Isolasi Plasmid, Quantifikasi DNA dan Analisis Kualitatif,

Elektroforesis
Escharichia coli merupakan salah satu contoh bakteri yang digunakan pada percobaan isolasi
plasmid ini. Bakteri ini sering digunakan dalam transformasi gen dan lebih dikenal dengan istilah
kloning gen. Selain dalam bakteri, plasmid juga terdapat dalam Saccharomyces cerevisiae. Dalam
teknik rekayasa genetika, plasmid biasanya digunakan sebagai vektor untuk kloning. Plasmid dapat
dipindahkan antar sel bakteri dengan cara konjugasi atau transformasi. Dalam hal ini, plasmid
digunakan sebagai pembawa fragmen DNA asing. Dengan kata lain, plasmid dikombinasikan
dengan DNA asing sehingga untuk mengetahuinya dilakukan beberapa percobaan.
Pada saat percobaan terdapat beberapa larutan yang dipakai untuk mengisolasi plasmid sampai
elektroforesis. Proses isolasi plasmid, endapan bakteri disuspensi menggunakan larutan EDTA. Hal
ini disebabkan larutan EDTA berfungsi sebagai larutan buffer dan sebagai pengkelat yang dapat
mengikat ikatan kation sehingga dapat menurunkan tegangan. Endapan yang telah tersuspensi diberi
larutan NaOH dan SDS. Tujuan pemberian larutan ini untuk melisiskan bakteri dan menaikkan
pHnya. Setelah lisis bakteri diberi larutan sodium asetat yang berfungsi untuk menetralisasi serta
menurunkan pH. Selain ketiga larutan tersebut, cairan DNA plasmid diekstrak dengan larutan PCI
(Fenol/Kloroform/Isoamil alcohol) dan diberi etanol 70% untuk menghilangkan kandungan
garamnya. Pada proses elektroforesis, DNA yang akan dimigrasikan dicampur dengan larutan
loading dye dan blue bromophenol. Hal ini untuk menandai laju migrasi DNA dan sebagai larutan
pewarna.
Ukuran DNA dapat dilihat dari jarak pita yang muncul pada sumur ketika dielektroforesis.
Kerusakan DNA ditandai oleh pita smear pada hasil elektroforesis. Tidak dapatnya DNA dipotong
dengan enzim restriksi terlihat dari terbentuk tidaknya pita smear hasil elektroforesis setelah DNA
dipotong dengan enzim restriksi EcoRI. EcoRI menghasilkan pita DNA smear ketika
dielektroforesis karena enzim ini termasuk ke dalam frequent cutter (Vos et al. 1995). Hasil
percobaan kelompok 3 dan kelompok 9 menunjukkan bahwa hasil pemotong DNA nya tidak
berhasil karena pita DNA hasil elektriforesis tidak terbentuk. Berdasarkan teori diatas, hal ini terjadi
karena DNA tidak dapat dipotong dengan enzim restriksi EcoRI. Pada kelomok 6, pita DNA yang
terbentuk tampak tidak jelas dan membentuk suatu garis vertikal yang berpendar. Hal ini
kemungkinan cairan DNA yang akan dielektroforesis kotor sehingga pada saat migrasi kotorannya
ikut masuk dan membentuk garis vertikal. Sedangkan pita DNA kelompok lainnya menunjukkan
hasil yang baik.
Untuk melihat uji kualitas DNA genom dapat dilihat dari besarnya ukuran pita yang ditandai
dengan terlihatnya pita yang menyala terang hasil elektroforesis. Dari hasil gambar terlihat pita
yang menyala terang dan berukuran besar ditunjukkan oleh kelompok 8, sedangkan pita pada
kelompok lain menghasilkan gambar yang sama. Pada hasil uji analisis kuantitas dan kualitas DNA
dengan menggunakan spektrofotometer menunjukkan bahwa kemurnian DNA tidak mencapai
hingga 100%. Hal ini karena rasio A260/A280 berkisar berkisar 1.10-1.18, sedangkan menurut
literatur yang diperoleh kemurnaian DNA akan tercapai 100% bila rasio A260/A280 berkisar 1.8-2.0
(Sambrook et al. 1989). Dengan demikian kemurnain DNA hasil percobaan ini dapat dikatakan
tidak berhasil karena kisaran kemurnian DNA yang dihasilkan tidak memenuhi syarat, yaitu
berkisar 1.10-1.18.
Visualisasi elektroforesis pada tingkat konsentrasi dapat dilihat dari tebal tidaknya pita yang
terbentuk. Semakin tinggi konsentrasi DNA, maka semakin tebal pita yang dihasilkan, dan semakin
rendah konsentrasi DNA akan semakin tipis pita yang terbentuk. Hasil percobaan menunjukkan,
nilai konsentrasi DNA yang paling tinggi terdapat pada kelompok 1 sebesar 19800 ng/ μl. Namun
dengan demikian, hasil percobaan ini dapat dikatakan berhasil karena pita DNA yang terbentuk
mencapai 75%.
http://sril07.student.ipb.ac.id/2010/06/19/isolasi-plasmid-quantifikasi-dna-dan-analisis-kualitatif-
elektroforesis/

