Anda di halaman 1dari 18

Tugas Teknik Analisa DNA

Created by:
Stevanus Sugiono/ 7081009
Debby Agam/ 7081012
Aurelia L. Erna S./ 7081027
Ruth S. H./ 7081813
Budianto Gunawan/ 7081826
Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) atau dalam bahasa
indonesianya disebut sebagai uji penentuan kadar imunosorben taut-enzim,
merupakan teknik pengujian serologi yang didasarkan pada prinsip interaksi
antara antibodi dan antigen. Pada awalnya, teknik ELISA hanya digunakan dalam
bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi dalam
suatu sampel seperti dalam pendeteksian antibodi IgM, IgG, & IgA pada saat
terjadi infeksi (pada tubuh manusia khususnya). Namun seiring dengan
perkembangan ilmu pengetahuan, teknik ELISA juga diaplikasikan dalam bidang
patologi tumbuhan, kedokteran, dll.

I. Sejarah Penemuan dan Prinsip Dasar Teknik ELISA


Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter
Perlmann dan Eva Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang
imunologi (ELISA konvensional) untuk menganalisis interaksi antara antigen dan
antibodi di dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan
menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelapor/ reporter/ signal.
Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simpel dapat dijabarkan sebagai
berikut:
Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan
pada suatu permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut
dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu secara penempelan secara non
spesifik dengan adsorbsi ke permukaan microtiter, dan penempelan
secara spesifik dengan menggunakan antibodi atau antigen lain yang
bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji (cara ini
digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau
antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal
(disesuaikan dengan sampel=> bila sampel berupa antigen, maka
digunakan antibodi spesifik; sedangkan bila sampel berupa antibodi,
maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan
tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan
antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut
dicampurkan suatu substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal.
Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang
bertaut dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi dengan
antibodi atau antigen sampel akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pada ELISA
flourescense misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau
antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan
signal yang berupa pendaran flourescense.
Dalam perkembangan selanjutnya, selain digunakan sebagai uji kualitatif
untuk mengetahui keberadaan suatu antibodi atau antigen dengan menggunakan
antibodi atau antigen spesifik, teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji
kuantitatif untuk mengukur kadar antibodi atau antigen yang diuji dengan
menggunakan alat bantu berupa spektrofotometer atau dengan cara menentukan
jumlah penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga dapat dibuat suatu
kurva standar dan kadar antigen atau antibodi yang tidak diketahui dapat
ditentukan.

II. Kelebihan & Kekurangan Teknik ELISA


Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain:
• Teknik pengerjaan relatif sederhana.
• Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang digunakan hanya satu saja,
sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
• Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
• Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar
antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara
antibodi dan antigen yang bersifat sangat spesifik)
• Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.
Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain:
• Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini
hanya jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu
antigen)
• Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi
poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya
yang relatif cukup mahal.
• Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian
akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang
disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder
atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim
signal dan menimbulkan signal.
• Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat,
sehingga pembacaan harus dilakukan dengan cepat (pada
perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan
untuk menghentikan reaksi).

III. Alat & Bahan Yang Digunakan


Alat paling utama yang digunakan dalam teknik ELISA adalah microtiter.
Microtiter ini berupa suatu papan plastik dengan cekungan sebanyak 96 buah (8
cekungan ke arah bawah dan 12 cekungan ke samping). Microtiter ini terbuat dari
bahan polistirena. Cekungan dari microtiter memiliki tinggi sekitar 1 cm dan
diameter 0,7 cm. Berikut ini adalah gambarnya:

Selain itu, alat dan bahan lain


yang umum digunakan
dalam teknik ELISA antara
lain:
• Antigen yang
dimurnikan
(jika sampel yang hendak dideteksi atau dikuantifikasi berupa antibodi).
• Antibodi yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau
dikuantifikasi berupa antigen).
• Larutan standard (kontrol positif dan negatif).
• Sampel yang ingin dites.
• Cairan pencuci (buffer).
• Antibodi atau antigen yang tertaut dengan enzim signal
• Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal
• ELISA reader (spektrofotometer) untuk pengukuran kuantitatif.

