Uji Aktivitas Protein Bueh Paria (Momordica charantia) (4. Kurniawati et al.) UJI AKTIVITAS PROTEIN BUAH PARIA (Momordica charantia L.) DENGAN MENGGUNAKAN UJI KEMATIAN LARVA oe DAN ALUR SEL KANKER IN VITRO’ (Protein Activity Test of Bitter Guard Fruit (Momordica charantia L.) by Using Brine Shrimp Lethality Test and In Vitro Cancer Cell Lines) Ani Kurniawati, Sugeng Sudiatso”, Latifah K. Darusman”, dan Said Harran” ABSTRACT The research was conducted to study protein activity of ripe and unripe bitter guard fruit (Momordicaea charantia L.) from its several cultivars. The brine Shrimp mortality test and cancer cell lines were used as technique to detect the protein activity. Both ripe and unripe fruits of all the cultivars had biological activity with LCs under 100 pg/ml. The level of fruit age, cultivar, and their interaction affected the proliferation inhibition index of cell lines. The unripe fruit of bitter guard 'Giok’ showed the highest inhibition of proliferation L929 cancer cell line, 26.19%. While ripe fruit of bitter guards ‘Hijau’ showed the highest inhibition of proliferation KR&4 cell line, 37.67%. All fraction indicated inhibition of proliferation activity L 929 cell line, but KR4 cell line could be inhibited by fraction A, B, C, D, and F. The inhibition of 400 g/ml protein extract was 15.97% forL929 and 21.96% for KR4. Key words: protein activity, bitter guard fruit, shrimp lethality, cancer cell PENDAHULUAN Umumnya sayuran selalu ada dalam menu konsumsi masyarakat Indonesia. Sayuran dapat diartikan sebagai produk atau komoditi yang berupa tanaman atau bagian yang sukulen dari suatu tanaman, yang dikonsumsi sebagai pelengkap makanan pokok. Pada awalnya nilai nutrisi sayuran terutama diperhitungkan dari kandungan vitamin dan minerainya. Akhir-akhir ini sebagian masyarakat mulai memperhitungkan kandungan non-gizi yang bermanfaat dalam pemeliharaan kesehatan, di samping komponen gizinya. Beberapa penelitian membuktikan bahwa dalam bahan pangan terkandung senyawa kimia yang dapat berfungsi sebagai chemoprevention terhadap kanker (Block et al, dalam Fahey and Talalay, 1995). Dilaporkan pula bahwa konsumi sayuran buah yang tinggi berasosisi dengan pengurangan resiko terserang kanker (Graham, 1996). Di Amerika, penelitian terhadap spesies Cruciferae sebagai chemoprevention (terhadap kanker, terutama brokoli, telah meningkatkan secara drastis permintaan sayuran ini di pasaran Indonesia mempunyai keanekaragaman kultivar sayuran sehingga berpotensi mengembangkan pangan kesehatan. Bila usaha ini berhasil, akan memberikan nilai tambah terhadap sayuran tertentu dan sekaligus dapat meningkatkan derajat kesehatan penduduknya. Penelitian ini semakin strategis untuk dilakukan bila melihat perubahan pola penyakit di Indonesia. Penyakit infeksi yang merupakan masalah utama makin » 2} Bagian dari tesis penulis pertama, Program Studi Agronomi, Program Pascasarjana IPB Berturut-turut adalah Ketua dan Anggota Komisi Pembimbing 113Forum Pascasarjana Vol. 26 No. 2 April 2003:113-121 berkurang seiring dengan kemajuan ekonomi yang memungkinkan pencegahan dan pengobatan yang lebih intensif. Sebaliknya penyakit degeneratif dan kanker semakin menonjol (Tjahjono, 1999). Walaupun penyebab pasti belum diketahui, telah teridentifikasi faktor resiko berbagai kultivar kanker, yaitu faktor keturunan, lingkungan hidup, dan gaya hidup (Braunstein, 1981). Pengobatan terhadap penyakit ini umumnya mahal dan beresiko relatif besar sehingga diperlukan cara- cara lain untuk mencegah atau mengobatinya. Paria (Momordica charantia L.) adalah