ISOLASI PLASMID, SPEKTROFOTOMETRI, dan ELEKTROFORESIS

Pendahuluan
Latar belakang
Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang
terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri dan sel eukariotik tingkat rendah . DNA
plasmid berukuran lebih kecil dari DNA kromosom dan dapat bereplikasi sendiri. Plasmid biasanya
digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan E. coli sebagai host, sehingga dalam
rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu
yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan
mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim
(Stanfield 1996). Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki
tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning, yaitu, replication origin, marker yang
memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten antibiotik) dan region yang mampu
disisipi oleh fragmen DNA dari luar (Lodish et al).
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan ukuran
(berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Posisi molekul yang terpisah pada gel dapat
dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan
densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah
terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan
agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk pemisahan protein dan asam
nukleat (DNA). Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan
bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis
untuk memisahkan molekulmolekul berdasarkan muatannya. Molekul DNA bermuatan negatif
sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif . Makin
besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA
dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen
molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya ( ).
Spektrofotometri sinar UV digunakan untuk mengukur tingkat kemurnian DNA hasil isolasi.
Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada absorpsi radiasi elektromagnet.
Keuntungan utama pemilihan metode spektrofotometri bahwa metode ini memberikan metode
sangat sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang sangat kecil.
Tujuan
Mengetahui dan Mengisolasi plasmid untuk vektor kloning. Mengetahui dan dapat menghitung
konsentrasi DNA/ RNAdengan spektrofotometri; dapat menganalisa kualitas DNA/RNA, dan
mengetahui cara mendeteksi DNA dengan gel agarose.
Hasil Pengamatan
Tabel 1 hasil spektrofotometri plasmid
Panjang gelombang (λ) Konsentrasi (ng/µl) Kemurnian
Kelompok Teori Teori
230 260 280 Aktual (hitungan) Aktual (hitungan)
1 1,538 2,002 1,287 20020 15015 1,096 1,555556
2 1,511 1,978 1,740 19780 14835 1,137 1,136782
3 1,501 1,971 1,731 19710 14782,5 1,139 1,138648
4 1,507 1,671 1,668 19710 12532.5 1,182 1,001799
5 1,494 1,965 1,693 19650 14737,5 1,161 1,160662
6 1,500 1,979 1,790 19790 14842,5 1,106 1,105587
7 1,532 1,991 1,803 19910 14932,5 1,104 1,104271
8 1,512 1,995 1,821 19950 13657,5 1,096 1,095552
9 1,495 1,972 1,811 19720 14790 1,089 1,088901
10 1,547 2,011 1,872 20110 15082,5 1,072 1,074252
Contoh perhitungan:
Kelompok 1
Konsentrasi DNA
Diketahui: λ260 = 2,002 Å
Konstanta DNA = 50 mg/ml
Faktor pngenceran(FP) = 150
FP= 1500 ml
10 ml
[DNA] = λ260 x konstanta DNA x FP
= 2,002 Å x 50 mg/ml x 150 ml
= 15015
Kemurnian DNA
Diketahui: λ260 = 2,002 Å
λ280 = 1,287 Å
Kemurnian DNA = λ260 / λ280
= 2,002 Å / 1,287 Å
= 1,555556 Å
Contoh perhitungan
Kelompok 1
Ukuran DNA total
Diketahui: Ukuran marker 1 = 10 ng Pita 1= dekat ke marker 3 = 50 ng
Ukuran marker 2 = 30 ng Pita 2 = lebih besar dari marker 3 = 100 ng
Ukuran marker 3 = 50 ng
Ukuran DNA total = pita1 + pita 2
10 µl
= 50 ng + 100ng
10 µl
= 15 ng/µl
Pembahasan
