Bioaktif Alkaloid dari Endophytic Aspergillus fumigatus

Ditemukan dua senyawa alkaloid baru dengan nama 9-deacetylfumigaclavine C (1) dan 9-deacetoxyfumigaclavine
C (2), bersama dengan 12 senyawa yang belum diketahui (3-14), diisolasi dari kultur aspergilus fumigatus. Struktur dari senyawa
baru tersebut diketahui berdasarkan dari analisis spektroskopi. Senyawa kedua menunjukkan potensial sitotoksisitas terhadap sel
leukemia manusia (K562) dengan nilai IC50 sebesar 3.1 M, dan dapat dibandingkan dengan doxorubicin hidroklorida sehingga
dapat dijadikan obat untuk leukemia. Sedangkan 14-norpseurotin (4) mempunyai pengaruh signifikan terhadap perkembangan
neurit dari sel pheochromocytomatikus (PC12) dalam konsentrasi 10.0 M.

Genus aspergilus (Moniliaceae), yang telah dikenal terdapat sekitar 180 jenis dan merupakan sumber yang kaya akan senyawa
bioaktif metabolit. Bahkan setelah investigasi selama dua decade, bakteri jenis ini masih menghasilkan senyawa metabolit
dengan struktur baru dan mempunyai aktivitas biologi yang menarik. Dalam perkembangan penelitian untuk senyawa kimia baru
dan potensial biologi senyawa metabolit didapatkan dari tanaman medicinal atau simbiosis jamur di tubuh tanaman atau hewan,
seperti jamur endophyte A.fumigatus yang diisolasi dari cynodondactylon. Melalui kultur dan fraksinasi dari ekstrak EtOAc A.
Fumigates dapat diisolasi menghasilkan dua alkaloid baru dengan nama 9-deacetylfumigaclavine C (1) dan 9-
deacetoxyfumigaclavine C (2) berikut dengan 12 senyawa metabolit yang belum diidentifikasi sebagai fumigaclavine C (3),2 14-
norpseurotin (4),3 pseurotin A (5),4 spirotryprostatin A (6),5 6-methoxyspirotryprostatin B (7),3 fumitremorgin F (8),6
dimethylgliotoxin (9),7 12R-fumitremorgin C (10),2 demethoxyfumitremorgin C (11),8 verruculogen (12),9 and tryprostatins A
(13)10 and B (14). Struktur dari senyawa baru ditunjukkan oleh spektroskopi MS, NMR, CD method. Disini akan diterangkan
tentang isolasi, elusidasi struktur, dan bioaktifitas senyawa ini. Ekstrak EtOAc dari kultur A.fumigatus dipisahkan dengan
Kromatografi Silica gel dan sephadex LH-20, yang dilanjutkan dengan pemurnian melalui HPLC phase terbalik, menghasilkan
14 alkaloid (1-14).