IV. Macam-Macam Teknik ELISA


Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik
ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat
antibodi-enzim, dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi
(primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua
(sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal.
Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA
sandwich.
Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagai macam jenis
teknik. Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan
teknik ELISA tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini
adalah beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain:
ELISA Direct
Teknik ELISA ini merupakan
teknik ELISA yang paling sederhana.
Teknik ini seringkali digunakan untuk
mendeteksi dan mengukur konsentrasi
antigen pada sampel. ELISA direct
menggunakan suatu antibodi spesifik
(monoklonal) untuk mendeteksi
keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.
Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang
mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel
pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk
membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Lalu
antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang-
lubang microtiter sehingga antibodi dapat berinteraksi dengan antigen yang
diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang
antibodi tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke
dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi
dengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan
kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.
ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain:
• Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut
dengan enzim.
• Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan
mahal.
• Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari
antibodi pada percobaan yang berbeda.
• Amplifikasi signal hanya sedikit.
• Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan
sebelum digunakan untuk uji ELISA direct.
Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain:
• Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibodi
• Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang
dengan antibodi lain (antibodi sekunder) dapat diminimalisasi.

ELISA Indirect
Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA
yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi
dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan
suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertaut enzim
signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang
diuji.
Pada ELISA indirect, pertama
microtiter diisi dengan larutan yang
mengandung antigen spesifik, sehingga
antigen spesifik tersebut dapat
menempel pada bagian dinding lubang
microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak
menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang
mengandung antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang
microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang
diinginkan. Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antibodi
yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu, ke dalam lubang microtiter
dimasukkan larutan yang berisi antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal,
sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antibodi yang
diinginkan dengan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal. Selanjutnya
microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi sekunder tertaut enzim signal
yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Kemudian pada tahap akhir
ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal,
lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik yang telah berinteraksi
dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan
signal yang dapat dideteksi.
ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain:
• Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA
direct karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi
yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi
yang diinginkan dan antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi
sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya
membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi
antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik tertaut enzim
signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain:
• Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang terjual secara
komersial di pasar.
• Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak
terpengaruh oleh penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena
penautan dilakukan pada wadah berbeda.
• Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan
memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi
sekunder.

ELISA Sandwich
Teknik ELISA jenis ini menggunakan
antibodi primer spesifik untuk menangkap
antigen yang diinginkan dan antibodi
sekunder tertaut enzim signal untuk
mendeteksi keberadaan antigen yang
diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari
ELISA sandwich mirip dengan ELISA
direct, hanya saja pada ELISA sandwich,
larutan antigen yang diinginkan tidak perlu
dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat
berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut
enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada
antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau
antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA
sandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap,
sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi.
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan
untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah
pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA
sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan
akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi.
Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang
mengandung antibodi penangkap, sehingga antibodi penangkap tersebut dapat
menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas
untuk membuang antibodi penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang
microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan
dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara
antibodi penangkap dengan antigen yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter
kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak berinteraksi dengan antibodi
penangkap. Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi
antibodi detektor, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara
antigen yang diinginkan dengan antibodi detektor. Selanjutnya microtiter dibilas
lagi untuk membuang antibodi detektor yang tidak berinteraksi dengan antibodi
spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang
dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut pada antibodi
detektor yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi
dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi
tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain:
• Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada
dinding lubang microtiter
• Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen
Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari
teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich
ini pada dasarnya berada pada tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi
karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan 2 jenis antibodi,
yaitu antibodi penangkap dan antibodi detektor. Namun demikian, teknik ELISA
sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan
untuk mendeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua
jenis antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang
berbeda (epitopnya harus berbeda).

ELISA Biotin Streptavidin (Jenis ELISA modern)


Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga
dikembangkan untuk mendeteksi antibodi dengan tingkat sensitivitas relatif lebih
tinggi. Teknik ini dikenal sebagai teknik ELISA penangkap antibodi, dimana
prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich, hanya saja yang digunakan pada
teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detektor (antigen bertaut enzim
signal, bersifat optional apabila antibodi yang diinginkan tidak tertaut dengan
enzim signal).
Contoh dari aplikasi teknik ini
adalah teknik ELISA untuk mendeteksi
vitamin biotin yang tertaut dengan suatu
antibodi avidin dengan mengubah
antibodi avidin menjadi antibodi
streptavidin, dimana satu molekul
streptavidin dapat mengikat empat
molekul biotin (pengembangan dari
ELISA indirect), sehingga signal yang teramplifikasi menjadi semakin kuat akibat
interaksi antara biotin dengan enzim yang menjadi semakin banyak.

