. Serapan DNA diukur pada panjang gelombang 260 nm.

Mekanisme kerja isolasi DNA

7
G. Hasil Pengamatan

Gambar 1. Hasil isolasi DNA

Gambar 2. Hasil pengukuran DNA menggunakan spektrofotometer

Consentration : 22,85 µg/ml


230 : 0,524 A
280 : 0,399 A
260 : 0,457 A
260/230 : 0,872
260/280 : 1,145

8
H. Pembahasan

Berdasarkan hasil pengamatan didapat konsentrasi dan kemurnian


DNA dari sampel darah menggunakan spektrofotometer (Gene Quant) adalah
sebesar 22,85 µg dan 1,1. Nilai kemurnian yang diperoleh kurang dari standar
yaitu 1,1. Nilai 1,1 menandakan, mungkin masih terdapat adanya protein pada
saat proses pengendapan DNA, sehingga benang-benang kromosom masih
bercampur dengan protein dan sampel darah yang digunakan sudah lama,
sehingga hasil yang didapat kurang dari standar.

I. Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan didapat konsentrasi


dan nilai kemurnian DNA dari sampel darah sebesar 22,85 µg dan 1,1. Dan
dapat disimpulkan nilai kemurnian yang didapat 1,1 kurang dari standar 1,6-
2,0 dan perlu dilakukan pemurnian ulang (urifikasi).

9
DAFTAR PUSTAKA

http://id.wikipedia.org/wiki/isolasi_dna.html

http://www.chem-is-try.org/author/Sinly_Evan_Putra/

http://www.rbcbioscience.com/index.php

http://miss-purplepharmacy.blogspot.com/2010/01/isolasi-dna.html

10
A B

C D

Keterangan:

A. Homogenisasi sampel dengan Mixer (Mix max plus)


B. Inkubator
C. Mikrosentrifuge
D. Spektrofometer (Gene Quant)

11