Keberhasilan isolasi DNA plasmid dapat diketahui dengan cara spektrofotometri dan elektroforesis.
Dengan spektrifotometri tingkat kemurnian DNA dapat diukur. Dengan elektroforesis ukuran DNA
dapat diketahui dengan membandingkannya dengan DNA marker yang sudah diketahui
konsentrasinya. Berdasarkan hasil spektrofotometer nilai kemurnian tertinggi yaitu kelompok 1
dengan nilai 1,555556. Sementara konsentrasi tertinggi yaitu kelompok 10 dengan nilai konsentrasi
20110. Berdasarkan hasil pengamatan secara umum isolasi DNA plasmid berhasil dilihat dari pita-
pita DNA yang terbentuk pada elektroforesis. Berdasarkan data kelompok 1 dan kelompok 4 ada
perbedaan antara nilai kemurnian aktual dan kemurnian teori, sementara kelompok lainnya nilai
kemurnian aktual merupakan pembulatan nilai kemurnian teori atau hitungan secara manual.
Tingginya kemurnian DNA data kelompok 1 disebabkan selisih yang cukup jauh antara panjang
gelombang 260Å dan 280Å. Konsentrasi dan kemurnian aktual merupakan nilai yang tertera saat
proses spektrofotometri. Konsentrasi dan kemurnian teori adalah hasil hitungan manual.
Secara umum hasil pengamatan isolasi DNA plasmid dengan elektroforesis berhasil, dilihat dari
pita-pita DNA yang terbentuk pada elektroforesis. Hampir semua kelompok terbentuk pita-pita
DNA hasil isolasi pada sumur-sumur gel agarose, kecuali dua kelompok yaitu kelompok pada
sumur keempat dan sumur kesembilan. Pita-pita DNA tidak terbentuk seperti seharusnya, ada
beberapa kemungkinan yang menyebabkan hal tersebut dapat terjadi diantaranya DNA dimasukan
dalam sumur dengan tidak hati-hati sehingga DNA hilang karena larut. Pita-pita DNA yang
terbentuk seharusnya terdiri atas 4 pita yaitu, open circular, linear, circular dan supercoiled. Setiap
DNA tersebut mempunyai bentuk berbeda-beda sehingga kecepatan migrasinyapun berbeda. Hal
tersebut menyebabkan letak DNA tersebut berurutan sesuai dengan kecepatan laju migrasinya. DNA
supercoiled memiliki bentuk yang membuatnya fleksibel untuk bergerak.
Hasil spektrofotometri kelompok kami memiliki nilai kemurnian yang tinggi, nilai konsentrasinya
juga tinggi sebanding dengan nilai kemurniannya. Nilai kemurnian yang baik yaitu ≥ 1,8. Nilai
kemurnian suatu bahan ditentukan dengan nisbah A260/280 yang menyatakan kualitas DNA
tersebut. Selain kemurnian, keutuhan (integritas) DNA juga merupakan parameter lainnya yang
sering digunakan dalam pengujian kualitas DNA (Isda 2008). Sementara untuk elektroforesis pita-
pita DNA terbentuk membuktikan bahwa isolasi plasmid berhasil. Pita DNA yang terbentuk
berjumlah 2 dengan ukuran yang cukup besar. Berdasarkan hasil hitungan ukuran total DNA yang
didapat kira 15ng/ml.
Simpulan
Secara umum proses isolasi DNA plasmid berhasil. Pada pengamatan elektroforesis hampir semua
sumur pada elektroforesis membentuk pita-pita DNA. Nilai kemurnian DNA secara umum kecil
karena tidak mencapai 1,8 yang merupakan nilai kemurnian yang baik.
Daftar Pustaka
Anonim, 1979. Farmakope Indonesia Ed. III. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.
Anonim. 2009. Elektroforesis Protein. http://inherent.brawijaya.ac.id/biomol/materi/Lecture14.pdf
Anonim. 2010. Elektroforesis.
http://www1.qiagen.com/literature/qiagennews/0100/Practical_Hints.pdf
Isda N M, Musliar Kasim, Mansyurdin. 2008. Kloning dan karakterisasi gen penyandi inhibitor
proteinase dari kulit buah kakao. Menara Perkebunan 76(2): 83-92
Lodish. Berk. Matsudaira. Kaiser. Krieger. Scott. Zipursky. Darnell. Molecular Cell Biology fifth
Edition.
Stanfield WD, Jaime SC, Raul JC. 1996. Molecular and Cell Biology. New York: Mc Graw-Hill.
Tjahjoleksono A. 2009. Plasmid.
http://web.ipb.ac.id/tpb/files/materi/genetika/dnarekombinan/plasmid.pdf
Posted in Academic