salah satu sayuran yang termasuk dalam famili Cucurbitaceae. Selain sebagai sayuran, sebagian masyarakat memanfaatkan untuk pengobatan berbagai jenis penyakit. Di Amerika, jus dari buah paria segar banyak dimanfaatkan untuk terapi penderita HIV. Dari beberapa penelitian telah berhasil diisolasi suatu protein aktif dari biji paria yang berfungsi sebagai inhibitor sintesis protein (MAP 30). Kelompok proiein ini disebut RIP atau ribosom inactivating protein (Minami et al., 1992). RIP juga dilaporkan terdapat pada anggota famili Cucurbitaceae lainnya, yaitu Luffa cylindrica dan Trichosantes kirilowii (Kondoe et al., 1995; di Topi et a/., 1992). RIP merupakan protein yang dapat dimanfaatkan baik dalam bidang pertanian maupun kesehatan. Lin Huang et al., 1999 melaporkan bahwa MAP 30 yang diisolasi dari biji paria adalah suatu protein bioaktif yang dapat melawan sel tumor. Indonesia mempunyai banyak kultivar paria, tetapi belum ada klasifikasi yang jelas. Secara tradisi, masyarakat mengelompokkan paria berdasarkan warna buah. Demikian juga klasifikasi menurut Ochse dan Vander Brink (1932) yang mengelompokkan paria di Indonesia menjadi empat kultivar berdasarkan warna buahnya. Selain keempat kultivar tersebut dikenal pula paria hibrida, baik produk lokal maupun impor, yang mempunyai keunggulan dan banyak dibudidayakan petani serta digemari masyarakat. Dalam proses mengisolasi bioaktif diperiukan bioassay untuk mengetahui efek farmakologinya. Kombinasi bioassay uji kematian larva udang (brine shrimp lethality test, BSL) dan uji dengan sel kanker secara in vitro telah banyak digunakan untuk memperoleh senyawa antikanker (Oberlies et a/., 1998). Dengan berbagai manfaat tersebut, perlu dilakukan penelitian untuk mempelajari protein bioaktif buah paria dari kultivar paria yang ada di Indonesia dengan penelitian ini diharapkan dapat meningkatkan nilai suatu komoditi sayuran. Di samping itu, akan diproduksi dalam skala luas, akan semakin banyak kultivar apabila ternyata terdapat kendala pada salah satu pilihan tersebut. Penelitian ini bertujuan mempelajari aktivitas ekstraks protein dari beberapa kultivar paria menggunakan uji kematian larva udang dan uji sel kanker secara in vitro. METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pusat Studi Pemuliaan Tanaman, Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian, dan Laboratorium Biokimia, FMIPA, untuk ekstraksi protein dan uji BSL; Laboratorium Immunology, Naval Army Medicine Research Unit-2 (NAMRU-2), Jakarta untuk uji sitotoksisitas dengan alur set kanker. Penelitian dimulai bulan Januari 1999 hingga Mei 2001. Buah paria yang digunakan untuk sampel berasal dan petani di desa Bantar Kambing, Kabupaten Bogor. 114Uji Axtivitas Protein Buah Paria (Momordica charantia) (A. Kuriawati et al.) Bahan dan Alat Bahan tanaman yang digunakan adalah daging buah paria muda dan matang dari beberapa kultivar paria yaitu paria hijau, paria putih, paria kotok, dan paria giok. Bahan yang digunakan untuk ekstraksi adalah bahan kimia seperti pada prosedur isolasi Lee Huang dalam Gunawan (1998) dengan beberapa modifikasi (Gambar 1). Alat yang digunakan adalah pipet, blender, wadah gelas, sentrifus, Stirer, ruang dingin, dan selopan. 