TEKNIK IMUNOKIMIA

Terminologi
Antigen Antibodi Tapak Ikatan Antibodi (Antibody-binding site) Determinan Antigen Spesifisitas Sampling Hapten Afinitas Teknik pengambilan dan penanganan spesimen

Metode & Teknik
Teknik Petanda Radioaktif Teknik Petanda Enzim Teknik Petanda Fluoresen
(petanda = label)

TEKNIK IMUNOKIMIA Reaksi Imunokimia Reaksi Antigen-Antibodi Competitive-Binding Reactions Teknik Label Radioaktif Radioimmunoassay [RIA] Immunoradiometric Assay [IRMA] Teknik Label Enzim Enzyme-Linked Immunosorbent Assay [ELISA] Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique [EMIT] Teknik Label Fluoresen Substrate-Labeled Fluorescent Immunoassay [SLFIA] Fluorescence Polarization Immunoassay [FPIA] .

Antibody-binding site = Bagian molekul antibodi yang dapat membentuk ikatan dengan antigen selama reaksi antigen-antibodi berlangsung. Determinan antigen = Bagian antigen yang dapat berikatan dengan antibody-binding site Spesifisitas reaksi antigen-antibodi = derajat pengikatan antibodi terhadap antigen tertentu (mis. Antigen = Senyawa (makromolekul) yang terikat pada satu atau lebih antibodi membentuk komplek Ag-Ab. homolog antigen) tanpa berikatan dengan molekul lain yang strukturnya sama. .Reaksi Antigen-Antibodi Imunogen = Makromolekul yang dpt memberikan respon imun dengan membentuk imunoglobulin (antibodi).

K = [Ab-Ag] / [Ab][Ag] = k1 / k2 k1 Ab + Ag Ab-Ag k2 .000 dalton. sebab ikatan non-kovalen antara antibodi dan antigen bersifat reversible. Afinitas ikatan suatu antibodi dinyatakan dengan Tetapan Kesetimbangan (K).Reaksi Antigen-Antibodi Hapten = Molekul bermassa rendah ( < 20. mis. obat ) yang berfungsi sebagai determinan antigen tunggal. Afinitas = Kekuatan ikatan antara determinan antigen (atau hapten) dengan suatu binding site dari antibodi tunggal.

Competitive Binding Reactions Prinsip : Pengikatan (spesifik) antigen terhadap antibodi adalah proporsional terhadap konsentrasi antigen dalam larutan baku (standard). . dan uji (sample). 2) Petanda antigen tidak mengganggu interaksi antigen-antibodi. Asumsi kondisi yang diharapkan : 1) Antigen dan antibodi homogen dan interaksi (kesetimbangan) bersifat reversible. Penyimpangan terhadap kondisi yang diharapkan tersebut tidak mengubah sifat umum reaksi imunokimia kompetitif. 3) Antigen dan antibodi hanya membentuk komplek bimolekuler (antigen dan antibodi bersifat univalen). 4) Komplek antigen-antibodi dapat dipisahkan sempurna dari bentuk bebas antigen berpetanda. pembanding (control).

Radioimmunoassay [RIA] Radioimmunoassay adalah teknik imunokimia menggunakan radioisotop untuk mendeteksi kuantitas antigen atau antibodi dalam spesimen cairan biologis. Teknik : ‡ Solid-phase attachment ‡ Activated charcoal separation method ‡ Precipitation technique . RIA merupakan immunoassay heterogen yang memerlukan tahap pemisahan secara fisik bentuk bebas antigen berpetanda dari bentuk lain antigen berpetanda yang terikat pada antibodi. berdasarkan pembentukan komplek Ag-Ab (endapan atau agregat tidak larut) yang dilakukan pada kondisi optimal. dilakukan sebelum pengukuran radioaktivitas petanda terikat.

Radioimmunoassay [RIA] Deteksi : Radioisotop (atom atau unsur yang mengalami peningkatan jumlah neutron dalam intinya sehingga ketidakstabilan inti akan berubah spontan kembali ke bentuk stabil dengan memancarkan radiasi). x x %B x x x Logit B/Bo x Log konsentrasi antigen Log konsentrasi antigen . Radionuklida adalah inti radioisotop tidak stabil yang dapat memancarkan radiasi : partikel alfa. sinar gamma. elektron positif/negatif.