http://susanai07.student.ipb.ac.id/2010/06/18/isolasi-plasmid-elektroforesis-spektrofotometri/
isolasi plasmid metode LISIS ALKALI
berikut merupakan prosedur isolasi plasmid yang biasa dilakukan dalam praktikum genetika di Lab
Genetika Fabio Unsud. beserta penjelasannya. for begginer

PEMANENAN SEL
tahap satu ini ditujukan untuk mendapatkan pelet sel yang terpisah dari media pertumbuhannya.
# PELEPASAN PLASMID DARI SEL
setelah diberi Lar II, maka seharusnya terdapat lendir pada tutup tube (jika dibuka); Lar I, II, III
diusahakan dingin.; setelah diberi Lar III, biasanya akan ada gumpalan putih.
STE (Sodium Tris EDTA) berfungsi sebagai pencuci sel dari media dan bahan lain. saat sel
dicampur dengan Lar I, maka tris-EDTA dapat mengikat Mg 2+ dan Ca2+ --> mendestabilisasi
membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan menghambat DNAse. sedangkan
glukosa dari Lar I akan mencegah buffer (tris) merusak sel dan membuat lingkungan hiperosmotik.

SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) dari

Lar II dapat melubangi membran sel
karena SDS adalah salah satu jenis
deterjen yang mampu mengikat
(menyelimuti)protein membran
sehingga terpisah dari bilayer lipid. NaOH akan memecahkan dinding sel dan juga mendenaturasi
DNA kromosom sehingga tampak lebih kusut. plasmid juga terdenaturasi, namun yang
membedakan adalah ukurannya, plasmid mudah untuk renaturasi. plasmid dan RNA akan keluar
dari pori-pori membran tapi DNA kromosom masih tetap di dalam sel karena terlalu besar untuk
keluar.
KAc (Kalium Acetic) (asam) akan menetralkan NaOH sehingga plasmid dapat terenaturasi
PEMISAHAN DAN PEMEKATAN PLASMID

# jika etanol tidak kering, maka dapat mengganggu kerja enzim dan tidak mengendapkan DNA saat
dielektroforesis.
penambahan Na Asetat membuat
konsentrasi garam tinggi dan single
stranded RNA tidak bisa larut pada
keadaan tersebut. etamol absolut
dingin --> mengendapkan DNA
plasmid dan juga untuk membilas
dan mencuci plasmid. bagaimana bisa etanol mempresipitasi DNA? : penambahan garam berfungsi
sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan
menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion +
(Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (ingat air
memiliki 2 muatan +pada H dan - pada O). atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang
tinggi. fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik
tsb. atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah
terpresipitasi. mungkin ilustrasi di bawah ini dapat membantu membayangkan................