1, FRAKSI AMONIUM SULFAT 1. FRAKSI AMONIUM SULFAT + Sampel dinaluskan = Ekstrak protein fraksi + 7 ae amonim sulfa pHse Naclo.15M + NasPOs Sentiis 10.000 rpm 30 menit, 4° C Kolom: Panjang 20 om, 2 1.5m sephadeks G-75 ‘Supematen + 80% (NH4),S04 O00 Sentritus 10.000 rpm = Spektrofotometer UV, 4.280 nm 30 menit, 4° C © Kelompok traksi = Pelt | 3 Pas © Uji sitotoksisitas : NaSPO4 SomM + Indeks penghambatan proliferas! (%) = Diaisis ‘© Senitritus 10.000 rpm 30 mentt, 4° © Freeze ner * Rendemen protein (© Uj kematian larva udang: © Ley Gambar 1. Bagan alur penelitian Bahan untuk kultur se! dan uji proliferasi adalah alur sel kanker L929 dan KR4, media media tumbuh dan media pencuci sel, MTT, dan isopropanol (Freshney, 1994). Peralatan yang digunakan adalah alat-alat steril untuk menumbunkan sel dan uji anti proliferasi, serta MTT render. Metode Buah paria diekstrak sesuai prosedur pada Gambar 1. Pada fraksi amonium sulfat dilakukan uji brimp shrimp lethalitykematian larva udang 15Forum Pascasarjana Vol. 26 No. 2 April 2003:113-121 (Anderson et al., 1991). Konsentrasi uji adalah 0, 10, 100, dan 1000 pg/ml, dengan tiga ulangan. Data yang dihasilkan dianalisis menggunakan probit (Finney) untuk menentukan nilai LCs. Ekstrak dengan nilai LCso lebih kecil dari 100 pg/ml, difraksinasi dengan kolom sefadeks G-75, Pada fraksi tersebut diuji aktivitasnya menggunakan dua alur sel kanker L929 dan KR4. Konsentrasi uji ekstrak protein adalah 0, 100, 200, dan 400 pg/ml, dengan tiga ulangan. Perhitungan sel menggunakan metode MTT. Respons yang diamati adalah indeks penghambatan proliferasi (IP). HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi Protein Buah Paria Dari hasil ekstraksi didapatkan rendemen protein daging buah paria pada fraksi amonium sulfat didasarkan bobot 100 g daging buah basah. (Tabel 1) mem terlihat bahwa paria giok mempunyai rendemen protein yang tertinggi jika dibandingkan dengan kultivar lainnya baik saat masih muda (0.18 %) maupun matang (0.21 %). Paria kotok muda mempunyai rendemen protein terkecil (0.09%). Semua kultivar paria matang mempunyai rendemen relatif lebih besar jika dibandingkan dengan saat muda. Tabel 1. Rendemen protein buah paria pada fraksi amonium sulfat Kultivar paria___‘Tingkatkematangan _Rendemen (%) Nilai LCso (ug/ml) Paria hijau Muda 0.17 40.22 Matang 0.14 18.23 Paria putih Muda 0.12 15.36 Matang 0.13 13.48 Paria kotok Muda 0.09 25.75 Matang 0.12 32.94 Paria giok Muda 0.18 1.83 Matang 0.21 38.01 Hasil larva udang menunjukkan bahwa ekstrak protein dari semua kultivar paria baik pada saat muda maupun matang mempunyai aktivitas yang tinggi, di bawah 100 g/ml (Tabel 1). Umumnya aktivitas ekstrak protein paria muda lebih besar daripada paria matang, kecuali untuk paria hijau. Aktivitas dan paria giok muda lebih tinggi jika dibandingkan dengan lebih tua dari kultivar lainnya yang terlihat dari nilai LCs yang terkecil, 1.83 g/ml. Karena semua kultivar paria mempunyai nilai LCs) 100 pg/ml, dilanjutkan dengan fraksinasi menggunakan kolom sefadeks G-75. Sefadeks ini dapat melewatkan protein globular dengan bobot 3-80 kD. Hasil fraksinasi protein dengan menggunakan sefadeks G-75 menghasilkan fraksi-fraksi yang selanjutnya dikelompokkan menjadi beberapa kelompok fraksi. Kelompok fraksi dari hasil pengelompokan ini dapat dilihat pada Tabel 2. Pola pemisahan tiap kultivar paria dapat dilihat pada Gambar 2 dan 3. Dari Gambar 2 dan 3 dapat disimpulkan bahwa pola pemisahan untuk semua kultivar baik muda maupun yang matang hampir sama. Fraksi dengan konsentrasi proten tinggi unumnya mengelompok di bagian kiri grafik. 