Anda di halaman 1dari 72

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software

http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Bioteknologi Farmasi
FAR 40541
2 SKS

Penanggung jawab: Dr Amarila Malik


Departemen Farmasi FMIPA-Universitas Indonesia
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

SASARAN PEMBELAJARAN:

Mengetahui konsep-konsep dalam bioteknologi,


keterkaitan beberapa disiplin ilmu dalam
bioteknologi, teknologi rekayasa biologi organisme,
teknologi DNA rekombinan/rekayasa genetika,
pemanfaatan bioteknologi dalam bidang farmasi,
dan penerapan bioteknologi dalam upaya
pemeliharaan kesehatan masyarakat.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

PUSTAKA :

•Wink, M. (Ed). An introduction to Molecular Biotechnology, 2006


•Glick, B.R & Paternak, J.J, 1998. Molecular Biotechnology, Principles
and Applications of Recombinant DNA, ASM Press.
•Jognson & Manasse, 1993. Biotechnology in Pharmacy, John E.
Smith, 1985. Biotechnology Principles, Van Nostrand Reinhold (UK)
•Wulf Crueger and Annelies Crueger, 1984. Biotechnology A Text
Book of Industrial Microbiology. Sinaeur Association Inc. Sunderland,
MA, USA
•J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, 1989. Moleculer Cloning A
Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Pres, USA
•James D. Watson, John Tooze, Davit T.Kurtz, 1983. Recombinant
DNA, Scientific American Books, New York, USA

•Indra K. Vasil, 1990. Biotechnology, Science, Education, 2nd


Commercialization (Editor), Elsevier Scientific Publish. Co.Inc.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Pokok-pokok Bahasan
•Pendahuluan
•Konsep-konsep dalam bioteknologi dan prospeknya dalam
bidang farmasi,
•Disiplin ilmu yang terkait dalam bioteknologi,
•Teknologi bioproses
•Pengembangan galur berpotensi dalam bidang farmasi:
fermentasi dan kinetikanya, proses hilir
•Materi genetik
•Rekayasa genetika dan Teknologi DNA rekombinan
•Terapi gen pada manusia,
•Pemanfaatan organisme prokariot dan eukariot dalam bidang
farmasi,
•Keamanan hayati produk rekayasa genetika dan bioetik.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Overview

• Pendahuluan - Bioteknologi Farmasi


• Dampak bioteknologi terhadap bidang
farmasi
• Rekayasa genetika-rekombinasi DNA –
kloning gen
• Aplikasi teknik molekular
• Produk komersial dari mikroorganisma
• Terapi Gen
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

BIOTEKNOLOGI FARMASI

Definisi: Aplikasi dari bioteknologi dalam farmasi

àDampak terhadap : obat-obatan


diagnostik
vaksin

BIOTEKNOLOGI:
- Pemanfaatan mikroorganisme untuk memproduksi produk-produk yang
penting dan
Bermanfaat : protein dan enzim

-Rekayasa genetika hewan dan tanaman agar menghasilkan protein asing


tertentu, juga senyawa kimia lainnya, spt. Vitamin

à Diperlukan “molecular basic knowledge”


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

PATOFISIOLOGI PENYAKIT

DRUG ACTION

IDENTIFIKASI DAN PRODUKSI TARGET OBAT: RESEPTOR, ENZIM

UNTUK DRUG DISCOVERY DAN DRUG DESIGN


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

TEKNIK DASAR BIOTEKNOLOGI BERBASIS BIOLOGI MOLEKULER

ORGANISME REKOMBINAN

Human insulin (1978):


produk farmasi pertama hasil rekayasa genetika

Sepotong DNA penyandi hormon insulin manusia


Transfer ke mikroorganisme : E. coli
Kontrol ekspresi Human insulin di E. coli

Gene cloning

Teknik : Rekayasa Genetika


Genetically modified/genetically engineered

1994:
21 produk farmasi turunan teknologi rekombinasi DNA
150 produk dalam taraf “clinical trial”
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Dampak Bioteknologi terhadap Farmasi

TUGAS:

Cari apa saja dampak bioteknologi terhadap farmasi.