ELISA Kompetitif
Teknik ELISA jenis ini juga
merupakan pengembangan dari teknik
ELISA terdahulu. Prinsip dasar dari
teknik ini adalah dengan menambahkan
suatu kompetitor ke dalam lubang
microtiter. Teknik ELISA kompetitif ini
dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
keberadaan antigen maupun antibodi.
Pada pendeteksian antigen, pertama microtiter diisi antibodi spesifik yang
dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan maupun antigen spesifik tertaut
enzim signal, sehingga antibodi spesifik tersebut dapat menempel pada bagian
dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang
antibodi spesifik yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Lalu
larutan yang mengandung antigen spesifik yang telah ditautkan dengan enzim
signal dan larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan
ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga terjadi kompetisi antara antigen
spesifik tertaut enzim signal dengan antigen yang diinginkan untuk dapat
berinteraksi dengan antibodi spesifik, yang dilanjutkan dengan membilas
microtiter untuk membuang antigen spesifik tertaut enzim signal atau antigen
yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Lalu, kedalam lubang-lubang
microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal
yang tertaut pada antigen spesifik, sehingga enzim yang tertaut dengan antigen
yang telah berinteraksi dengan antibodi spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada proses pendeteksian ini,
pendeteksian positif ditandai oleh tidak adanya signal yang ditimbulkan, yang
berarti bahwa antigen yang diinginkan telah menang berkompetisi dengan antigen
spesifik tertaut enzim signal dan berinteraksi dengan antibodi spesifik.
Sedangkan, pada pendeteksian antibodi, pertama microtiter diisi antigen
spesifik yang dapat berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan maupun
antibodi spesifik tertaut enzim signal, sehingga antigen spesifik tersebut dapat
menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter
dibilas untuk membuang antigen spesifik yang tidak menempel pada dinding
lubang microtiter. Lalu larutan yang mengandung antibodi spesifik yang telah
ditautkan dengan enzim signal dan larutan sampel yang mengandung antibodi
yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi
kompetisi antara antibodi spesifik tertaut enzim signal dengan antibodi yang
diinginkan untuk dapat berinteraksi dengan antigen spesifik, yang dilanjutkan
dengan membilas microtiter untuk membuang antibodi spesifik tertaut enzim
signal atau antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu,
kedalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat
bereaksi dengan enzim signal yang tertaut pada antibodi spesifik, sehingga enzim
yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen spesifik akan
bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pada
proses pendeteksian ini, pendeteksian positif juga ditandai oleh tidak adanya
signal yang ditimbulkan, yang berarti bahwa antibodi yang diinginkan telah
menang berkompetisi dengan antibodi spesifik tertaut enzim signal dan
berinteraksi dengan antigen spesifik.
Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya
purifikasi terhadap larutan sampel yang mengandung antibodi atau antigen yang
diinginkan, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi
akibat sifat spesifisitas dari antibodi dan antigen.

ELISA Multiplex
teknik ELISA merupakan
pengembangan teknik ELISA yang
ditujukan untuk pengujian secara simultan,
sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan
teknik ELISA terdahulu.

