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La cromatografía es una técnica de separación de solutos de una mezcla, que se
basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a través
de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento. A este
disolvente se le llama V   y el medio poroso puede ser la V 

  , o bien servir de soporte a esta fase. Se habla de cromatografía en
columna cuando la fase estacionaria o su soporte están contenidos en una
columna.

La separación cromatográfica constituye un proceso dinámico que permite un


intercambio continuo por desplazamiento de una fase con respecto a la otra. El
diferente reparto de solutos entre las fases móvil y estacionaria es la causa de la
separación de los solutos. El soluto que tiene mayor afinidad por la fase
estacionaria se moverá con mayor lentitud.

La fase móvil se llama  . Cuando emerge por la salida de la columna se


llama  . El proceso que consiste en hacer pasar un líquido o un gas a lo
largo de la columna de cromatografía se llama 
  El     
 
 es el volumen de fase móvil que se requiere para eluir un soluto dado de la
columna cromatográfica.
Se puede clasificar las cromatografías en 5 grandes grupos:

' Cromatografía de Reparto.


' Cromatografía de Adsorción.
' Cromatografía de Intercambio Iónico.
' Cromatografía de Exclusión.
' Cromatografía de Afinidad.

m   V  
Está basada en la separación o reparto de una mezcla de solutos entre la fase
 (disolvente) y la fase 
  soportada sobre un sólido adecuado, de
acuerdo a las distintas solubilidades de estos solutos en ambas fases. Si el
disolvente es un líquido se denomina cromatografía líquida. Son cromatografía de
reparto la cromatografía en papel y la cromatografía en capa fina (TLC).

La cromatografía en papel se utiliza para la separación de cantidades mínimas de


soluto y también como un criterio de pureza. Se basa en la diferente velocidad con
que se mueve cada uno de los solutos a través de una fase 
  que es
el agua retenida sobre un soporte sólido e inerte (celulosa), arrastrado por un
disolvente en movimiento

Una vez realizada la cromatografía, la posición de los componentes se determina


mediante una técnica que permita ³visualizarlos´. Es común revelar el
cromatograma mediante reacciones que originen productos coloreados.

Los componentes de una mezcla se pueden identificar por su migración con


respecto al solvente móvil en condiciones definidas en relación con el
comportamiento de patrones. El cromatograma no es alterado por la presencia de
otros solutos.

Se calcula la razón de migración del soluto con respecto a la fase móvil (Ô ) que se
compara con la de los patrones (Ec. 2.1).

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El Ô debe calcularse de acuerdo a la distancia recorrida por el soluto, desde su


punto de partida hasta el punto medio de la posición de éste una vez corrida la
cromatografía, y la distancia recorrida por la fase móvil, también medida desde el
punto de partida del soluto hasta el frente del solvente en el papel.

Como los Ô son constantes en condiciones definidas y controladas permiten


identificar los componentes de una mezcla de solutos, en la medida que los Ô de
muestras y patrones se obtengan en un mismo experimento.

r m   V 
 

Está basada en la diferente adsorción y posterior desorción de sustancias


contenidas en un disolvente móvil (líquido o gas) sobre un sólido estacionario. No
se debe confundir la adsorción que es un fenómeno de superficie que se
manifiesta por el aumento de concentración de la interfase que rodea al medio
estacionario, con la absorción que consiste en la penetración de una sustancia en
el seno de otra. Ejemplos de cromatografía de adsorción son la cromatografía en
columna de alúmina y de carbón activado, la placa de sílica gel.

 m   V  
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La fase estacionaria es una matriz polimérica porosa que posee grupos iónicos
unidos covalentemente y contraiones móviles que pueden ser intercambiados por
iones arrastrados por la fase móvil (líquido).

 m   V ›
  
 

Las moléculas pueden ser separadas también sobre la base de sus diferentes
tamaños al pasar a través de una columna que contiene partículas hidratadas de
geles porosos. Se encuentra en el mercado un buen número de materiales para
estos fines, cuya composición y porosidad son controladas cuidadosamente, de
modo que moléculas de tamaño relativamente parecido puedan ser separadas
mediante la adecuada selección del tamaño del poro gel (tabla 1). El Sephadex
consta de partículas pequeñas de dextrano formadas por una red tridimensional
de cadenas de polisacáridos ramificados. Es altamente polar debido a su alto
contenido de grupos hidroxilos, por ello se hincha considerablemente cuando se
coloca en agua. La mezcla de moléculas grandes y pequeñas se colocan sobre la
superficie libre superior del gel. A medida que la muestra desciende por la
columna, las moléculas pequeñas difunden dentro del gel teniendo que recorrer un
camino más largo, mientras que las moléculas grandes pueden ser
completamente excluidas de los poros del gel. Eventualmente se obtiene una
separación completa en la que las moléculas grandes salen primero de la columna
y por último las más pequeñas.

El resultado de la columna cromatográfica se expresa en la forma de un diagrama


de elución que muestra la variación de la concentración del soluto en el eluyente
versus el volumen del eluyente que ha pasado por la columna. De este diagrama
se obtiene el volumen de elución.

El volumen de elución (—) no es un criterio para definir el comportamiento de un


compuesto, ya que varía con el volumen total de la columna (— ) y la forma como
la columna ha sido empaquetada. Para ello se utiliza la constante   (Ec. 2.2).

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En cromatografía de exclusión el volumen de la fase móvil se llama volumen


intersticial (— ). El valor de V0 se determina haciendo pasar por la columna una
molécula grande e inerte de peso molecular superior al límite de exclusión del gel.
El azul de dextrano 2000, un colorante con peso molecular de 2*106, se utiliza
generalmente con este propósito. Cuando no se dispone de la información
adecuada para este cálculo, el — se puede estimar como el 35% del volumen total
de la columna (—°. El volumen total de la columna se calcula a partir de las
dimensiones de la columna (Vt = ÊY YY Y ).

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