Diskusikan per kelompok
Cari protein-protein yang diproduksi secara teknologi
DNA rekombinan

Terhadap profesi farmasis:


àisu-isu ke arah farmakoekonomi dan etika (sosial)
àMenjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan
obat-obat dan efek/akibat penanganan yang tidak tepat
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

DAMPAK BIOTEKNOLOGI
TERHADAP BIDANG FARMASI

I. Obat – obatan berupa protein dan peptide


• stabilitas, formulasi, penyimpanan, efek samping berbeda dengan obat –
obat yang berupa molekul, kecil
Contoh : suhu refrigerator ; tidak boleh terkocok

II. Pilihan produk biotek ( protein & peptida).


• Pertimbangan sistem ekspresi
• Sistem ekspresi berbeda, maka produk sedikit berbeda
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

III. Obat – obat kelas baru yang beredar di pasaran


• Pemahaman patofisiologi penyakit yang sebelumnya tidak dapat
diatasi .
Contoh : human insulin ( HumulinR Lilly ) ; Hep B-vaccine
(Engerix – BR Smith Kline Beecham)

IV. Agents diagnostik model baru


• Contoh : ELISA à monoclonal antibody (Enzyme – Linked
immunosorbant Assay) àreaksi warna
• probe untuk Plasmodium falciparum, berupa potongan DNA spesifik

Profesi FARMASIS “
• Isu – isu ke arah farmakoekonomi & etika (ethical )
• Menjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat – obat
dan efek /akibat penanganan yang tidak tepat.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

RAKAYASA GENETIKA
Definisi
Adalah proses pembentukan rekombinan baru dari material genetik
dengan cara penyisipan suatu molekul asam nukleat asing ( yang
dihasilkan di luar sel ) ke dalam suatu vektor, sehingga
memungkinkan penggabungan dan kelanjutan berkembang /
diperbanyak di dalam sel inang yang baru.

KLON adalah organisme identik yang terbentuk secara genetik dan


membawa seluruh potongan DNA yang telah disisipkan, dan
memperbanyak molekul yang baru.

Kloning gen à rekayasa genetika, teknologi DNA rekombinan


Contoh : domba Dolly
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

RAKAYASA GENETIKA

Material genetik :
adalah material yang membawa informasi genetik yang diturunkan
dari tetua ke turunannya, yaitu asam nukleat
DNA : deoksi ribonucleic acid
RNA : ribonucleic acid

Vektor Kloning :
adalah wahana pembawa gen target untuk mengintroduksi gen ke
inang tertentu.

Gen :
adalah sekuens DNA yang menyandikan protein.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

ASPEK KLONING

- Menerobos barier alamiah suatu spesies


àInsulin manusia diproduksi oleh E. coli à E. coli sebagai pabrik
biologis

-Memungkinkan memperoleh dan memanipulasi secara relatif


potongan – potongan DNA yang menyandikan fungsi spesifik terapi
gen penyebab penyakit keturunan
Co : Sindrom Hurler ( KOMPAS, 02/08’97)
sel sumsum tulang belakang diekrtraksi, dimanipulasi dengan
sel – sel normal, diintroduksi kembali melalui pembuluh darah.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

ASPEK KLONING
Adanya rekayasa genetika memungkinkan kita tidak hanya
mengisolasi dan menskrining, tapi juga dapat mengkonstruksi
organisme, dalam hal ini galur – galur yang produktif.

Mikroorganisme
Tanaman BIOREAKTOR
Hewan

Dua dasar penerapan kloning gen


1. Isolasi dan studi gen – gen tertentu
àDiperoleh pengertian yang mendalam mengenai fungsi dan
mekanisme regulasi gen
2. Peningkatan produksi oleh suatu gen spesifik
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

TEKNIK – TEKNIK DASAR YANG BERKAITAN DENGAN KLONING GEN

•Metode isolasi DNA


•Metode memotong dan menyambung molekul – molekul asam
nukleat
•Metode transformasi pada sel host/ inang ; sebagai dasar :
Escherichia coli

( E. coli ) à why ?