V. Contoh Langkah Kerja Teknik ELISA


Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA,
yaitu:
Pendeteksian antibodi dengan ELISA indirect:
1. Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan
membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan
selama 30-60 menit.
2. Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer
3. Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh
antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti
larutan susu bubuk),
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan
membiarkan antibodi spesifik untuk berikatan dengan antigen.
6. Membilas antibodi yang tidak terikat.
7. Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody
yang spesifik (sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan
dengan IgG manusia). Daerah Fc pada anti-Ig akan berikatan secara
kovalen dengan enzim.
8. Membilas kompleks antibodi-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang
terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna dan
11. ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteksi,
maka makin besar kadar antibodi spesifik dalam sampel.
Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:
1. Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikan dengan
membiarkan larutan berisi antibodi menempel pada dinding/ permukaan
selama 30-60 menit.
2. Membilas antibodi (yang tidak terikat) dengan buffer
3. Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh
antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti
larutan susu bubuk),
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan
antibody untuk berikatan dengan antigen spesifik dari simpel.
6. Membilas antigen yang tidak terikat.
7. Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat
spesifik untuk epitop yang berbeda pada antigen sampel, sehingga
terbentuk sandwich.
8. Membilas antibodi-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang
terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna.
11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang
terdeteksi, maka makin besar kadar antigen spesifik dalam sampel.
VI. Aplikasi Teknik ELISA
Berikut ini adalah beberapa contoh aplikasi teknik ELISA, antara lain:
a. Pemeriksaan donor darah untuk pembuktian adanya kontaminasi virus:
- HIV-1 and HIV-2 (keberadaan antibody anti-HIV)
- Hepatitis C (presence of antibodies)
- Hepatitis B (test untuk keberadaan antibody dan antigen virus)
- HTLV-1 and -2 (keberadaan antibody)
b. Pengukuran level hormon
- hCG (sebagai tes kehamilan)
- LH (menentukan waktu ovulasi)
- TSH, T3 and T4 (untuk fungsi thyroid)
c. Pendeteksian infeksi
- Agen penularan secara seksual, HIV, syphilis, and chlamydia
- Hepatitis B and C
- Toxoplasma gondii
d. Pendeteksian bahan allergen pada makanan dan debu rumah.
e. Pendeteksian keberadaan zat obat-obatan terlarang, seperti
- cocaine
- opium
- Δ-9-tetrahydrocannabinol, campuran aktif pada marijuana

VII. Contoh Aplikasi ELISA: Tes Kehamilan Menggunakan Hormon hCG


Pada hari ke sepuluh setelah sel telur dibuahi oleh sel sperma pada saluran
Tuba fallopii, sel telur akan bergerak menuju rahim dan melekat pada dinding
rahim tersebut. Sejak saat itulah plasenta akan mengalami perkembangan dan
hCG mulai diproduksi. Human Chorionic Gonadotropin (hCG) pada dasarnya
merupakan hormon glikoprotein yang diproduksi oleh sel normal trofoblast pada
plasenta selama kehamilan yang dapat ditemukan dalam darah serta air seni.
hCG terdiri dari 2 subunit polipeptida yang terikat secara nonkovalen
dengan berat molekul total 39 kD. Subunit rantai α identik dengan subunit rantai β
dari hLH (human Luteinizing Hormone), hFSH (human Follicle Stimulating
Hormone) and hTSH (human Thyreoidea Stimulating Hormone). Subunit β
bertanggung jawab pada efek hormonal molekul hCG. Pengukuran hCG yang
sempurna dan keberadaan subunit α memberi hasil yang sama pada darah dan
urin, tapi tidak pada subunit β. Produksi hormon hCG akan bertambah banyak
selama trimester pertama, dimana level hCG yang sempurna mempunyai rentang
dari 20000 mIU/ml sampai 50000 mIU/ml (1 ng = 15 mIU).
Keberadaan hCG sudah dapat dideteksi dalam darah sejak hari pertama
keterlambatan haid, yaitu kira-kira pada hari keenam sejak pelekatan janin pada
dinding rahim. Kadar hormon tersebut akan terus menerus bertambah hingga
minggu ke 14-16 kehamilan, terhitung sejak hari terakhir menstruasi. Sebagian
besar ibu hamil akan mengalami penambahan kadar hormon hCG sebanyak dua
kali lipat setiap 3 hari. Peningkatan kadar hormon ini biasanya ditandai dengan
mual dan pusing yang sering dirasakan para ibu hamil. Selanjutnya kadar hCG
akan menurun terus secara perlahan, dan hampir mencapai kadar normal beberapa
saat setelah persalinan. Pengetesan dapat dilakukan pada saat wanita mengalami
keterlambatan siklus haid atau kira-kira 7 hari setelah berhubungan. Sampel yang
digunakan pada umumnya adalah urin. Biasanya dianjurkan menggunakan air seni
yang keluar pertama kali setelah bangun pagi, karena pada saat tersebut
konsentrasi hormon hCG relatif tinggi. Sebenarnya uji darah pada tes kehamilan
yang dilakukan di laboratorium juga memiliki prinsip kerja yang relatif sama,
yaitu mendeteksi kadar hCG. Namun, tes darah memiliki kelebihan berupa
kemampuan untuk mendeteksi usia janin bertumbuh di dalam rahim seorang ibu.
Perkiraan Kadar hCG dalam Darah kehamilan trimester kedua