116Uji Aktivitas Protein Buah Paria (Momordica charantia) (A. Kumiawati et al.) Tabel 2. Pengelompokan fraksi hasil fraksinasi ekstrak protein buah Kultivar paria Umur Kelompok fraksi Jumiah Paria hijau ‘Muda ACH -f3), B(f4-f0), C(10-113) 3 Matang _A(f1-f8), B(f9-15) 2 Paria putih Muda ACH #11,£14,f20), 6(72,116,119), 4 C({3,f6,f10,F15), D(f4-f5,17,18) Matang —_A(f1-f4), B(f5-f10), C(f11-f14) 3 Paria kotok Muda A(f1-4), B(P5), C(16-£10), D(t11-F15) 4 Matang _A(f1-f2), B(f3-f5), C(f6-f9), D(*10-116) 3 Paria giok Muda A(f1-12), B(f3-£4), C(f5), D(16-f8), EO 7 13), F(f14), G(115-116) Matang A(f1-43), B(f4-f9), C(f10-f19) leo w Absorban. Some N WN oboe NAR aNwe Keterangan: ee Giok muda —@— Hijau muda —a— Purih muda 4 Kotok muda 13 5 79 11 13 15 17 19 21 23 Fraksi Gambar 2. Pola pemisahan ekstrak protein beberapa kultivar paria muda dengar kolom sefadeks. 33 3 27 24 § 2.1 $18 Bas 12 ‘Keterangan: 09 —e— Giok matang 0.6 8 Hijau matang 7 —t— Putih matang 03 —¥— Kotok matang ° Gambar 3. Pola pemisanan ekstrak protein beberapa kultivar paria matang dengan kolom sefadeks. Dapat diasumsikan bahwa protein dengan bobot molekul besar berada pada fraksi-fraksi tersebut karena protein dengan bobot molekul besar akan dialirkan terlebih dulu jika dibandingkan dengan protein berbobot molekul sedang dan kecil. Urutan kelompok fraksi menunjukkan urutan kelompok protein dengan bobot molekul besar hingga kecil. 117Forum Pascasarjana Vol. 26 No, 2 April 2003:113-121 Uji Aktivitas dengan Sel Kanker Respons anti profilerasi terhadap sel kanker dari ekstrak protein diukur dengan indeks penghambatan proliferasi. Hasil uji sidik ragam terhadap peubah ini disajikan pada Tabel 3. Tabel 3. Rekapitulasi hasil sidik ragam terhadap peubah indeks penghambatan proliferasi. ‘Sumber keragaman Peubah indeks penghambatan Prilferasi Kultivar (J) r 7 Umur (U) 7 hf Interaksi J dan U i 7 Fraksi (F) . . Konsentrasi (K) . . Interaksi F dan K tn tn Keterangan: * Nyata pada taraf 5% Kultivar, umur, interaksi kultivar, dan umur buah mempengaruhi indeks penghambat proliferasi dari dua alur sel, yaitu KR4 dan L929. Fraksi dan konsentrasi juga mempengaruhi indeks penghambatan proliferasi tetapi interaksi keduanya tidak berpengaruh terhadap penghambatan proliferasi alur sel kanker. Paria giok muda mempunyai aktivitas penghambatan proliferasi terhadap sel kanker L929 tertinggi, sebesar 26.19% (Tabel 4). Aktivitas paria giok muda yang tertinggi, buah muda, ditunjukkan pula pada uji kematian larva udang. Paria hijau muda menunjukkan aktivitas terendah (9.4%), tetapi tidak berbeda nyata dengan paria kotok muda. Paria hijau matang tidak menunjukkan aktivitas penghambatan, tetapi meningkatkan proliferasi sel kanker L929, indeks penghambatan proliferasi negatif. Respons yang berbeda terhadap aktivitas protein hijau matang ditunjukkan oleh sel kanker KR4, dengan indeks penghambatan 37.67% (Tabel 5). Perbedaan respons kemungkinan besar disebabkan oleh perbedaan sensitivitas kedua sel tersebut. Hal yang terjadi pada aktivitas asam brionoloik yang diisolasi dari Trichosantes kirilowii var. japonica karena sitotoksitas bergantung pada tumor, yaitu spesies, organ, atau jaringan (Freshney, 1994; Kondo et al., 1995). Sel kanker KR4 adalah sel kanker manusia, sedangkan L929 adalah sel kanker tikus. Tabel 4. Interaksi kultivar dan umur paria terhadap indeks penghambatan proliferasi sei kanker L929 secara in vitri ‘Sumber keragaman Indeks penghambatan priliferasi (% Muda Matang Paria hijau 9.24be ~14,.25d Paria putih 17.68ba 4.29¢ Paria kotok 12.85bc 8.61c Paria giok 26.198 22.482 Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5% dengan uji DMRT. 118Uji Aktivitas Protein Buah Paria (Momordica charantia) (A. Kumiawati et al.) Tabel §. Interaksi kultivar dan umur paria terhadap indeks penghambatan proliferasi sel kanker KR4 secara in vitro Indeks penghambatan priliferasi (%) Sumber keragaman Muda Matang Paria