Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi

Plasmid Biner dengan Metode Tri Parental Mating

Construction and transformation of binary plasmid Cry 1Ab gene carrier using tri-
parental mating

Liberty1, M. Herman2, dan G.A. Watimena3

Key words : Cloning binary vector, Cry1Ab gene, transformation, tri parental mating.
Kata kunci : vektor cloning binary, gen Cry 1Ab, transformasi, persilangan tiga tetua.

Pengembangan Bioteknologi dan

Abstract
In order to develop seed borer resistant
soybean cultivar, the research to
construct and transform binary plasmid
Cry1Ab gene carrier into Agrobacterium
tumefaciens were done in Laboratorium
Biologi Molekuler dan Rekayasa
Genetika and in Laboratorium Fasilitas
Uji Terbatas Balai Besar dan
Pengembangan Bioteknologi dan
Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor
Indonesia from August 2003 to October
2004. The DNA cloning works were
including DNA restriction,
dephosphorilation, ligation,
transformation, and plasmid isolation.
Tri-parental mating method was used to
transform binary plasmid into A.
tumefaciens. 14.762 bp Cry1Ab gene
fragment were transformed in to E. coli.
Through tri-parental mating method, this
gene construction was successfully
introduced into A. tumefaciens.
Sari
Penelitian untuk mengkonstruksi plasmid
biner pembawa gen cry1Ab dan
mentransformasi plasmid biner tersebut
ke dalam Agrobacterium tumefaciens
dalam upaya merakit tanaman kedelai
tahan penggerek polong dilakukan di
Laboratorium Biologi Molekuler dan
Rekayasa Genetika dan di Laboratorium
Fasilitas Uji Terbatas Balai Besar dan
1) Universitas Islam Negeri Sunan Gunung
Djati Bandung
2) Balai Besar Bioteknologi dan Sumberdaya
Genetik Pertanian
3) Institut Pertanian Bogor
Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor
pada bulan Agustus 2003 hingga
Oktober 2004.
Kloning DNA pada vektor plasmid
meliputi kegiatan restriksi DNA,
defosforilasi, ligasi, transformasi, dan
isolasi plasmid. Transformasi plasmid
biner ke dalam A. tumefaciens dilakukan
dengan metode triparental mating.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa
transformasi E. coli dengan gen cry1Ab
telah berhasil dilakukan dan diketahui
ukuran fragmen gen cry1Ab yang
diperoleh adalah 14.762 bp. Konstruksi
gen cry1Ab berhasil diintroduksikan
kedalam A. tumefaciens dengan metode
triparental mating.
Pendahuluan
Tanaman kedelai merupakan salah satu
tanaman pangan penting di Indonesia
setelah padi dan jagung, yang hingga
saat ini masih perlu diimpor. Kebutuhan
kedelai Indonesia terus meningkat
sebesar 2.24 juta ton setiap tahunnya,
padahal kapasitas produksi kedelai
nasional hanya mencapai 1.19 juta ton
dari luas areal tanam 967.002 ha (Badan
Pusat Statistik, 2002).
Kendala dalam peningkatan produksi
tanaman kedelai adalah tingginya
serangan penyakit dan hama tanaman,
terutama hama penggerek polong
kedelai yang disebabkan oleh Etiella
zinkenella dari ordo Lepidoptera. Hama
ini merupakan hama penting tanaman