kira2 yang terjadi di dalam tube ......

etanol 70% --> membersihkan lagi dan lebih memekatkan plasmid

hasil setelah dielektroforesis.

referensi : referensi utama adalah

Sambrook et.al. (1989), tapi masih
ditambah beberapa sumber dari internet
untuk penjelasan mekanismenya (maap
lupa webnya :P), saran dosen dan
pengalaman. mohon kritik dan sarannya.

jika gambar tidak jelas, mohon diklik

gambarnya
Pradhika, E.I. 2008
http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/isolasi-plasmid-metode-lisis-alkali.html
Prinsip dasar isolasi plasmid
Metode isolasi DNA dari bakteri (plasmid) ini biasanya sering kita sebut miniprep yang singkatan
dari mini-preparation. Ada pula yang mengatakan medi-prep. Apakah bedanya? Mini-prep maupun
medi-prep sebenarnya metode yang digunakan sama, tetapi hanya jumlahnya volume saja yang
beda. Kalau yang mini-prep small scale isolation of plasmid, sedangkan medi-prep adalah large-
scale isolation of plasmid.
Yang saya akan tulis di sini adalah prinsip dasar isolasi DNA yang saya ambil dari Sambrook (buku
Molecular Cloning). Isolasi DNA, bisa dengan cara manual (seperti yang saya tulis ini) dan bisa
dengan menggunakan KIT. Menggunakan KIT, kita semua tahu bahwa akan memakan waktu yang
lebih cepat dari yang manual, tapi akan lebih mahal karena buatan company. Tetapi sebenarnya
prinsip dasar isolasi plasmid dengan KIT tersebut diambil dari buku Molecular Cloning ~
Sambrook.
Prinsipnya adalah pertama setelah kita kultur bakteri (biasanya menggunakan E.coli) selama
semalam, kita sentrifuge yang gunanya adalah kita hanya mengambil kulturnya dan menghilangkan
medium-nya. Setelahnya kita treatment dengan pemberian solution I, II, dan III. Solution ini
semuanya adalah lysis buffer. Pada solution I kita bisa melihat komposisinya adalah glucose yang
konsentrasinya tinggi. Seperti pada prinsip difusi-osmosis, jika ada larutan yang konsentrasi tinggi
masuk dalam sel, dengan sendirinya membran sel akan rusak. Kemudian pemberian solution II yang
harus fresh (NaOH dan SDS). Solution II ini kita menggunakan NaOH sebagai alkali, yang
berfungsi merusak membran sel. Dan dalam step ini perlu kita ingat bahwa kita tidak boleh mem-
vortex pada saat mix. Kalau kita vortex, semua akan hancur termasuk DNA-nya (NaOH adalah
alkali kuat). solutiom NaOH dan SDS tidak untuk di-autoclaved maupun on ice, karena ada SDS-
nya. SDS di sini adalah sabun yang juga untuk menghancurkan membran sel. Jadi bisa dilihat
bahwa apalabila kita membuka tutup tube (pada saat akan memasukkan solution III), ada lendir-
lendir di mulut tube. Itu menandakan bahwa membran sel telah lysis. Sedangkan solution III
berguna untuk neutralization, yang di situ dapat kita liat membran-membran yang telah lysis
menggumpal dan menyatu. Nah, maka dari itu kita perlu sentrifuge untuk mengendapkan membran-
membran yang lysis, sehingga yang kita ambil hanya supernatan (larutan bening ~ berisi DNA).
Setelahnya kita mendapatkan larutan bening itu, treatment dengan PCI (phenol : chloroform :
isoamylalcohol), yang berfungsi untuk menghilangkan komponen-komponen lain dalam sel,
misalnya protein. Karena target kita adalah mendapatkan DNA murni. Dan kita pun treatment
dengan ethanol 100% dan NaAc (buffer). karena DNA ini tidak larut dalam ethanol, maka dengan
pemberian ethanol kita akan melihat DNA di situ. NaAc sebagai garam/buffer berfungsi untuk
membantu pengendapan. Sehingga proses ini kita dapat namakan ethanol presipitasi, yaitu
penggendapan DNA dengan pemberian ethanol. Selain itu untuk membantu pengendapan, kita
inkubasi di -20 derajat sekitar 1 jam, kemudian setelahnya sentrifuge dan washing dengan ethanol
70%, dry up dan pemberian TE. Pada dry up ini DNA harus benar-benar bersih dari ethanol, karena
jika tidak bersih dari ethanol maka DNA tidak akan mau larut.
Setelahnya kita lakukan purifikasi. Purifikasi di sini bertujuan agar kita mendapatkan DNA yang
benar-benar murni, tidak terkontaminasi dengan RNA. Bisa kita lihat pada step ini kita treatment
dengan pemberian RNAse, supaya RNA yang terkontaminasi bisa hilang.
http://biowidhi.wordpress.com/2009/11/29/prinsip-dasar-isolasi-plasmid/