Hampir semua pengembangan pertama teknik rekayasa genetika


digunakan E. coli sebagai organisme inang :

• Paling banyak dipelajari


• Paling lengkap informasi material genetiknya :
- sudah lengkap peta genomnya.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

DEFINISI

§Isolasi DNA
mengekstraksi molekul DNA dari sel
§Memotong DNA ( digestion )
memutus ikatan molekul DNA pada antara basa nt pada
sekuens tertentu oleh suatu endonuklease restriksi
§Menyambung DNA ( Ligation )
Potongan DNA / gen asing disambungkan dengan DNA
vector yang terpotong linier oleh enzim Ligase
§Transformasi
§Mengintroduksi DNA ke dalam sel inang
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

ISOLASI DNA
1.Penghancuran dinding sel : - mekanik
- enzimatis
2. Lisis sel : - S D S : sodium dodesil sulfat
- Triton X – 100
3. Membersihkan debris sel
- sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven
organik
Contoh : fenol, CHCl3 kemudian disentrifugasi ;
atau proteinase-K
4. Presipitasi
- + alkohol à sentrifugasi gradien CsCl ; elektro-
- + alcohol + NH4 asetat
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Memisahkan DNA plasmid dan DNA kromosom/genom

1. Beda struktur tersier :


DNA plasmid : supercoiled à Covalently Closed Circular ( CCC )
DNA kromosom/genom : linier

2. Sifat denaturasi
- dengan alkali, pemanasan
- DNA plasmid lebih mudah renaturasi

3. Ultrasentrifugasi :
CsCl gradien à DNA plasmid berada di bawah

4. Mobilitas di elektroforesis gel agarose


àDNA plasmid lebih diskret /tajam pitanya
CsCl / EtBr : DNA linier (kromosom)
DNA Supercoiled (plasmid)
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Agarose gel electrophoresis

lamda lamda plasmid plasmid


+RE +RE

DNA size
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

ANALISIS KUALITAS DAN KUANTITAS DNA

•Elektroforesis
- DNA diwarnai dengan Etidium bromida
- dilarikan pada gel agarose dari kutub (–) ke (+)
- dapat diketahui adanya degradasi

Degradasi :
Ik. Fosfodiester putus

Penyimpanan :
> - 200C - DNAse tidak aktif
- mencegah degradasi oleh DNAse
> TE buffer : mencegah degradasi oleh DNAse
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

METODE – METODE ISOLASI PLASMID

§skala besar : sentrifugasi gradien CsCl


§skala kecil ~ mini prep, midiprep
•sentrifugasi gradien
•alkalin lisis
•metode ammonium asetat
•metode partikel gelas ( glass milk )
•metode partikel magnetic ( magnetic beads )
•kromatografi ( exclusion chromatography)
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

VEKTOR KLONING
PLASMID
bereplikasi diri ( self replicating )
utas ganda : d s
molekul DNA sirkulator
di maintain di dalam bakteria sebagai bentuk ekstrakromosomal
copy number ( Jumlah kopi per sel ):
high copy number 10 – 100 kopi / sel
low copy number 1 – 4 kopi / sel
medium copy number diantaranya
Ukuran : 1 s/d 500 kb
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

VEKTOR KLONING
Spektrum inang :
broad hostrange à dapat bereplikasi pada sejumlah spesies
bakteri
narrow hostrange à hanya dapat bereplikasi pada spesies khusus

Beberapa ciri khas plasmid untuk vektor cloning :


§Ukuran kecil
§Mempunyai situs – situs pengenalan ER yang unik ( tunggal ),
tempat insert disisipkan / diklon.
§Satu atau lebih penanda seleksi genetic, untuk mengindentifikasi
sel resipien yang membawa kontruksi DNA vektor - insert.
§Plasmid cloning vector harus di-genetically engineered
Contoh : pBR 322, pUC 19
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

PLASMID
-Molekul DNA ekstrakromosom yang bereplikasi mandiri,
berbentuk sirkular, utas ganda.

- Terutama ditemukan pada bakteria, juga : Kapang


Eukariotik ( beberapa )

- Plasmid alami menyandikan :


1. Resistensi AB
2. Colicin = Bakteriosin
3. Virulensi
4. Aktivitas metabolit
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

STABILITAS PLASMID
kondisi optimum, stabil medium tumbuh
- Mandiri à tidak tergantung kromosom
ada gen ORI : untuk replikasi mandiri

- Plasmid rekayasa
Untuk teknologi DNA rekombinan
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

PEMOTONGAN DNA (digesti )