130 Zuriat, Vol. 19, No. 2, Juli-Desember 2008

kedelai yang hingga saat ini masih sulit
untuk diatasi, karena sifat
penyerangannya yang sulit dideteksi
secara cepat dari luar (Soekarno dan
Harnoto, 1985).
Penggunaan varietas kedelai tahan hama
penggerek polong merupakan cara yang
paling efektif, efisien, dan aman.
Namun, perakitan tanaman secara
konvensional masih menemukan
kendala, yaitu belum ditemukannya
sumber gen ketahanan di dalam plasma
nutfah kedelai yang ada saat ini.
Perakitan tanaman tahan dengan teknik
rekayasa genetik dapat dilakukan untuk
mengatasi masalah di atas. Teknologi
rekayasa genetik memberikan peluang
bagi pemulia tanaman untuk
memperoleh kelompok gen yang baru
dan lebih luas (Herman, 2002). Gen
yang ditransfer ke dalam genom
tanaman bisa berasal dari species lain
seperti, bakteri, virus, atau tanaman dari
jenis lain (Bennet, 1993).
Perakitan tanaman transgenik
melibatkan beberapa tahap dalam teknik
biologi molekuler dan seluler (Herman,
1996). Teknik rekayasa genetik yang
sering dipakai dan memberikan hasil
yang memuaskan adalah melalui
perakitan tanaman transgenik dengan
teknik transformasi. Menurut Sudarsono
(1994) teknik transformasi sangat
dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu
(1) tersedianya gen yang diinginkan, (2)
tersedianya cara untuk mentransfer dan
mengintegrasikan gen tersebut ke dalam
sel tanaman, dan (3) tersedianya cara
untuk meregenerasikan tanaman
transgenik untuk mengekspresikan gen
yang telah diintroduksikan tersebut.
Gen cry1Ab merupakan gen yang
mengkode Bt toksin dan terbukti efektif
mengatasi hama dari golongan
lepidoptera, sehingga dapat digunakan
untuk mengendalikan hama penggerek
polong kedelai. Gen cry1Ab tersebut
harus dikonstruksi dalam suatu vektor
Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner
plasmid untuk dapat ditransfer ke dalam
suatu tanaman. Plasmid yang digunakan
untuk transformasi tanaman tidak hanya
menggunakan gen dari karakter yang
diinginkan, tetapi juga gen marka untuk
seleksinya..
Konstruksi plasmid dan metode transfer
yang tepat merupakan salah satu faktor
penetu keberhasilan perakitan tanaman
transgenik. Dalam penelitian ini
dilakukan konstruksi plasmid biner
untuk mengatasi sulitnya menemukan
sisi pemotongan yang unik dengan
enzim restriksi pada plasmid Ti yang
sangat besar (Loedin et al. 1998).
Transformasi plasmid biner ke dalam A.
tumefaciens dilakukan dengan metode
triparental mating.
Bahan dan Metode
Penelitian dilakukan pada bulan
Agustus 2003 hingga Oktober 2004 di
Laboratorium Biologi Molekuler dan
Rekayasa Genetik Balai Besar
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
Pertanian (BB-Biogen) Bogor.
Bahan yang digunakan dalam percobaan
ini adalah dua macam plasmid, yaitu
pSBB (pembawa gen cry1Ab yang
dikendalikan oleh promotor 35S CaMV
dan terminator nos) dan pCambia 1301
(pembawa gen penyeleksi bakteri kanR,
penyeleksi tanaman hph, gen gus, dan
multiple cloning site pada T-DNA),
serta Agrobacterium tumefaciens strain
LBA 4404 (koleksi Balai Penelitian
Perkebunan (Balitbun) Bogor.
Kloning DNA pada vektor plasmid
meliputi kegiatan restriksi DNA,
defosforilasi, ligasi, transformasi, dan
isolasi plasmid (Sambrook et. al 1989).
Restriksi plasmid pSBB dan pCambia
1301 dilakukan dengan menggunakan
enzim HindIII. Defosforilasi dilakukan
dengan metode calf intenstinal akaline
phaspatase (CIP) terhadap vektor
pCambia yg sudah dipotong dan diligasi
131
dengan fragmen cry1Ab mengikuti
metode GibcoBRL.
Transformasi plasmid ke dalam E. coli
DH5α dilakukan dengan metode kejutan
panas dan isolasi DNA plasmid dari
kultur cair bakteri dilakukan dengan
metode lisis alkalis mengikuti metode
Sambrook et al. (1989). Transformasi
gen cry1Ab ke dalam A. tumefaciens
LBA 4404 dilakukan dengan metode
triparental mating mengikuti metoda
yang dikemukakan oleh Ditta et al.
(1980). Konfirmasi hasil integrasi gen
cry1Ab ke dalam A. tumefaciens
dilakukan dengan teknik PCR dengan
menggunakan primer spesifik untuk gen
cry1Ab. Primer yang digunakan adalah :
5’-CGA CAT CTC CTT GTC CTT
GAC AC-3’ dan 5’-ACA CCC TGA
CCT AGT TGA GCA AC-3’.
Hasil dan Pembahasan
Konstruksi plasmid biner diawali
dengan pemotongan dua plasmid
(pCambia 1301 dan pSBB)
menggunakan enzim restriksi HindIII.
Berdasarkan peta plasmid, pSBB
memiliki gen cry1Ab yang lengkap
dengan promotor dan terminatornya
berada di antara dua sisi enzim restriksi
HindIII tersebut.
Hasil pemotongan pada plasmid
pCambia 1301 dengan enzim restriksi
Gambar 1. Pola restriksi pCambia 1301 dan pSBB
M = Marka, 1 =pCambia 1301, 2 = pCambia 1301+HindIII, 3 = pSBB dan HindIII, 4 =
pSBB diencerkan 10 x, 5 = pSBB, dan λ = 50 ng/µl, a = pCambia ukuran 11.837 kb, b
= gen cry1Ab ukuran 2.935 kb, c = PGEM-4z ukuran 2.74 kb.
132 Zuriat, Vol. 19, No. 2, Juli-Desember 2008
HindIII diperoleh satu fragmen
berukuran 11.837 kb dan pada plasmid
pSBB diperoleh dua fragmen berukuran
2.925 kb (fragmen gen cry1Ab) dan
2.74 kb (Gambar 1). Pemotongan
plasmid pSBB dengan enzim HindIII
bertujuan untuk memisahkan fragment
gen cry1Ab dari vektor awalnya
(pSBB). Ukuran fragmen-fragmen yang
diperoleh tersebut sesuai dengan ukuran
fragmen insersi pada peta plasmid yang
dikeluarkan oleh Cambia Co. Australia.
Fragmen gen cry1Ab dan pCambia
1301 selanjutnya dielusi dari gel
agarose untuk digunakan pada proses
ligasi. Defosforilasi merupakan tahap
yang paling penting dan dilakukan
sebelum ligasi. Defosforilasi dapat
mengurangi terbentuknya hasil ligasi
sendiri. Proses defosforilasi pada
umumnya dilakukan dengan
menggunakan enzim akaline fosfatase
seperti calf intestinal phasphatase
(CIP). CIP sendiri merupakan
glikoprotein yang berfungsi untuk
memindahkan ikatan 5’-phasphatase
dari DNA linear (Sambrook et al.
1989). Proses defosforilasi ini dilakukan
pada pCambia 1301 dan berfungsi untuk
mencegah tersambungnya kembali
fragmen tersebut. Penyambungan
kembali fragmen dapat menghambat
penyisipan gen cry1Ab pada plasmid
biner.
Hasil penyambungan gen cry1Ab
dengan fragmen pcambia 1301 (plasmid
biner modifikasi) menggunakan enzim
T4 DNA ligase diintroduksi dengan
proses transformasi kedalam bakteri E.
coli (sel kompeten DH5α) dan
ditumbuhkan pada media LB
padat+kanR selama 16 jam pada suhu
37oC. Koloni-koloni yang terbentuk dari
masing-masing perlakuan (Gambar 2)
mengindikasikan keberhasilan
konstruksi plasmid rekombinan yang
telah membawa gen cry1Ab di bawah
kontrol promotor 35S CaMV.

