Prosidings

Seminar Bloteknologi Kelautan Indonesia I '98 Jakarta 14 -15 Oktober 1998: 151 -158

ISOLASI SUBSTANSI BIOAKTIF ANTIMIKROBA DARI SPONS ASAL PULAU PARI KEPULAUAN SERmu.

Tutik Murniasih dan Rachmaniar R. Satari

Laboratorium Produk, Alam Laut, Puslitbang Oseanologi-LIPI

ABSTRAK

Untuk mengetahui golongan kimia substansi yang berkhasiat antimikroba dalam spons (S36P2) asal Pulau Pari, dilakukan pemisahan secara kromatografi kolom dan kromatografi cair kinerja tinggi. Krornatografl kolom dengan pelarut bergradien menghasilkan 7 fraksi, 3 fraksi diantaranya dinyatakan aktif terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis dan Vibrio eltor . Pemisahan dengan kromatografi cair kinerja tinggi dad fraksi-fraksi aktif adalah Untuk Fraksi III dihasilkan 2 puncak dengan waktu tambat 6,68 rnnt dan 8,34 mnt. Fraksi V terdapat 3 puncak dengan waktu tarnbat 8,55 ; 9.54 : 9,93 mnt. sedangkan fraksi VII terdapat 3 puncak dengan waktu tambat 2,49 ; 7,50 dan 11,88. Puncak dengan waktu tambat di bawah 3 mot diperkirakan golongan senyawa aril propionat, untuk waktu tambat sekitar 6-9 mnt diduga senyawa-senyawa aldehid dan puncak dengan waktu tambat di alas 11 mnt diperkirakan golongan senyawa steroid.

ABSTRACT

ISOLATION OF ANTIMICROBIAL BIOACTIVE SUBSTANCES OF A SPONGE FROM PARI ISLAND. To investigate compound group of antimicrobial substance in Sponges from Pari Island, separation with column chromatography and high performance liquid chromatography have been done. Column chromatography with gradient mobil phase produced 7 fractions, 3 fractions of them were active to Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Vibrio eltor. Separation with HPLC from active fractions were as follows : fraction 11I has 2 peaks with retention time 6.68 min. and 8.34 min.: fraction V has 3 peaks at 8.55 , 9.54 , and 9.93 min. respectively, fraction VII has 3 peaks with retention time 2.49 . 7.50 and ll.88 milt. respectively. Peak with retention time below 3 min was estimated as aryl propionic compound group, retention time around 6-9 min was estimated as aldehide compounds group and peak with retention time above II min was approximated steroide compound.

PENDAHULUAN

Salah satu program dalam bioteknotogi kelautan adatah pemanfaatan prod uk alam taut yang dapat menunjang kebutuhan manusia. Di bidang kesehatan misalnya, tingginya penderita infeksi di Indonesia membutuhkan persediaan obat antiinfeksi yang memadai. Mikroba-mikroba tertentu merupakan penyebab timbulnya penyakit infeksi. Berbagai penelitian dilakukan untuk mendapatkan bahan-bahan antimikroba.

151

MURNIASIH DAN RACHMANIAR R. SATARt

Diinformasikan bahwa bahan-bahan aktif sebagian besar terdistribusi dalam organisme laut. Metazoa lautan yang mempunyai potensi terhadap bahan-bahan aktif antimikroba di antaranya spons, karang lunak, alga merah dan lain-lain. Bahkan barubaru ini spons banyak menjadi perhatian para peneliti produk alam karena terbukti mengandung senyawa-senyawa aktif. Senyawa-senyawa antimikroba yang terdapat pada spons di antaranya . aeroplisinin -1 yang terdapat pada jenis Pseudocerasina dan Verongia aeropobha. (Martin, 1992). MinaI (1994), berhasil mengisolasi senyawa antimikroba acanthellin-l dari jenis Acanthella acuta. Kennis (1974). menemukan senyawa chromodorolide yang diisolasi dari jenis Chromodoris.

Spons merupakan binatang berongga rap at tergolong filum Porifera yang ditemukan pada karang-karang vertikal di daerah yang dangkal. Indonesia kaya akan bermacam-macam jenis spons. Biota ini menghasilkan bahan aktif sebagai hasil metabolit sekunder. Bahan-bahan ini dihasilkan untuk mempertahankan diri dari serangan predator, mengingat struktur tubuhnya yang lunak dan menetap (sedentary).