Restriction Enzymes = enzim restriksi


• Diperoleh dari bakteri sbg mekanisme pertahanan
terhadap infeksi virus DNA
• Endonucleases = memotong (cleave) di dalam utasan
DNA
• Telah diketahui ada 3,139 enzyme
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Enzyme Site Recognition =


situs pengenalan enzim restriksi
• Setiap enzim mendigesti (memotong) DNA pada sekuens
spesifik = situs restriksi (restriction site)
• Enzim mengenali 4- atau 6- pasangan basa , dengan
sekuens palindromik (eg GAATTC)
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

5’ versus 3’ overhang
• Enzyme cuts à
5’ G
GAATTC 3’
3’ CTTAAG
G 5’

5’ G 3’ 5’ AATTC 3’
3’ CTTAA 5’ 3’ G 5’

§ Generates 5’ overhang
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Common Restriction Enzymes

• EcoRI 5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
– Escherichia coli
– 5’ overhang

• PstI 5’ CTGCAG 3’
– Providencia stuartii 3’ CACGTC 5’
– 3’ overhang
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

The DNA Digestion


Restriction Buffer provides optimal conditions

– NaCl provides the correct ionic strength


– Tris-HCl provides the proper pH
– Mg2+ is an enzyme co-factor
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

DNA Digestion Temperature


• Why incubate at 37°C?
Body temperature is optimal for these and most other
enzymes

• What happens if temperature is too hot or cool?


G Too hot = enzyme may be denatured, killed
J Too cool= enzyme activity lowered, requiring longer
digestion time
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Agarose Electrophoresis
• Arus listrik yang membawa DNA bermuatan
negatif ke elektroda muatan (warna
merah)positif melalui suatu gel agaros

• Gel agarose memisahkan fragmen DNA


berdasarkan ukuran
– Fragmen kecil bergerak lebih di depan (front) di
dibandingkan fragmen besar
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

PENYAMBUNGAN DNA ( Ligasi )

- Penyambungan gugus 3’OH dan DNA insert. ( Gb. )


- Ligasi lebih mudah pada ujung – ujung sticky ( dengan ER
sama / isoschizomer / isocaudomer).
- Reaksi Ligasi

DNA vektor 3 1 : 2 ( s/d 1: 10 )


DNA insert 6
Buter T4 DNA ligase 5x 4
T4 DNA ligase 1
dH2O ( destilata bebas ion ) 6
Total 20

•Inkubasi : 40 – 150 C semalam ( 18 – 24 jam )


- Ujung blunt end : dapat diligasi, walaupun didigesti dengan ER berbeda.
Pada reaksi Ligasi, selalu sertakan pula control – control :
k. Transformasi : vector utuh
k. ligasi : vector linier / terpotong + enz – ligase
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

TRANSFORMASI

à Pengambilan DNA rekombinan oleh E.coli dengan cara


mengintroduksi DNA murni (purified) ke dalam sel yang sudah
kompeten.

GFP
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

TRANSFORMASI

E.coli sebagai sel inang :

> sudah dimodifikasi genetik, antara lain :

> Rec A- : tidak mempunyai gen untuk endonuklease restriksi


sehingga DNA rekombinan yang diintroduksi tidak didegradasi

contoh : E.coli DH5α, E.coli HB101


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

TRANSFORMASI

• Electroporation
– Electrical shock yang menyebabkan membran
menjadi permeabel terhadap DNA

• Calcium Chloride/Heat Shock


– Chemically-competent cells mengambil DNA
setelah heat shock

E.coli dibuat kompeten dengan cara kimia:


-Peningkatan suhu dan CaCl2 à heat shock pada 370 C – 420 C,
dalam larutan CaCl2

- Setelah ditransformasi, disebar pada medium seleksi


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Electroporation

Electric shock

Membuat pori-pori kecil


pada membran sel
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

SELEKSI
E.coli ( plasmid DNA rekombinan ) di seleksi terhadap
E.coli yang tidak membawa rekombinan

Macam seleksi : ( 4 )

1.Seleksi langsung : contoh: ABR = ABS (inaktivasi penyisipan )


à perlu teknik cawan replika (replica plating)
2. seleksi warna koloni : X – gal ®, memanfaatkan gen lacZ
yang menghasilkan enz. β – galactosidase.
Enzim tsb mengubah substrat X- gal menjadi β-gal biru
3.Komplementasi = gen Lacz pada vector vs pada E. coli
DHS α ( inang )
4. Analisa hibridisasi : - dot blot; colony hybridization
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

