TEMARIO

Taxonomía y concepto de especie en procariotas

TAXONOMÍA Y CLASIFICACION Taxonomía clásica, numérica, molecular y polifásica
Caracteres fenotípicos: clásicos y quimiotaxonómicos
DE BACTERIAS Caracteres genotípicos: clásicos y modernos (fingerprinting)
Filogenética: clasificación y relación evolutiva
gen del ARNr 16S, árbol filogenético y definición de dominos
Relación entre taxonomía clásica y filogenética.
Diversidad bacteriana. Ejemplos.
Silvana Tarlera
Identificación de una cepa
Cátedra de Microbiología
Facultad de Química y Facultad de Ciencias
2007

TAXONOMÍA
BIBLIOGRAFÍA
¾ Clasificación
• Brock, Biología de los microorganismos, 8a, 9a o 10a estructura los organismos en grupos (taxones) en base a su
ed. (Evolución microbiana y sistemática, Diversidad de similitud
Archaea y Bacteria)
¾ Nomenclatura
asigna nombres a los taxones

¾ Identificación
determina a que taxones pertenece un organismo que se
aisla

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• Taxonomía
– Caracterización exhaustiva ESPECIE BACTERIANA
– Aplicación de teoría y método de clasificación
– Formación de grupos taxonómicos (taxones) • Definición en revisión continua
– Nomenclatura
• Definición metodológica estándar:
• Identificación - % de hibridación ADN bacteria1-ADN bacteria2 > 70%

– Caracterización por número limitado de tests
adecuados al problema
– Comparación con spp conocidas
– Asignación a una sp
– No identificado: estudio taxonómico
- ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN1-ADN2)
Definición genómica de especie
• Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinación
de características fenotípicas, genómicas y filogenéticas)

Absorbancia

ADN simple hebra

Aumento de
ESPECIE ADN doble hebra absorbancia del
ADN a 260nm por
• unidad taxonómica básica desnaturalizacion
220 260 300
• grupo de cepas que tiene un alto grado de similitud Longitud de onda (nm)

en sus propiedades y que difieren en forma

Abs. relativa 260 nm

significativa de otros grupos de cepas ADN simple hebra Tm: punto medio
• Cepa: población de organismos que desciende de un del perfil de
desnaturalización desnaturalización
único organismo o de una sola célula
Tm = 86ºC térmica de ADN-
ADN doble hebra ADN o de ADN-
ARN
80 90 100
temperatura (ºC)

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Cinéticas de desnaturalización térmica de ADN
homoduplex y heteroduplex

Hibridación genómica como herramienta RANGOS TAXONOMICOS EN

CLASIFICACION BACTERIANA
taxonómica
Taxones: Dominio
Phylum
Clase
Orden
Familia
Género
Especie
Sub-especie

importancia en estudios
clínicos y ecológicos

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 Categorías de clasificación a nivel de sub-
especie (tipificación)
Sistema binomial de nomenclatura Variedades o tipos
• serovariedad o serotipo (antígenos distintos)
(Linneo)
• fagovariedad (tipificación por fagos)
Escherichia coli • biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas)
• patovariedad (patogenicidad)
Escherichia coli o E. coli • morfovariedad (diferencias morfológicas)
• genomovariedad (grupos con ADN similares)

Jerarquía taxonómica de la bacteria Allochromatium warmingii

Dominio
Phylum Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology
Clase
Orden
1923 (1ed)-1994 (9ed)
Familia Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 1a Ed
Genero
Especie
1984(vol 1)-1989(vol 4)
Bergey´s manual of Systematic Bacteriology 2a Ed
Bacteria
Proteobacteria
Secuencia del gen 16S rRNA 2001-2005 (vol 1-vol 5)
Gamma Proteobacteria
Zymobacteria Bacterias Gram negativas
Chromatiales Bacterias fotótrofas púrpuras The Prokaryotes (http:/www.prokaryotes.com)
Chromatiaceae Bacterias púrpuras del azufre
Allochromatium
Allochromatium warmingii