Kurang dari 5 IU/ L


Perempuan yang tidak hamil dan laki-laki
(international units per liter)
24-28 hari setelah haid terakhir 5–100 IU/L
4-5 minggu (1 bulan) setelah haid terakhir 50–500 IU/L
5-6 minggu setelah haid terakhir 100–10.000 IU/L
Ibu hamil:
14-16 minggu (4 bulan) setelah haid
12.000–270.000 IU/L
terakhir
kehamilan trimester ketiga 1.000-50.000 IU/L
Perempuan pasca menopause Kurang dari 10 IU/l
Keuntungan test kehamilan dengan menggunakan uji kadar hormon hCG
antara lain:
• Analisis yang hemat dan efektif dengan kualitas tinggi dan harganya
memadai.
• Efisien dan fleksibel: sample yang berbeda dapat dianalisis secara
simultan
dengan jumlah cekungan uji yang fleksibel.
• Spesifik: sepasang antibody mempunyai selektivitas tinggi secara spesifik
berikatan dengan ß-hCG
• Prosedur yang sederhana
Dalam pengaplikasian teknik ELISA, serum hCG selain dapat digunakan
sebagai test kehamilan untuk mengetahui keberadaan janin dalam rahim, juga
dapat digunakan untuk berbagai uji kehamilan lainnya, antara lain:
• Prediksi kehamilan yang multiple/ lebih dari 1.
• Diagnosis kehamilan yang abnormal.
• Penentuan fase kehamilan/ masa kehamilan.
• Diagnosis diferensial pada infertilitas/ ketidaksuburan pada wanita atau
pria.
• Investigasi lanjut setelah terapi untuk tumor trofoblastik.

Prinsip Kerja Tes hCG Menggunakan Teknik ELISA Sandwich.


Alat tes HCG yang menggunakan teknik ELISA tersedia dalam 2 bentuk di
pasaran, yaitu:
• Berupa alat yang digunakan dengan
cara memaparkannya pada aliran urin
saat pertama berkemih di pagi hari
selama beberapa saat. Jenis alat ini
sangat umum digunakan, karena dijual
bebas di apotek, dan penggunaannya mudah. Berikut ini adalah cara
kerjanya:
1. Pada saat alat tes mulai bekerja, akan muncul satu garis pada jendela
berbentuk lingkaran (jendela kontrol). Dimana garis tersebut merupakan
garis kontrol yang menunjukkan bahwa tes bekerja dengan benar.
2. Jendela berbentuk persegi akan menunjukkan hasil tes. Apabila garis
muncul pada jendela berbentuk persegi (jendela hasil) maka alat tes telah
mendeteksi adanya hormon hCG dan menunjukkan adanya kehamilan.
Berikut ini adalah ilustrasinya:
 Hasil Negatif: Munculnya satu garis pada jendela kontrol (berbentuk
lingkaran) menandakan bahwa anda tidak hamil dan tes telah dilakukan
dengan benar
 Hasil Positif: Munculnya 2 garis pada jendela
kontrol (berbentuk lingkaran) dan jendela hasil
(berbentuk persegi) menandakan anda hamil
 Hasil Tidak Valid: Apabila garis pada jendela
kontrol tidak muncul berarti tes tidak dilakukan
dengan benar.

• Berupa alat digunakan dengan cara membubuhi


beberapa tetes serum pada mikrotiter. Berikut ini
adalah cara kerjanya:
1. Mengandalkan antibody anti- ß-hCG
yang terimobilisasi pada media padat yang berikatan dengan ß-hCG
yang bebas dari sampel (urin)
2. Antibodi kelinci anti- ß-hCG berkonjugasi dengan horseradish
peroxidase (HRP) sebagai larutan konjugasi antibodi-enzim.
3. Sampel tes dibiarkan untuk bereaksi simultan dengan antibody,
menghasilkan ß-hCG antara fase padat dengan antibody-enzim.
4. Setelah inkubasi, cekungan dibilas untuk membilas antibody-enzim
yang tidak terikat. Kemudian substrat HRP, TMB, ditambahkan
untuk menghasilkan warna biru.
5. Perkembangan warna dihentikan dengan penambahan stop solution
yang akan mengubah warna jadi kuning.
6. Konsentrasi ß-hCG secara langsung proporsional terhadap intensitas
warna yang dihasilkan dan diukur absorbansinya dengan
spektrofotometer.