9-Deacetylfumigaclavine C (1) yang diisolasi berwarna putih, berbentuk bubuk amorp. Rumus molekulnya C 21H28N2O menurut
pengukuran ion positif HR-ESIMS, dan dapat diperkirakan 42 amu merupakan fumigaclavine C (3). Spektrum H-NMR dan C-
NMR dari senyawa 1 sangat mirip dengan senyawa 3, kecuali untuk gugus 9-O-acetyl dalam fumigaclavine C (Tabel1). Dalam
pengamatan terjadi downfield shifts pada C-8 dan C-10 dan upfield shifts pada C-5, C-7, dan C-9.
Observasi melalui data MS didapatkan deasetilasi turunan dari fumigaclavine C (3).Pendapat ini didukung juga melalui korelasi
data HMBC dari H-9 (δ 4.53) dengan nilai C-5 (δ 60.8), C-7 (δ57.3), C-11 (δ 128.7), dan C-18 (δ 16.7) dan korelasi 1H-1H COSY
dari H-8 (δ 2.18) melalui H-10 (δ 3.33).
9-Deacetoxyfumigaclavine C (2) yang diisolasi berwarna putih, berbentuk serbuk amorp. Dari data HRESIMS didapatkan rumus
molekul C21H28N2.16 amu kurang dari senyawa 1. Data H-NMR dan C-NMR (table1) menunjukkan bahwa senyawa 2 mirip
dengan 9-deacetylfumigaclavine C (1) kecuali untuk sinyal pada gugus 9-metil [δH4.53 (brs), δC 68.9] dalam senyawa 1, yang
digantikan oleh fungsi metil [δH 2.69 (m), 1.13 (m); δC 36.1)] dalam senyawa 2. Pergeseran kimia upfield shifts dari C-9 dan H-9
dalam senyawa 2 yang kehilangan atom oksigen (16 amu), menunjukkan kemungkinan senyawa tersebut adalah 9-deoxy turunan
dari senyawa 1. Pendapat ini didukung oleh korelasi 1H-1H COSY dari H-8 (δ 2.28) melalui H-10 (δ 3.17) dan juga oleh korelasi
HMBC dari C-9 dengan H-7 (δ 2.10/3.17) dan H-18 (δ 1.02).
Konfigurasi relative dari senyawa 1 dan 2 ditentukan oleh data NOESY dan magnitude yang stabil dari kopling H-H. Dengan
demikian, korelasi NOE diamati saat pemasangan proton H-8/H-9 dan H-9/H-10 dalam senyawa 1 dan H-8/H-10 dalam senyawa
2 serta diperkirakan senyawa 3 mempunyai konfigurasi relative sama. Konfigurasi sesungguhnya dari senyawa 1 dan 2
ditunjukkan dari kurva CD (didukung keterangan), dimana efek cotton menunjukkan perbandingan dari senyawa 3.
Senyawa 1 dan 2 diuji sitotoksisitasnya terhadap KB (human nasopharynyeal epidermoid), MCF-7
(adenokarsinoma payudara manusia), dan K562 (leukimia manusia) lingkungan sel kanker. Senyawa ini
menunjukkan inhibisi selektif pada sel-sel K562, dengan nilai IC 50 yaitu masing-masing 41,0 ± 4,6 μM dan
3,1 ± 0,9 μM,. Sebagai catatan bahwa aktivitas metabolit senyawa 2 mirip dengan doksorubisin
hidroklorida (1,2 ± 0,2 μM), sekarang obat ini digunakan untuk pengobatan leukemia. Selain itu, 14-
norpseurotin (4) dapat mempengaruhi perkembangan neurite pada sel PC12 dengan konsentrasi
10,0μM, lebih aktif dari pada pseurotin A (5), yang telah dilaporkan dapat mendorong perkembangan
neurite (Gambar 1), sedangkan isolat yang lain tidak aktif.

Gambar 1. Efek dari 14-norpseurotin (4) dan pseurotin (5) dalam pertumbuhan neurit pada sel PC-12. PC-12 diinkubasi
selama 2 hari tanpa obat (control).

Eksperimental Bagian.
Prosedur Eksperimental umum.Rotasi optic dianalisis dengan Polarimeter digital Perkin-Elmer 341.
Spectra UV dianalisis dengan spektrofotometer Hitachi U-3000. Spectra IR diukur dengan spektrometer
FT-IR Nexus 870. Spectra HRESIMS diukur dengan spektrometermassa 6210 Agilent. Data NMR diukur
dengan spectrometer NMR Bruker AV500 dan AV300 menggunakan TMS sebagai standar, dan
pergeseran kimianya dicatat sebagai nilai-nilai δ. Semipreparative HPLC dilakukan menggunakan kolom
ODS Allsphere (250 × 4,6 mm), pompa Hitachi L-7100, dan detektor UV L-7400. Silika gel (200-300 mesh)
untuk kromatografi kolom dan dibeli dari Qingdao Marine Chemical Factory, Qingdao, Cina. Sephadex
LH-20 dibeli dari Pharmacia Biotech, Swedia. Semua bahan kimia lainnya merupakan standar analisis.
Semua sel - sel disediakan oleh Pusat Provinsi Jiangsu Pencegahan dan Pengendalian Penyakit (Nanjing,
Cina).