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 PUBLICACIONES
International Journal of Systematic and Características fenotípicas clásicas
Evolutionary Microbiology (antes IJSB).
Publicado por la Sociedad General de Microbiología de valor taxonómico
Otros: Applied and Environmental Microbiology,
Systematic Applied Microbiology
Morfología: forma, tamaño y tinción
Nutrición y fisiología: fotótrofo, quimiótrofo,
aerobio o anaerobio, temperatura y pH óptimos,
COLECCIONES (cepas tipo y otras)
fuentes alternativas de C, N y S
ATCC (American Type Culture Collection)
DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Movilidad: tipo y disposición de flagelos
Zelkulturen, Colección alemana)
Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidad
CIP (Colección del Instituto Pasteur, Francia)
a antibióticos, patogenicidad

Características genotípicas clásicas

Taxonomía bacteriana
• Contenido G+C

CLÁSICA % G+C = G+C x 100

G+C+A+T
• caracteres fenotípicos (morfología, nutrición, determinación por gradiente de CsCl, desnaturalización
etc.) térmica o cromatografía

• % G+C Amplio rango en procariotas: 20 al 80%

Poca información para la caracterización taxonómica
• ponderación de caracteres (llaves dicotómicas)

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 Rangos de composición de bases de
ADN NUMÉRICA
- caracteres fenotípicos (no menos de 60)
- coeficiente de semejanza = a+d .
a+b+c +d

a: número de caracteres positivos en ambas cepas

b: número de caracteres positivos sólo en cepa 1
c: número de caracteres positivos sólo en cepa 2
d: número de caracteres negativos en ambas cepas

Taxonomía bacteriana
NUMÉRICA
• Agrupación de unidades taxonómicas o taxones MOLECULAR
por métodos numéricos
Caracteres Genotípicos
• Se basa en un gran número de caracteres
• Hibridación ADN-ADN
• Cada carácter tiene igual peso
• Molecular fingerprinting (huella molecular)
• La similitud es función de la proporción de
caracteres comunes Caracteres Fenotípicos
• Quimiotaxonomía. Biomarcadores: lipídicos
(FAME), otros

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• Hibridación ADN-ADN
- depende de la secuencia completa del genoma
- útil en organismos estrechamente relacionados
- determinación por:
% hibridación de ADN1 - ADN2
Δ Tm del híbrido
- es el criterio actual de definición de especie
• Molecular fingerprinting
- secuencias de ADN de un organismo son
sometidas a la digestión con enzimas de restricción
- resolución a nivel de sub-especie
CARACTERES FENOTIPICOS
Marcadores quimiotaxonómicos
Características
- análisis químico con equipamiento especializado
- no son universales, muy útiles dentro de algunos
grupos
- alto grado de discriminación
- presentes en distintas estructuras celulares
• Pared: peptidoglicanos en Gram +
• Membrana externa Gram negativos: lipopolisacáridos
• Membrana citoplasmática: ácidos grasos (Fatty Acid
Methyl Ester), lípidos polares, ácidos micólicos en un
grupo de bacterias Gram positivas (Actinomicetes),
pigmentos carotenoides en bacterias fotótrofas
anoxigénicas.
• Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas.
• Sistema fotosintético: bacterioclorofilas.
• Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gram
negativas
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Desventajas de una clasificación artificial
• No permite inferir propiedades
• No permite comprender microorganismos
que no se han cultivado en el laboratorio
• No permite estudiar el origen y evolución
de funciones celulares (resistencia a
antibióticos, aerobiosis, fotosíntesis)
Clasificación natural
9 Estructura los organismos en taxones
cuyos miembros reflejan tanto como sea
posible su naturaleza biológica.
9 Es ventajosa si además establece
relaciones evolutivas
POLIFÁSICA
Es la tendencia moderna. Consenso en la
integración de distintos tipos de caracteres:
¾ Fenotípicos: - clásicos (morfología, nutrición, etc)
- moleculares (marcadores quimiotaxonómicos)
- perfil de proteínas totales y enzimas
¾ Genotípicos: -clásicos: % G+C
- moleculares: hibridación DNA-DNA,
fingerprinting (ej. Perfiles
moleculares por restricción o
amplificación de ADN)
¾ Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S
• El uso de secuencias moleculares para
estudios filogenéticos se basa en la
premisa que los cambios en las
secuencias ocurren al azar y de un
modo temporal-dependiente y que
cierta proporción de éstos permanece
fijo en las moléculas.
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 CARACTERES FILOGENETICOS
• Plantean hipótesis de evolución (determina
relaciones de parentesco entre las especies)
• Compara la secuencia de moléculas (cronómetros
evolutivos) y establece la relación entre ellas
• Las secuencias de las moléculas son el registro
histórico de la evolución
Moléculas usadas para la determinación
de relaciones filogenéticas de
organismos
•ARNr: 5S, 16S y 23S (Carl Woese)
•Subunidad beta de ATPasa
•RecA
• Factor de Elongación Tu
•Genes funcionales