Gambar 2. Koloni bakteri hasil transformasi ke dalam E. Coli

1 = Plasmid rekombinan ulangan 1, 2 = Plasmid rekombinan ulangan 2,
3 = Plasmid rekombinan ulangan 3

Dari koloni-koloni yang terbentuk dapat dengan fragmen gen cry1Ab

diketahui bahwa konstruksi plasmid
rekombinan dilakukan dengan
menyisipkan gen cry1Ab di bawah
kontrol promotor 35S CaMV ke dalam
plasmid vektor pCambia 1301. Proses
ligasi antara DNA vektor pCambia 1301
menghasilkan plasmid rekombinan
pCambia-cry1Ab berukuran 14.762 bp
(Gambar 3) yang merupakan gabungan
dari vektor pCambia 11.837 bp dan
fragmen cry1Ab 2.935 bp.

Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 133
 Gambar 3. Peta plasmid rekombinan pCambia-cry1Ab

DNA rekombinan yang diperoleh koloni replika menggunakan enzim

kemudian ditransformasikan kedalam HindIII.
sel kompeten E. coli melalui metode
Berdasarkan hasil restriksi terhadap
kejutan panas. Transformasi ke dalam
DNA rekombinan yang berasal dari
sel E. coli bertujuan untuk
koloni 1.3 dan 3.2 terdapat dua fragmen
memperbanyak plasmid rekombinan.
berukuran 11.,837 bp dan 2.925 bp
Verifikasi terhadap E. coli yang
(gambar 4) dimana fragmen pertama
mengandung plasmid biner (pCambia
merupakan ukuran dari plasmid vektor
dengan fragmen gen cry1Ab) dilakukan
pCambia 1301 dan fragmen kedua
dengan cara uji pola restriksi
merupakan ukuran dari promotor 35S
menggunakan enzim restriksi terhadap
CaMV (800 bp), gen cry1Ab (1.845)
delapan sampel DNA plasmid dari
dan terminator nos (280 bp). Dugaan
koloni replika. Pada tahap awal
awal dari kedua plasmid ini adalah
dilakukan deteksi pola plasmid
pCambia 1301 yang telah tersisipi
rekombinan melalui pemotongan
fragmen gen cry1Ab.
delapan sampel DNA plasmid dari