REPLICA PLATING
• Pertama sebar sel pada cawan agar mengandung AMPICILLIN
– Semua TRANSFORMAN menghasilkan koloni (tumbuh)

• Replika pada cawan mengandung


Tetrasiklin
– Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh
Kain
BLOCK Beludru

PRESS

AMP LATE
= Transforman
AMPR
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

REPLICA PLATING
• Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin
– Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh

Kain
BLOCK Beludru

PRESS
BLOCK
AMP LATE AMP LATE

BLOCK

BLOCK

TET PLATE AMP LATE


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

REPLICA PLATING
• Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin
– Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh

GROW
TETRES NON-
RECOMBINANTS

TET PLATE

• Cawan TET dan cawan AMP dibandingkan


– Ambil REKOMBINAN dari TETSENS AMPRES
dari cawan AMP
AMP LATE

TETRES NON-
RECOMBINANTS TET PLATE
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

VERIFIKASI DAN PEMETAAN DNA REKOMBINAN

Dilakukan menggunakan Enzim endonuklease restriksi (ER).

Vertifikasi :
àMemastikan adanya DNA insert / asing yang di klon pada vektor,
menggunakan satu dan dua (ganda) ER (single digest dan double
digest), berdasarkan ukuran DNA dengan di larikan (running) di
elektroforesis gel agarose.

Pemetaan :
Manfaat ER dalam biologi molekuler.
Untuk mengetahui ukuran DNA rekombinan berdasarkan situs – situs
Enzim restriksi.
à Disebut Physical mapping ( pemetaan fisik ):
pemetaan fisik yang lengkap memerlukan berbagai ER.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

KLONING SEKUENS DNA PENYANDI PROTEIN EUKARIOT

Perlu teknik khusus


àProkariot tidak dapat melakukan intron splicing
àDNA eukariot besar karena mengandung banyak intron
àEkspresi akan kacau oleh prokariot

Oleh karena itu :

-menggunakan MRNA mature


- Enzim Reverse transcriptase yang mensintesis satu utas DNA dari
RNA kmd dilanjutkan dengan kerja Klenow fragment yang
mensintesis utas kedua DNA dari template DNA

Sehingga akan diperoleh dua macam c DNA ( complementary DNA ) :


yang utuh & parsial
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

PRODUK BIOTEKNOLOGI MOLEKULER

SEKTOR :

Medicinal :
-Human Therapeutic
-Human Diagnostic

Non medical :
-Agriculture
-Specialities
-Non-medical Diagnostic
Contoh : INDIGO à pewarna jeans
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

INDIGO
-diekstraksi dari tanaman
-batubara
-rekombinan DNA
Lintasan Indigo : banyak dipakai untuk industri Blue Jeans

Genencor International : green route to blue dye

Indol diubah menjadi cis – indole 2,3 – dehydrodiol dengan


gen dari Pseudomonas putida yang disisipkan pada E. coli
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

DIAGNOSTIK MOLEKULER

Kemajuan bidang pengobatan karena berhasil didapatkannya virus


– virus spesifik, bakteri, fungi dll, juga molekul – molekul kecil.

Untuk kepentingan pencegahan, control, pengobatan dari penyakit –


penyakit infeksi maka perlu identifikasi dini dan akurat terhadap
organisme pathogen penyebab penyakit

à ditumbuhkan/dikultur à amati sifat – sifat fisiologis

KENDALA : lama
mahal

à ada yang tidak dapat ditumbuhkan/dikulturkan


à sulit mendeteksi organisme penyebab penyakit
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Untuk mengatasi kendala – kendala tersebut maka


dikembangkan prosedur – prosedur diagnostik molekular:

1. Metode immunologi detection


Co : ELISA monoclonal antibody yang diproduksi di E. coli
( Enzyme – linked immunosorbent assay )

2. Metode deteksi DNA


yaitu deteksi menggunakan pelacak DNA
Prinsip hibridisasi asam. Nukleat
Essei ini : cepat
reliable
spesifisitas tinggi : hanya berhibridisasi dengan sekuens
nukleotida target
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