PROPIEDADES DE UN BUEN CRONÓMETRO EVOLUTIVO

ARNr en Procariotas

¾ distribución universal (presente en todos los Nombre Tamaño Ubicación

organismos) (nucleótidos)

¾ función homóloga en todos los organismos 5S 120 Subunidad mayor del ribosoma
¾ capacidad de alinear
16S 1500 Subunidad menor
- secuencias con zonas altamente conservada para
distancias evolutivas grandes (alineamiento) y
algunas zonas variables 23S 2900 Subunidad mayor

- ausencia de transferencia horizontal

- cantidad de información suficiente

9

Secuencia del ARNr 16S
• Estructura primaria:
™ Dominios de conservación universal
™ Regiones altamente variables
™ Dominios de nivel intermedio de conservación,
con cambios de secuencia, pero conservación de
estructura secundaria
Un árbol filogenético es una hipótesis de relación
evolutiva de un gen deducida a partir de la secuencia de
ese gen en organismos que existen en el presente
Para construirlo se deben hacer suposiciones que siempre
tienen una cuota importante de error,
la cuestión es si esos errores invalidan o no la hipótesis
filogenética resultante.

• Estructura secundaria:
¿Cómo se construye un árbol filogenético?
™ Similar en todos los organismos
™ Acotada por su función en la síntesis de
proteínas: función ancestral

Estructura
secundaria del
ARNr 16S de E. coli
Líneas gruesas: dominios
de conservación universal
Líneas normales:
dominios de conservación
intermedia
Líneas punteadas:
regiones hipervariables

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 Secuencias sin alinear en
2) Alinear secuencias: determina que posiciones de las
programa Clustal IX
secuencias van a ser comparadas

Organismos secuencias ARN

Secuencia del
A CGU AGA CCU GAC organismo problema
B C CUU CCU AGA GCU GGC CAA
C C CAA GAC GUG GCA secuencias obtenidas
de la base de datos
D C CAU GCU AGA UGU GCC

Posiciones Posicion mas

mas variables conservada

Posiciones que van a ser comparadas

Secuencias alineadas en
programa Clustal IX

Árboles filogenéticos
• Uso de programas para alinear secuencias y
construir árboles filogenéticos

• Longitud de la línea entre organismos es

proporcional a la distancia evolutiva

• Similitud de secuencias implica similitud en

los genes

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Preparación de un árbol de distancias filogenéticas a Definición de especie bacteriana y el
partir del gen 16S ARN
análisis del gen ARNr 16S

Definición especie: % de hibridación ADN1-ADN2 > 70%

En general se cumple:
secuencia del gen del ARNr 16S difiere en mas del 3%
con el resto de las secuencias conocidas de bacterias
entonces el % de hibridación ADN-ADN es menor al 70%

especies diferentes

Relación entre la similitud de secuencias del 16S rARN y la

hibridización genómica de ADN entre pares de organismos.