Bahan jamur. strain A. fumigatus (galur no.CY018) diisolasi dari batang C. dactylon yang dikumpulkan
pada bulan November 2001 dari Yancheng Biosphere Reserve, Provinsi Jiangsu. Tanaman yang
dikumpulkan dikonfirmasi oleh Prof LX Zhang (Nanjing University), dengan specimen yang diawetkan
dalam herbarium. Strain diidentifikasi oleh Dr. Y. C. Song. Specimen disimpan di laboratorium pada
temperature -80 ° C. Strain dijaga dalam media agar miring dekstrosa kentang yang mengandung 10%
NaCl dan disimpan pada suhu 4 ° C.

Fermentasi dan Ekstraksi. Strain dikultur pada media agar miring dekstrosa kentang (PDA) pada suhu
25 ° C selama 5 hari. Media agar diinokulasikan ke dalam Erlenmeyer (1000 mL) masing-masing berisi
300 mL media PDA. Setelah 4 hari, kultur dipindahkan ke dalam gelas piala 1 L, yang masing-masing
berisi media Czapack yaitu media yang mengandung sukrosa (30,0 g / L), NaNO3 (3,0 g / L), KCl (0,5 g /
L), MgSO4 · 7H2O (0,5 g / L), FeSO4 (0,01 g / L), K2HPO4 (1,0 g / L), dan ekstrak ragi (1,0 g / L). Kultur
dibiarkan selama 14 hari pada suhu 28 ° C. Kultur dipanen (30 L) diekstrak pada suhu kamar dengan
EtOAc (3 × 30 L). pelarut di evaporasi pada tekanan rendah dan didapatkan minyak hitam (42 g), hasil
yang didapat diencerkan dengan H2O untuk membentuk suspensi berair. Suspense ini diekstraksi
dengan petroleum eter dan EtOAc. Fraksi EtOAc menunjukkan sitotoksik, lalu dikumpulkan dalam vacuo
agar diperoleh residu (31 g) untuk pemisahan lebih lanjut.

Isolasi dan Pemurnian.

ekstrak EtOAc (31 g) dipisahkan pada kolom silika gel dielusi dengan CHCl3-MeOH gradien (0-100%).
Senyawa yang didapat digabungkan menjadi 11 fraksi berbeda berdasarkanan analisis TLC.Fraksi yang
mengandung senyawa bioaktif Fr-2 (2.3 g, IC50 dari Fr-2 yang positif terhadap sel KB sebesar 76 μg /
mL) dan pemisahan dilakukan dengan kolom RP C-18 yang selanjutnya dielusidasi dengan campuran
MeOH-H2O (15:85, 30:70, 50 : 50, 60:40, 1:0) sehingga terbentuk enam subfraksi, Fr-2-1-Fr-2-6. Fr-2-2
(112 mg). subfraksi ini kemudian dipisahkan lagi melalui HPLC dengan perbandingan H2O-MeOH (3:7)
dan terbentuk senyawa 2 (7.1 mg) dan 6 (2,5 mg). Fr-2-4 (32 mg) dilakukan pemurnian dengan
Sephadex LH-20 menghasilkan senyawa 5 (4,8 mg). Fr-2-5 (324 mg) dipisahkan melalui elusidasi HPLC
dengan perbandingan pelarut MeOH-H2O (3:1) menghasilkan senyawa 1 (17,0 mg), 4 (2,2 mg), 12 (1.2
mg), dan 14 (9,3 mg) . fraksi Fr-3 (1.1 g) dipisahkan menjadi 9 subfraksi dengan Sephadex LH-20,
dielusidasi dengan MeOH-CHCl3 (1:1).Senyawa 3 (53 mg) dan 9 (6 mg) diperoleh dari subfraksi Fr-3-3
setelah pemisahan dengan HPLC, dengan perbandingan MeOH-H2O (8:2). Senyawa 10 (13,9 mg) yang
didapat dari Fr-3-5 direkristalisasi dengan menggunakan aseton-CHCl3. Fr-5 (0,9 g) dielusiadasi
menggunakan kolom gel Si dengan dengan perbandingan pelarut petroleum eter-aseton (10:1)
menghasilkan tiga komponen utama, yang masing-masing dimurnikan kembali dengan Sephadex LH-20
dengan perbandingan MeOH-CHCl3 (1:1) menghasilkan senyawa 7 (13,7 mg), 8 (7,6 mg), dan 11 (5.1
mg).