PRODUK KOMERSIAL REKAYASA MIKROBA

HUMAN PROTEIN PHARMACEUTICALS


- jumlah sangat terbatas
- produksinya mahal
-biological mode of action belum dikarakterisasi jelas

+ 300 macam protein terapeutis manusia yang potensial telah

diklon, dan telah melalui berbagai uji selama bertahun–tahun

sebelum tersedia secara komersial. (Tabel 7.1)


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Pharmaceutical biotechnology

• Diabetes Insulin
• Haemophilia Factor VIII
• Stroke Tissue plasminogen activator
• Growth failure Human growth hormone
• Anaemia Erythropoietin
• Viral infection Interferon
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Strategi teknologi rekombinan DNA human protein pharmaceutical

Isolasi cDNA

Engineering (Rekayasa)

Optimizing Gene Expression


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

§Isolasi cDNA

Strategi I:
Isolasi protein target

Determinasi sekuens asam amino

Deduksi menjadi sekuens DNA penyandi

Sintesis oligonukleotida

Gunakan sebagai probe utk mengisolasi gen atau cDNA dari


pustaka genom atau pustaka cDNA
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Strategi II: Jika suatu protein khusus disintesis di suatu


jaringan khusus

à Pustaka cDNA dapat dibuat dari mRNA ; tidak perlu dari


protein.
mRNA berfungsi sebagai probe untuk sekuens DNA target.
Contoh : Insulin à disintesis hanya dijaringan khusus di
pancreas yaitu di pulau Langerhans.
Oleh karena itu fraksi mRNA yang diisolasi dari jaringan tersebut
70 % menyandikan insulin.

MRNA (mature)

Reverse transcribed

cDNA
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

§Engineering

Strategi untuk mendesain protein – protein, dengan cara mengatur


kombinasi domain – domain fungsional suatu protein, atau dengan
cara mutagenesisis terarah, agar dapat mempelajari mode of action
suatu protein.

§Optimizing Gene Expression

-sistem ekspresi prokariot dan eukariot beda


-jika menggunakan prokariot sebagai sel inang akan menurunkan
biaya
-namun dipertanyakan apakah efektifitas sintesis bentuk fungsional
protein heterogous masih tetap??
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

§Optimizing Gene Expression

Harus dipilih berdasarkan kriteria :

-memproduksi protein heterologus yang mirip dengan mature


authentic protein, selain
-mampu tumbuh dengan densitas sel tinggi
-mudah dipurifikasi

Contoh : human interleukin – 3


Produksi paling baik di Bacillus licheniformis
meskipun produksi banyak di E. coli, tapi menghasilkan protein
interleukin-3 yang salah.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Sintesis L-Ascorbic Acid ( Vit. C)

D-glucose

D-Sorbitol L-sorbose 2 KLG (2-keto-L-gluconic acid)

L- ascorbic Acid

à Satu tahap fermentasi mikroba à sejumlah tahap – tahap


kimia

Dari penelitian – penelitian biokimia mengenai lintasan – lintasan


metabolit diketahui bahwa beberapa mikroorganisme menunjukkan
kemungkinan untuk mensintesis 2 - KLG
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Acetobacter
Gluconobacter D. glucose 2,5 – diketo- D- glukonic acid (2,5 – DKG)
Erwinia
melalui beberapa lintas metabolisme

Corynebacterium 2,5-DKG reduktase


Brevibacterium 2,5 – DKG 2 – KLG
Arthrobacter
1 lintas metabolisme

Gen penyandi enzim 2.5 – DKG reduktase dari Corynebacterium di


klon di Erwinia
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

•MENINGKATKAN PRODUKSI ANTIBOTIK

Produksi antibiotik dari Streptomyces spp dengan Fermentasi


à lama – lama konsentrasi oksigen dalam media cair berkurang
Pertumbuhan Streptomyces spp menurun dan produksi antibiotik
menurun

Vitreoscilla sp adalah bakteri aerob yang dapat hidup dalam kondisi


miskin O2

Bakteri ini dapat memproduksi suatu protein hem homodimerik yang


berfungsi mirip dengan hemoglobin eukariot, yaitu dapat mengikat O2
dari medium kemudian menyalurkannya ke dalam sel.