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ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S PARA LA
IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA

Alineamiento y corrección de la secuencia

Comparación con bases de secuencias

(http://rdp.cme.msu.edu/html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)

Diferencia de secuencia con la cepa mas similar

> 3% < 3%

pruebas fenotípicas
Confirmación con
pruebas fenotípicas y diferentes similares
genotípicas diferentes
Hibridación ADN-ADN

< 70% > 70%

NUEVA ESPECIE
NUEVA CEPA DE LA
MISMA ESPECIE

Secuencias signaturas o firma en ARNr

Oligonucleótidos o bases presentes en

determinadas posiciones en ciertos grupos
de organismos
Ejemplos:
AAACUCAAA (posición 910) en Bacteria
CACACACCG (posición 1400) en Archaea
C (posición 47) en gamma-Protebacteria,
Cianobacteria, Bacteroides, Grampositivos

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 Caracteres fenotípicos con valor filogenético diferenciales entre
Bacteria, Archaea y Eukarya
Bacteria Archaea Eucarya
Secuencia del gen ARNr 16S Peptidoglicano Sí No No
Lípidos Enl. ester Enl. eter Enl. ester
Se emplea frecuentemente para: Operones Sí Sí No
RNA polimerasa Una Varias Tres
¾ COMPLETAR IDENTIFICACIÓN Y (4 subun) (8-12 subun) (12-14 subun)
DESCRIPCIÓN DE CULTIVOS PUROS Ribosomas 70S 70S 80S

Formilme- Metionina Metionina

¾ ANÁLISIS DE COMUNIDADES SIN CULTIVO tRNA iniciador
tionina
Ribosoma sensible a:

¾ DESCRIPCIÓN DE BACTERIAS NO Toxina diftérica No Sensible Sensible

CULTIVADAS: “Candidatus” Cloranfenicol Sensible No No
Kanamicina
Estreptomicina

ARBOL FILOGENETICO UNIVERSAL

Arbol del ARNr 16S
• Termofilia representada en los grupos
mas profundos de Archaea y Bacteria
• Muchos de los linajes profundos son
anerobios o microaerofílicos
• Fotosíntesis basada en clorofilas:
distribuida en varios linajes de Bacteria

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 ARBOL FILOGENETICO UNIVERSAL
Caracteres similares en taxones
filogenéticamente distantes

Chloroflexus y Chlorobium (pertenecen a divisiones muy

alejadas entre sí) Fotótrofos anoxigénicos
ambos poseen clorosomas con similar función y
estructura

posibles explicaciones:
transferencia lateral

Termofilia en todos los miembros de la rama evolución independiente

Termofilia en algunos miembros de la rama el gen del ARNr 16S aportaría información limitada

Caracteres que confirman el árbol universal Arbol del dominio Bacteria

construido a partir del ARNr 16S

• Principales diferencias entre dominios Bacteria,

Archaea y Eukarya
• Procariotas actuales mas cercanos al ancestro
relacionadas con las condiciones fisicoquímicas en el
origen de la vida: Aquifex y Methanopyrus
(termofilia, anaerobiosis)
• Características de los Eukarya mas cercanos a los
procariotas: Giardia y Microsporidia
• Secuencias de otras moléculas, especialmente las
ligadas a la replicacion, transcripción y traducción