Untuk menggali potensi dan memberikan nilai tambah pada biota spons, maka kelompok penelitian Produk Alam Puslitbang Oseanologi LlPI mencoba melakukan penelitian isolasi senyawa aktif dari spons. Penelitian ini merupakan tindak lanjut dari penelitian Screening Substansi antimikroba spons (Satari, 1995). Isolasi senyawa antimikroba dilakukan dengan maksud tersedianya informasi struktur kimia dari senyawa antimikroba, hal ini diperlukan untuk kemungkinan sintesanya. Namun dalam penelitian ini baru diinformasikan .kemungkinan golongan senyawa yang ditunjukkan dari hasil data Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dan akan dilanjutkan pada penyelidikan struktur yang lebih akurat.

BAHAN DAN METODE

Penelitian isolasi senyawa aktif antimikroba ini dilakukan di Laboratorium Produk Alam Laut Puslitbang Oseanologi LlPI, adapun sampel spons diambil dari Pulau Pari, Kepulauan Seribu.

Bahan

Sampel spons dari Pulau Pari dengan kode S36P2 sebanyak 2 kg dalam keadaan segar, mempunyai bentuk masif, dengan permukaan berpori, rapuh, agak halus, lunak, berwarna kuning dan seratnya berkerangka retikulasi periferal. Ekstrak metanol dari sampel spons S36P2 berwarna kuning berbentuk pasta seberat 8 gram. Pelarut-pelarut organik yang digunakan di antaranya metanol p.a. untuk ekstraks~. kloroform dan air untuk partisi. Kromatografi kolom dengan fase gerak heksan, etil asetat, aseton dan metanol, fase diamnya Silika Gel-60 dengan ukuran partikel 230-400 mesh.Uji bioaktivitas dengan agar MHA dan nutrient agar, larutan Macfarland dan NaCl.Bioindikator yang digunakan adalah Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 1633 dan Vibrio eltor FKUI dengan senyawa pembanding amphicilin.

152

SUBSTANSt BroAKTtF DARt SPONS

Metode Penelitian

Penelitian ini meliputi tahap-tahap ekstraksi, uji bioaktifitas dan pemisahan.

Ekstraksi dengan metode maserasi yaitu dengan merendam I kg sampel spons segar yang dihaluskan kedalam satu liter metanol selama 2 x 24 jam. pada suhu 18°C. kemudian disentrifuse selama 15 mnt 3600 rpm. disaring dan filtratnya dievaporasi hingga 1110 dari volume awal.Kemudian e~s'trak metanol ini diuji bioaktivitasnya.

Uji bioaktivitas terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis dan Vibrio eltor dilakukan pada ekstrak kasar metanol, fraksi-fraksi hasil pemisahan dan senyawa pembanding amphicilin. Metode pengujian menggunakan cara .difusi a~ar. Ketiga bioindikator masing-masing diinokulasi ke media agar pada petn, kemudian ditetesi dengan larutan sampeJ pada kertas cakram yang diletakkan ditengah-tengahnya, diinkubasi selama 24 jam. Sesudah itu diamati diameter hambatnya.

Pernisahan dilakukan terhadap ekstrak metanol spons S36P2 yang terbukti aktif antimikroba. Sebelum dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom ekstrak metanol kering terlebih dahulu dipartisi dengan kloroform dan air 3 x (3 : I):

Dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom pada fase kloroform, kromatografi kolom dengan fase diam silika Gel G-60 dan fase gerak bergradien heksan - etil asetat - aseton - metanoL Pemisahan komponen fraksi-fraksi aktifnya dilakukan dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) dengan Lc.Pump series 200 Perkin Elmer dan deteksi menggunakan UVNis 785A Perkin Elmer, kondisi elusi sbb :

Kolom Partisil 10 ODS-3 4,6 mm ID x 25 em long.

Fase gerak Flow rate Detektor

metanol 100% 0,5ml/mnt

UV (250nm)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Uji Bioaktivitas

Adanya efek menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis dan Vibrio eltor ditunjukkan oleh adanya zona bening pada media agar. Zona ini melingkar di sekitar kertas cakram dan diukur diametemya. Berikut adala.h tabel diameter hambat dari uji bioaktivitas terhadap ekstrak metanol sampel dan fraksifraksi hasil kromatografi kolom.