Uji toksisitas.
ujictoksisitas senyawa dilakukan pada tiga baris sel yaitu, sel leukemia manusia (K562), sel
nasopharynyeal tumor epidermoid manusia (KB), dan sel adenokarsinoma pada payudara manusia
(MCF-7). Efeknya terhadap kelangsungan hidup sel-sel diuji dengan metode colorometri MTT [3 - (4,5-
dimethylthiazol-2-il) -2,5-diphenyltetrazolium bromida. Secara singkatdapat dijelaskan bahwa, sel-sel
pada fase pertumbuhan eksponensial dikumpulkan dan dipindahkan ke 96-plat well. Setelah diinkubasi
selama 24 jam, senyawa diencerkan lalu dipindahkan ke dalam plat kultur dan diinkubasi kembali selama
48 jam. Larutan MTT kemudian ditambahkan ke dalam masing-masing plat kultur (0,1 mg / well). Setelah
inkubasi selama 4 jam, supernatant dibuang, Kristal yang terbentuk dilarutkan dalam 150 μL DMSO, dan
absorbansi diukur pada panjang gelombang 570 nm. konsentrasi dari IC50 digunakan sebagai senyawa
yang dapat menghambat pertumbuhan sel sebesar 50% dengan menggunakan MTT assay. Data yang
didapat dari tiga eksperimen dilakukan dengan tiga kali pengulangan dan dihitung nilai rata-ratanya
dengan memeperhatikan factor koreksinya( mean ± SD ).

Perkembangan Neurite Assay.

Sel PC12 dikembangkan dalam Dulbecco's yang dimodifikasi dalam Eagle medium (DMEM) yang
dilengkapi dengan 10% serum heatinactivated janin anak sapi (Cell Culture Laboratory, Cleveland, OH),
5% serum kuda (Invitrogen, Carlsbad, CA), penisilin (50 unit / mL) , dan streptomisin (50 μg / mL) di
tempatkan dalam inkubator pada suhu 37 ° C dengan 5% CO2. Sel PC-12 dikembangkan ke dalam 24-
well multiplat (1 × 104 sel / mL) dan dikultivasi selama sehari. Media diganti dengan media yang
mengandung senyawa yang akan diuji, kemudian sel PC-12 dikultivasi selama 2 hari dan dilakukan
pengamatan di bawah mikroskop phase-contrast.

Senyawa Cirri & sifat

9-Deacetylfumigaclavine C (1)
9-Deacetoxyfumigaclavine C (2)
Berbentuk putih, serbuk amorp, [R]D20 +11.3 (c 0.18, CHCl3);
UV (MeOH) λmax (log ε) 203 (4.3), 212 (4.0),228 (4.4), 252 (3.5),
282 (3.8); CD (MeOH) Δ_ ) 209 (-2.6), 217(-4.2), 232 (+9.2), 284
(-2.0); IR (KBr) νmax 3550, 3328, 3956, 2922, 2797, 1715, 1636,
1608, 1462, 1379, 1331, 1130, 1020, 914 cm-1; data 1H dan 13C
NMR pada Table 1; HRESIMS m/z 325.2268 ([M + H]+ calcd
for C21H29N2O 325.2274, Δ 1.8 ppm
Berbentuk putih, serbuk amorp, [R]D20-67.8 (c 0.11, CHCl3); UV
(MeOH) λmax (log ε) 203 (4.9), 226 (4.6), 252 (3.8), 281 (3.0); CD
(MeOH) Δ_ ) 219 (-8.1), 242 (+2.1); IR
(KBr) νmax 3237, 2962, 2941, 2850, 2785, 1716, 1638, 1606, 1462,
1375, 1329, 1231, 1042, 916, cm-1; data 1H and 13C NMR pada
Table 1; HRESIMS m/z 309.2320 ([M + H]+ calcd for C21H29N2
309.2325, Δ 1.6 ppm).