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DOMINIO BACTERIA
Actualmente con mas de 50 divisiones
(phylum), algunas sin organismos cultivados
(secuencias ambientales)
Mas de 400 géneros
Phylum mejores caracterizados:
Proteobacteria (α,β,γ,δ,ε) con 270 géneros,
Gram positivos (LowGC y HighGC) con 170
géneros
•Aquifex
Bacterias autótrofas y termófilas
•Bacterias verdes no del azufre (Chloroflexus)
Algunas fotosíntesis anoxigénica, autotrofía por vía del hidroxipropionato
•Deinococci
Altamente resistentes a la radiación (D. radiodurans)
•Bacterias verdes del azufre (Chlorobium)
Fototrofos anoxigénicos, anaerobios estrictos, autotrofía por ciclo reverso del
ácido cítrico
•Planctomycetes
Bacterias prostecadas, carecen de peptidoglicano, reproducción por gemación,
compartimentalización celular (membrana nuclear),” annamox” fisiología única,
“Candidatus”
•Cyanobacteria
Bacterias unicelulares o filamentosas, Fotosíntesis oxigénica
• Gram positivos bajo GC
G+C < 50%
Géneros: Clostridium, Bacillus, Lactobacillus,
Streptococcus, Staphylococcus
• Gram positivos alto GC
G+C > 50-55%
Géneros: Actinomyces, Micrococcus,
Mycobacterium
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PROTEOBACTERIAS Ciclo de
• Alfa: Myxobacterias
metilótrofas y metanótrofas, oligotrofas,
litótrofas (Nitrobacter), fij. N2,
bacterias rojas no del S fotosínteticas
• Beta:
litótrofas de NH3 (Nitrosomonas)
• Delta:
Myxobacterias, Bdellovibrio, algunas
sulfato reductoras

Ejemplos de diversidad: estructura y función

• Pared: bacterias sin pared (Mycoplasmas, Thermoplasmas)

• Membranas: diferente composición (Mycobacterium)
Etapas en el ciclo • Forma: Espiroquetas, bacterias con prostecas (Caulobacter),
celular de formación de hifas (Streptomyces)
Hyphomicrobium • Mecanismos de movimiento: bacterias deslizantes (Beggiatoa)
• Diferenciación celular: microcistos de Cyanobacterias,
comportamiento social (Myxobacterias)
• Comportamiento frente a otras bacterias: predación (Bdellovibrio)
• Obtención de energía independiente del trasporte de electrones
(fosforilación oxidativa o fotosíntesis) y la fermentación, ej.:
decarboxilasas en Oxalobacter formigenes

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 Taxones definidos previamente
DOMINIO ARCHAEA
coherentes filogenéticamente:
40 géneros Actinomycetes (High GC), Spirochetes,
Cyanobacteria, Myxobacteria (δ Proteobacteria)
3 linajes separados:
• Euryarchaeota (halófilos y metanogénicos)
• Crenarchaeota (termófilos) Caracteres filogenéticamente no
• Korarchaeota (solo secuencias valiosos para definir taxones
ambientales) superiores:
Termofilia, fototrofía, tipo de movilidad,
morfología compleja (helicoidal, gemación
micelio, apéndices)

¿Por qué hay tanta diversidad entre los

procariotas (Archaea y Bacteria)?

¾ son ancestrales

¾ son ubicuos: ambientes extremos,

parásitos o simbiontes de Eukarya
¾ representan la mayor diversidad de seres
vivos, mucha de la cual esta aún inexplorada

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 ¿Cómo surge una nueva especie bacteriana?
ORIGEN DE LA VIDA
• Origen de la tierra 4600 millones de años
• Condiciones de la Tierra primitiva: CH4, CO2, N2 NH3
y muy poco O2 (ambiente reductor). Trazas de FeS y
H2S
• Temperatura > 100°C
• Evidencia de vida microbiana en la Tierra primitiva
(microfósiles: estromatolitos)
• Vida primitiva: ¿organismos con ARN? (sin ADN)
• Célula moderna: ADN ARN Proteína

• Concepto polifásico de especie:

Se define como un grupo de organismos individuales monofilético y

genómicamente coherente que muestran un alto grado de similitud
general en muchos caracteres independientes

• Concepto ecotipo (Cohan, 2004):

Se define como un subgrupo de un grupo bacteriano
genómicamente coherente que difiere genéticamente de otros
subgrupos por adaptación a condiciones locales ecológicas.

Futuro cercano: incluir árboles filogenéticos derivados

de las bases de datos proteómicas de modo de incluir
los eventos de HGT en la identificación de las especies.

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