Uji bioaktivitas ekstrak metanol spons S36P2 te~hada~ bakteri .S~a?hyl~coccus aureus mempunyai diameter hambat yang lebih besar dibanding amphicilin yaitu 21,6 mm terhadap ekstrak metanol spons dan 17,77 mm terhadap amphicilin.

Dari Tabel 1 dapat ditunjukkan bahwa fraksi III. V dan VII aktif terhadap penghambatan bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis dan Vibrio eltor.

153

MURNlASlH DAN RACHMANlAR

Tabel 1. HasiI Uji Bioaktivitas ekstrak metanol dan fraksi hasil pemisahan

No. Sampel Diameter Hambat (mm)
Staphylococcus Bacillus sub/ills Keterangan
1 Ekstrak metanol 21,6 "2i~65Ut 20,4 C= 10:1
(S36P2) v = 10 ult
2 Fraksi hasil KK
a. Fraksi I - - -
b. Fraksi II - - -
c. Fraksi III 9,7 10,25 11,7 v= l Oult
d. Fraksi IV - - -
e. Fraksi V 9,95 12,55 11,7 v = 10 ult
f. Fraksi VI - - -
g. Fraksi VII 11,45 10,65 10,2 v = 10 ult
3 Amphicilin 17,77 38,3 21.30 C = 10 ug Hasil Pemisahan

Pemisahan ekstrak kasar metanol yang sebelumnya dipartisi ke fase kloroform dilakukan dengan kromatografi kolorn eluen bergradien dan dihasilkan seperti pada Tabel 2.

Tabel 2. Hasil fraksinasi kromatografi kolom.

No. Fraksi Volume (ml) Jumlah Noda KLT Wama fraksi
1 1 30 2 kuning
2 II 40 2 orange
3 III 50 2 coklat
4 IV 55 2 kuning
5 V 30 3 hijau muda
6 VI 50 2 coklat
7 VII -: 60 3 kuning Pemisahan fase kloroform hasil partisi dengan kromatografi kolom menghasilkan 7 fraksi, fraksi yang paling banyak adalah fraksi VII yaitu fraksi paling polar dengan perbandingan pelarut aseton : metanol 1:2 hingga 1: 10.

154

SUBSTANSI BIOAKTlF DARl SPONS

Hasil kromatografi cair kinerja tinggi dari fraksi fraksi aktifnya menunjukkan hasil sbb :

'" ~ '" ec ~ :;;: or,
-.:t. :7:: ~ ~ of 0 r-l
7""i" ... ...
100
<
;';;'
90
W
;;-
.s 70
"
"
" 60
0
...
i;l 50
0::
40
30

20
10 o I 2 3 4 S 6 7 8 9 ]0 11 12 13 14 15

Time (minI

Gambar 1. Hasil analisis HPLC fraksi III

120

110

;:;100 E

~ 90 a

Ji 80

70

60

a

4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14

Time (mini

Gambar 2. Hasil analisis HPLC fraksi V

155

MURNIASIH DAN RACHMANIAR

~
"t
-13.0
-12.0
-11.0 :
-10.0
s -9.0-(
E -8.0
QI -7.0 .
c:
0 -6.0
0-
..
QI -5.0
a:
-4.0
-3.0-
-2.0
-1.0
-0.0 -

'I

A \ J \...._

..__--~

"'j' , "1"'1"'1

o 1 2 3 4 5 6 7 K ~ 10 11 12 13 14

Time {min]

Gambar 3. Hasil analisis HPLC fraksi VII

Dari Iiteratur diinformasikan bahwa pada pemisahan golongan aldehide dengan kromatografi cair kinerja tinggi, senyawa dengan waktu tambat sekitar 6-9 mnt di antaranya adalah akrolein, propionaldehid,varelaldehid,butiraldehid dan benzaldehid. Pemisahan aldehid ini dilakukan dengan kondisi kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan kolom ODS (4,5 x 250 mm) fase gerak metanol .air 80:20, deteksi menggunakan UV 254 nm (Gritter, 1991). Jadi senyawa pada waktu tambat 6,68; 7,5; 8,55; 9,55 dan 9,93 mnt. diduga merupakan senyawa-senyawa aldehid,

Senyawa dengan waktu tambat lebih kecil dari 3 mnt di antaranya senyawa ketoprofen sebuah senyawa yang tergolong asam aril propionat, dianalisa dengan kromatografi cair kinerja tinggi dengan kolom ODS 3 menggunakan detektor UV 250 nm (Davis, 1997). Disimpulkan bahwa senyawa dengan waktu tambat 2,49 mnt. diperkirakan suatu senyawa goIongan aril propionat.