Immunoradiometric Assay [IRMA] Immunoradiometric assay : metode untuk menentukan kadar antigen dalam spesimen cairan biologis menggunakan antibodi yang diberi petanda radionuklida. Antigen spesifik prostat. Teknik : ‡ Two-site solid-phase assay (sandwich technique) ‡ One-site fluid-phase assay Aplikasi : Protein serum. Kelebihan antibodi berpetanda menunjukkan antigen yang terdapat dalam larutan berdasarkan reaksi non-kompetitif. faktor koagulasi VIII. ferritin. ACP prostat. E-fetoprotein. . hCG urin dan hCG serum). carcinoembryonic antigen (CEA). IgE. hormon (TSH. prolaktin. hGH. thyroid-binding protein.

atau antibodi spesifik terhadap antibodi primer.000 dalton). digunakan untuk kuantisasi ligan berbobot mulekul besar (>30. EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique) : metode tanpa pemisahan dengan menggunakan petanda enzim terkonyugasi pada hapten disertai reaksi deteksi menggunakan perubahan substrat membentuk produk reaksi enzimatik. antibodi spesifik antigen tertentu. antigen.Enzyme immunoassay [EIA] ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Petanda enzim sebagai pengganti radioisotop untuk mengukur pembentukan komplek antigen-antibodi. umumnya untuk reaksi kompetitif. IEMA (immunoenzymetric assay) berdasarkan teknik sandwich untuk reaksi non-kompetitif. Petanda enzim terkonyugasi pada ligan. . ELISA menggunakan solid phase. mis.

Banyak digunakan untuk kuantisasi TDM.000 dalton). IgG dan IgM serum akibat infeksi virus. Banyak digunakan pada pengukuran kuantitatif obat pada TDM. FPIA (fluorescence polarization immunoassay) : metode tanpa pemisahan berdasarkan reaksi kompetitif untuk menentukan hapten berbobot molekul kecil (< 20.Teknik Petanda Fluoresen SLFIA (substrate-labeled fluoresent immunoassay) : metode tanpa pemisahan menggunakan petanda substrat fluorogen pada reaksi enzim-substrat untuk menentukan komplek antigen-antibodi. hormon. drug abuse. hormon. Dalam metode ini dipantau reaksi antara hapten dan antibodi menggunakan petanda fluoresen yang terkonyugasi pada suatu hapten. .

adenovirus. enzim.Teknik Petanda DNA Teknik hibridisasi asam nukleat digunakan pada pengukuran sampel atau spesimen kontrol yang membentuk hibrida untai-ganda (double stranded) stabil dari DNA atau RNA untai tunggal yang terdapat dalam spesimen. hepatitis B. berdasarkan keunikan deret basa DNA di dalam genom yang berbeda dari DNA inang (host). Chlamidya trachomatis. retrovirus HIV. yang berinteraksi dengan untai-tunggal DNA probe komplementer (sebagai molekul petanda). . untuk deteksi cepat dan spesifik jasad penyebab infeksi mis. bakteri atau virus. Contoh : Mycoplasma pneumoniae.l. herpes simplex. Untuk mendeteksinya DNA probe dikonyugasi dengan petanda (radioisotop. DNA probe digunakan a. fluoresen. cytomegalovirus. biotin) seperti pada immunoassay.

‡ Rendemen kuantik mendekati batas teoritis ‡ Pita emisi berdekatan ‡ Pergeseran Stockes lebar (270 nm:Eu. Tb) dg molekul organik F-diketon pembawa fluoresensi.TEKNIK PETANDA KELAT BERFLUORESENSI Pembentukan kompleks lantanida (Eu. . 200 nm:Tb) ‡ Panjang gelombang eksitasi dan emisi terdpt di luar daerah interferensi spesimen biologi ‡ Masa hidup fluoresensi 50-1000 Qdetik (jauh lebih lama dari fluorofor klasik.

TEKNIK PETANDA SUBSTRAT BERFLUORESENSI Fluoresensi hanya muncul setelah reaksi hidrolisis enzimatik terhadap senyawa bertanda. Ada 3 contoh kopel reaksi enzim : 1. Umbeliferon ± Esterase  F-galaktosil umbeliferon ± F-galaktosidase 3. Flavin Adenin Dinukleotid (FAD) ± Nukleotida pirofosfatase .

TEKNIK PETANDA LUMINISENSI KIMIA & BIOLUMNISENSI Terbentuk emisi sinar sebagai hasil reaksi kimia/enzimatik terhadap substrat molekul organik : luminol. Kelemahan : sifat hidrofob membatasi pemakaian untuk makromolekul seperti protein. turunan akridin. imidazol. . kecuali jika hapten ber-BM kecil akan terlarut setelah diberi petanda. dioksetan.