Gen yang menyandikan protein heme tersebut di klon di Streptomyces


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

TERAPI GEN

• Beberapa penyakit genetik manusia dapat dikaitkan


terhadap suatu mutasi di suatu gen tunggal, atau
mungkin juga lebih kompleks, yaitu terhadap
sejumlah gen-gen berbeda yang bermutasi.

• TUJUAN utama riset dalam genetika molekuler


manusia à menentukan kecacatan pada level gen,
dan bagaimana keadaan tersebut menyebabkan
simtom penyakit genetik yang spesifik
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

PENDEKATAN

Protein yang terlibat

Isolasi dan karakterisasi

Sekuensing asam amino

Investigasi sekuen penyandi

Buat pelacak spesifik

Isolasi gen target dari pustaka genom


Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

• Dasar pemikiran terapi gen:


– Jika versi normal dari gen untuk penyakit manusia
telah berhasil diklon, maka sangat berbuna untuk
memperbaiki kecacatan/mutasi gen tersebut
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Ex vivo gene therapy


Sel diambil dari orang penderita penyakit (pasien)

Perbaiki cacat genetik dengan cara transfer gen

Seleksi dan tumbuhkan sel-sel yang telah dikoreksi


secara genetik (remedial cell)

Infuskan atau transplantasikan kembali ke pasien

Gen remedial diintroduksi ke sel oleh suatu retrovirus mencit yang


seudah direkayasa sehingga tidak mampu mengkonversi sel normal
menjadi sel kanker.
Retrovirus (rekombinan) menginfeksi sel manusia sehingga gen
remedial masuk
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

In vivo gene therapy


Menggunakan adenovirus : ds DNA
low pathogenicity in human

Gen remedial

Konstruksi pada vektor virus


di bawah promotor khusus
yang spesifik menginfeksi
sel khusus (sel target)
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Antisense therapy
Dirancang untuk pencegahan;
- penurunan ekspresi gen tertentu,
- bekerja pada tahap translasi (mRNA)

Ada 2 cara:
A.Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas)
B.Menggunakan gen antisense yang diklon

Antisense adalah utas asam nukleat DNA yang tidak


ditranskripsikan, merupakan utas pasangan dari utas yang
ditranskripsikan (utas sense).
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

A. Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas):


DNA
------ A G C T G A T ----------
-------T C G A C T A ----------
transcription
antisense
mRNA oligonukleotida
AGCUGAU TCGACTA

Base pairing
AGCUGAU
TCGACTA

No translation
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

B. Menggunakan gen antisense yang diklon

DNA
------ A G C T G A T ---------- -------T G C G A C T A-------
-------T C G A C T A ---------- -------A C G C T G A T-------
transcription

mRNA
AGCUGAU UCGACUA

Base pairing
mRNA sense AGCUGAU
mRNA antisense TCGACTA

No translation
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET


MOLEKULER
I. DNA sequencing techniques
1. prosedur Dideoxynucleotide :
- Maxam – Gilbert : chemical based
- Sanger : enzymatic based
2. Penggunaan Bacteriophage M13
Untuk memperoleh ss.DNA
Target DNA + 500 bp
< 2000 bp : harus dipotong – potong menjadi beberapa fragmen
overlap dengan ER
• Primer Walking :
• Uk. DNA > 5000 BP
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET


MOLEKULER
II. Polymerase Chain Reaction ( PCR )
- Amplifikasi molekul DNA
- Esensial :
1. Dua buah primer sintesis oligonukleotida
(masing – masing ~ 20 nt )
2. sekuens target pada sampel DNA
3. DNA polymerase yang thermostabil à mencapai suhu 950 C
atau lebih
4. Empat macam deoxynucleotidatriphosphat (dNTP) :
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET


MOLEKULER
II. Polymerase Chain Reaction ( PCR )

Tahap – tahap :
-denaturasi : - suhu 950 C : ds-DNA menjadi ss-DNA
- enzim Taq DNA polymerase
- primer
-renaturasi /annealing : suhu diturunkan perlahan sampai 550C
primer berikatan dengan template DNA
-sintesis : - suhu dinaikkan sampai 750C, suhu optimum untuk fungsi
katalisis enzim Taq DNA polymerase untuk
mensintesis DNA.

Ketiga tahap diulangi beberapa siklus sampai diperoleh molekul


DNA dalam jumlah besar.