Pada pemisahan senyawa kortokosteroid dengan kromatografi cair kinerja tinggi diinformasikan bahwa senyawa dengan waktu tambat antara 10-12 mnt adalah senyawa prednisone, cortisone dan prednisolon. Pemisahan dilakukan dengan kondisi menggunakan kolom CIS, flow rate 0,5 mllmnt eluen air : acetonitril (76:24) dan deteksi menggunakan UV. (Shibashi. 1997).

156

SUBSTANSI BIOAKT{f DARI SPONS

Domocel (1984), melaporkan bahwa pemisahan senyawa kortikosteroid dengan HPLC menunjukkan waktu retensi sekitar 11 untuk corticosterol dan deksametason sekitar 8 mnt. Kondisi analisanya adalah menggunakan kolom Spherisorb ODS (25 em x 4,6mm) dengan fase mobil 52-50 % metanol : air. deteksi rnenggunakan UV 254 nm.

Pada anaIisis golongan steroid dengan kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan kolom ODS dan pelarut chloroform : methanol : air, dengan deteksi menggunakan UV 254 didapatkan senyawa estron suatu senyawa steroid, pada waktu tambat 9,48 mnt. (Attaur, 1991).

Berdasarkan literatur maka disimpulkan bahwa senyawa dengan waktu tambat 11,88 mnt. diduga suatu steroid, Uji Lieberman-burchad pada fraksi VII menunjukkan warna hijau yang menandakan adanya senyawa steroid.

Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa, pemisahan ekstrak metanol sampel spans S36P2 dengan kromatografi kolom menghasilkan 7 fraksi, 3fraksi diantaranya aktif terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus sub til is dan Vibrio eltor.

Pemisahan dengan kromatografi cair kinerja tinggi fraksi III menunjukkan waktu tambat 6,68 dan 8,34 mnt, fraksi V menunjukkan waktu tambat 8,55 ; 9,54 dan 9,93, sedang fraksi 7 menunjukkan waktu tambat 2,49, 7,50 dan 11,88 mnt. Dari pendekatan literatur, disimpulkan bahwa senyawa dengan waktu tambat 2,49 diduga suatu senyawa dari golongan aril propionat Senyawa dengan waktu tambat an tara 6- 9 diduga suatu golongan senyawa-senyawa aldehid, sedangkan senyawa dengan waktu tambat diantara 10-11 mnt diduga dari golongan steroid.

DAFfAR PUSTAKA

Amir, L 1997, Fauna sepon (Porifera) dari terumbu karang Genteng Besar Pulau-pulau Seribu Oseanologi di Indonesia No, 24: 41-54.

Attaur.R, 1991. Studies in natural products chemistry Elsevier, New York.

Choudhary, M. 1991. X Ray crystallographic studies on novel natural products from marine animals Elsevier science Publishers B. V, Amsterdam.

Davis, M.N. 1997, Methodes of analysis of chiral nonsteroidal antiinflamatory drugs, Journal of Chromo B 691: 229-261.

Domocel et al. 1984. Use of high performance liquid chromatography in the determination of synthetic

and natural corticosteroids. Report advances in Steroid analysis.

Gritter, 1 R et al. 1991. Pengantar Kromatografi. Diterjemahkan oleh Kosasih Ed II Penerbit ITB:

Kennish, M.1.1992. Practical hand book of marine science" C.Re. Press Boston Martin, J. et al. 1992 Toxicon 9: 30. Great Britain.

Minale et at. 1974. Acanthellin-1, an unique isonitrile sesquiterpene from the Sponge Acanthella acuta Tetrahedron Lett.: 4227.

157

MURNIASIH DAN RACHMANIAR

Satari, R 1995. Screening substansi bioaktif spons dan karang lunak. Penelitian produk alam laut P30 LIPI.

Shibasaki, H. 1997. QUantification of corticosteroids in human plasma by liquid chromatography thermospray mass spectrometry using stable isotop dilution Journal of chromo 8 692: 7-14.

158