Isolasi Plasmid dari Bakteri E.coli

Isolasi plasmid dari bakteri E.coli biasanya disebut dengan istilah Miniprep, kependekan dari Mini-
Preparation. Sesuai dengan istilahnya, pekerjaan ini tidak banyak memakan waktu dan tidak pula
berat untuk dilakukan. Apalagi sekarang sudah ada Miniprep Kit, yang hanya butuh kurang dari 30
menit untuk miniprep. Namun kali ini kita coba yang Miniprep manual aja. Alasannya, memakai kit
kadang-kadang bukan yang terbaik, dan miniprep manual merupakan teknik paling dasar dan
murah.
Miniprep merupakan pekerjaan lanjutan dari Transformasi yang dibahas pada tulisan terdahulu. Ada
beberapa larutan (solution) yang harus disiapkan sebelum melakukan miniprep, yaitu Solution I (50
mM TRIS pH 8.0, 10 mM EDTA), II (200 mM NaOH, 1% w/v SDS), dan III (3 M potassium
acetate, pH 5.5). Siapkan juga PCI (25:24:1 Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol), Ethanol 100%
dan 70%.
Langkah-langkah melakukan miniprep sebagai berikut:
1. Sehari sebelumnya, pick up koloni yang berwarna putih dengan tusuk gigi ke dalam 3 ml LB
cair yang mengandung amphicillin, inkubasikan pada suhu 37 derajat celsius.
2. Taruh kultur ke dalam e-tube dan spin (sentrifus) selama 5 menit.
3. Buang supernatant, dan larutkan pellet dengan Solution I 100 ul, vortex selama 5 menit.
4. Tambahkan Solution II sebanyak 200 ul, goyangkan bolak-balik e-tube tersebut, jangan
divortex.
5. Tambahkan Solution III sebanyak 150 ul, goyangkan bolak-balik e-tube tersebut, jangan
divortex.
6. Centrifus dengan kecepatan tinggi (12.000) selama 10 menit, dan pindahkan supernatant ke
e-tube baru.
7. Tambahkan 400 ul larutan PCI, dan vortex selama 5 menit.
8. Centrifus dengan kecepatan tinggi (12.000) selama 10 menit, dan pindahkan larutan bagian
atas (bening) ke e-tube baru.
9. Tambahkan Ethanol 100% sebanyak 900 ul (2.5 kali volume).
10. Simpan pada -20 derajat celcius selama 30 menit.
11. Centrifus dengan kecepatan tinggi (12.000) selama 15 menit pada suhu 4 derajat
celcius, dan buang supernatant. Setelah tahap ini, plasmid DNA nampak sebagai pellet yang
berwarna putih.
12. Tambahkan Ethanol 70% sebanyak 900 ul, dan sentrifus kembali selama 5 menit, dan
buang supernatant.
13. Keringkan dengan cara meletakkan e-tube terbuka yang mengandung DNApada
mesin vacuum selama 5 menit. Atau bisa juga dengan cara kering-anginkan selama 1 jam.
14. Larutkan dengan dengan air steril 30-60 ul.
http://biotektanaman.wordpress.com/2009/06/27/isolasi-plasmid-dari-bakteri-e-coli/