134 Zuriat, Vol. 19, No. 2, Juli-Desember 2008

Gambar 4. hasil restriksi plasmid rekombinan dengan HindIII
M = Marka, 1 =pCambia 1301, 2 = pCambia 1301+HindIII, 3 = cry1Ab, A = Koloni 1.1,
B = Koloni 1.2, C = Koloni 1.3, D = Koloni 2.1, E = Koloni 2.2, F = Koloni 2.3, G =
Koloni 3.1, H = Koloni 3.2, λ1 = 100 ng/µl, λ2 = 200 ng/µl, λ3 = 300 ng/µl, a = fragmen
berukuran 2.925 kb, b = fragmen berukuran 2.925 kb

Tahap kedua dilakukan kembali deteksi koloni yang berasal replika 3.5 yang
pola plasmid rekombinan melalui diperkirakan rekombinan. Selanjutnya
pemotongan empat sampel DNA DNA plasmid dari koloni 3.2 dan 3.5
plasmid dari koloni replika dipotong dengan enzim BamHI+EcoRI.
menggunakan enzim hindIII. Hasil pemotongan dengan enzim
Berdasarkan hasil restriksi tersebut dapat dilihat pada Gambar 5.
menggunakan enzim tersebut hanya

Gambar 5. Hasil restriksi plasmid rekombinan dengan enzim BamHI+EcoRI

M = Marka, 1 = 3.5+BamHI+EcoRI, 2 = 3.5+EcoRI, 3 = 3.5+HindIII, 4 =
3.2+BamHI+EcoRI, 5 = 3.2+EcoRI, 6 = 3.2+HindIII

Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 135
Berdasarkan pola restriksi
menggunakan enzim EcoRI+BamHI
plasmid rekombinan 3.2 mempunyai
empat fragmen berukuran 1845 bp, 280
bp, 37 bp, dan 12.600 bp. Hal yang
sama juga dilakukan pada plasmid
rekombinan 3.5 dan diperoleh empat
fragmen berukuran 1845 bp, 830 bp,
280 bp, dan 11.807 bp. Dari hasil
pemotongan menggunakan enzim
restriksi diperoleh dua versi penyisipan
gen cry1Ab dalam vektor pCambia
1301, yang disebabkan karena kedua
ujung DNA baik vektor maupun gen
sisipan mempunyai sekuen pengenal
yang sama (HindIII). Perbedaan pada
posisi ini disebabkan karena arah
ekspresi gen cry1Ab. Pada gen cry1Ab1
posisinya searah dengan jarum jam,
sedangkan pada gen cry1Ab2 posisinya
berlawanan dengan arah jarum jam. Hal
ini menunjukkan bahwa plasmid
pCambia-cry1Ab1 dan pCambia-
cry1Ab2 memiliki pola restriksi seperti
yang diharapkan. Plasmid yang
mempunyai pola restriksi seperti yang
diharapkan dapat digunakan untuk
transformasi ke dalam A. tumefaciens
(Gambar 5).
Transformasi bakteri E. coli DH5α
dengan gen cry1Ab yang terdapat dalam
plasmid pCambia 1301 telah berhasil
dilakukan. Keberhasilan transformasi ini
dapat dilihat dari transforman E. coli
DH5α yang tumbuh pada media seleksi
yang mengandung 50 mg/ l kanamisin.
Kemampuan tumbuh pada media seleksi
dikarenakan adanya gen nptII
(neomycine phosphotransferase)
penyandi ketahanan terhadap antibiotik
kanamisin pada plasmid pCambia 1301.
Keberhasilan transformasi ke dalam E.
coli DH5α ini dilakukan pengujian
136 Zuriat, Vol. 19, No. 2, Juli-Desember 2008
dengan menggunakan enzim-enzim
restriksi.
Plasmid rekombinan yang telah dicek
pola restriksinya ditransformasikan ke
dalam A. tumefaciens LBA 4404
melalui metode triparental mating.
Proses ini menggunakan tiga tetua, yaitu
A. tumefaciens LBA 4404, E. coli HB
101, dan E. coli DH5α yang
mengandung plasmid rekombinan yang
ditumbuhkan dalam media seleksi
LB+50 mg/ l kanamisin+25 mg/ l
rimpafisin untuk menyeleksi bakteri-
bakteri donor.
Proses triparental mating telah berhasil
mengintroduksikan plasmid pCambia-
cry1Ab ke dalam A. tumefaciens LBA
4404 (Gambar 6). Plasmid pCambia-
cry1Ab yang terdapat pada E. coli
DH5α hasil transformasi (sebagai
donor) dipindahkan ke dalam A.
tumefaciens LBA 4404 (sebagai
resipien) melalui konjugasi dengan
bantuan E. coli HB 101 (pRK 2013)
yang resisten terhadap antibiotik
kanamisin, rentan terhadap antibiotik
rimpafisin dan resipien A. tumefaciens
LBA 4404 resisten terhadap rimpafisin
dan rentan terhadap kanamisin. Bakteri
yang mampu tumbuh pada media seleksi
ini hanya A. tumefaciens LBA 4404
yang telah mengandung plasmid
pCambia-cry1Ab hasil triparental
mating (resisten terhadap kanamisin dan
rimpafisin).
Hasil transformasi tersebut ditandai
dengan munculnya koloni pada media
seleksi. Koloni yang tumbuh pada
media seleksi selanjutnya di uji PCR
untuk membuktikan bahwa fragmen gen
cry1Ab telah masuk ke dalam A.
tumefaciens.
Gambar 6. Transformasi triparental mating ke dalam A.tTumefaciens
a. E. coli rekombinan, b. Plasmid helper PRK2013, c. A. tumefaciens LBA 4404, d.
Perkawinan dengan triparental mating, e. Triparental dalam media seleksi

Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 137
Analisis PCR merupakan metode
deteksi secara cepat untuk mengetahui
keberadaan transgen di dalam jaringan
tanaman putatif trangenik. Reaksi
amplifikasi dilakukan berdasarkan
metode Wang et al. (1993) yang
dimodifikasi dengan menggunakan mesi
PCR MJ Research PCT-100.
Keberadaan gen cry1Ab diindikasikan
dengan produk PCR berukuran 100 bp.
Gambar 7. Hasil PCR triparental mating
M = Marka, 1 = triparental 3.2, 2 = triparental 3.%, 3 = plasmid 3.2, 4 = plasmid 3.5,
dan 5 = kontrol
Kesimpulan
Berdasarkan uji pola restriksi,
transformasi E. coli dengan gen cry1Ab
telah berhasil dilakukan dan diketahui
ukuran fragmen gen cry1Ab yang
diperoleh adalah 14.762 bp. Konstruksi
gen cry1Ab berhasil diintroduksikan
kedalam A. tumefaciens dengan metode
triparental mating.
Daftar Pustaka
Badan Pusat Statistik. 2002. Statistika
Indonesia.Statistical Year Book of
Indonesia. Jakarta. Indonesia.
138 Zuriat, Vol. 19, No. 2, Juli-Desember 2008
Hasil analisis PCR menunjukkan bahwa
koloni dari triparental mating 3.2 dan
3.5 positif membawa gen cry1Ab
(Gambar 7). Hal ini menunjukkan
bahwa A. tumefaciens telah membawa
gen cry1Ab dan dapat
ditransformasikan ke dalam genom
tanaman.
Bennet, J. 1993. Genese for crop
improvement. Genetic
Engineering. 16 : 93-113.
Ditta, G.S., D. Stanfield, Corbin, D.R.
Helinski. 1980. Broad host range
DNA cloning system for gram
negative bacteria : construction of
a gene bank of Rhizobium meliloti.
Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 77 :
7344-7351.
Herman. 1996. Rekayasa genetik untuk
perbaikan tanaman. Buletin
AgroBio. 1(1) : 24-34.
Sambrook, JEF Fritsch, and T.
maniatis. 1989. Molecular Cloning
A laboratory Manual (2nd ed.).
 Cold Spring Harbor Laboratory Sudarsono. 1994. Penggunaan protein
press. New York. USA. pembungkus (coat protein) dari
pathogen virus dan rekayasa
Soekarno, D. dan Harnoto. 1985.
genetik untuk memperoleh
Pengendalian Hama Kedelai.
tanaman unggul tahan virus. JIPI.
Dalam S. Somaatmadja,
4(2) : 34-39
Mismunadji, Sumarno, Mahyudi
Syam, S.O. Manurung, dan Wang K., 1995. Seeds. Slater. Iowa.
Yaswadi. Kedelai. Puslitbangtan. USA.
Badan Litbang Pertanian. Halaman
: 310-330.

Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 139