hijau 26.04b 37.67a Paria putih 12.22¢ 21.76b Paria kotok 4.04d 25.95b Paria giok 12.59¢ 12.29 Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5% dengan uji DMRT. Indeks penghambatan proliferasi dari fraksi A, B, C, dan D terhadap sel 1929 tidak berbeda nyata (Tabel 6). Demikian juga respons yang ditunjukkan oleh oleh sel kanker KR4, tetapi nilai penghambatannya lebih tinggi jika dibandingkan dengan L929. Fraksi ini ini mengelompok relatif di sebelah kiri, kemungkinan protein yang terkandung di dalamnya adalah protein dengan bobot molekul relatif lebih besar dan merupakan fraksi-fraksi dengan konsentrasi protein relatif tinggi. Hasil penelitian terhadap protein dari Luffa cylindrica L. menunjukkan bahwa fraksi A, B, C, dan D memperlinatkan satu pita dengan elektroforesis gel SDS-PAGE. Fraksi E dan F terlihat dua pita warna, fraksi F dengan warna paling tebal. Fraksi D dan F sejajar dengan pita marker protein dengan bobot molekul 29 kD (Tumilisar, 2001). Dalam penelitian ini fraksi F merupakan puncak grafik dan relatif di tengah grafik pola pemisahan sehingga kemungkinan terdapat protein berbobot molekul sedang Tabel 6. Penghambatan proliferasi kelompok fraksi indeks penghambatan priliferasi (%) ‘Sumber keragaman Looe Kr4 A 6.86c 17.26a B 13.66ac 21.16a c 11.83be 23.50a D 7.22¢ 13.97a E 19.83ba -3.99b F 21.488 1.06b G 4.33c -3.19b Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5% dengan uji DMRT. Konsentrasi uji ekstrak protein dan 100 ug/m! hingga 400 ug/ml nyata Meningkatkan indeks penghambatan proliferasi terhadap sel kanker. Konsentrasi 400 pg/ml dapat menghambat proliferasi sel kanker L929 sebesar 15.97% dan sel kanker KR4 sebesar 21.96% (Tabel 7). Nilai penghambatan masih di bawah 50% populasi sel sehingga konsentrasi protein masih dapat ditingkatkan untuk mendapatkan indeks Penghambatan proliferasi yang lebih tinggi. Pada penelitian-penelitian untuk mendapatkan senyawa antitumor, nilai penghambatan 50% populasi lebih kecil dari 4 ug/ml dikatakan signifikan (He et al., 1997). 119Forum Pascasarjana Vol. 26 No. 2 April 2003:193-121 Tabel 7. Pengaruh konsentrasi terhadap indeks penghambatan proliferasi sel kanker secara in vitro. Konsentrasi (ug/ml) Indeks penghambatan priliferasi (%) L929 Kr4 100 4.45¢ 12.57¢ 200 11.73b 17.62b 400 15.974 21.96a Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5% dengan uji DMRT. KESIMPULAN ‘Semua ekstrak protein buah dari beberapa kultivar paria yang diuji baik muda maupun matang menunjukkan aktivitas pada uji kematian larva udang dengan nilai LCso di bawah 100 pg/ml. Paria giok muda dan matang menunjukkan aktivitas penghambatan proliferasi teninggi terhadap sel L929, yaitu 26.19% dan 22.48%. Paria hijau muda dan matang menunjukkan aktivitas penghambatan tertinggi terhadap sel kanker KR4 dengan nilai 26.04% dan 37.67%. Semua kelompok fraksi menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap sel kanker L929 dan KR4, kecuali untuk fraksi E dan F, dengan tingkat penghambatan yang beragam. Konsentrasi uji ekstrak protein hingga 400 ug/ml mampu menghambat proliferasi hingga 15.97% untuk sel L929 dan 21.96% untuk KR4. DAFTAR PUSTAKA Anderson, J.E., Goetz, C.M., Mclaughlin, J.L., and Suffnes, M. 1991. A blind comparition of simple bench top bioassay and human tumor cell cytotoxities as anti tumor prescreen. Phytochemicae Analysis 2:107-111. Braunstain, H. 1987. Pathology (Second Edition). Missouri: Mosby Company. Di Toppi, L.S., Vinni, Properzi, P., Luigi, G., and Sppano, L. 1996. Production of Ribosome-inactivating protein from hairy roots cultures of Luffa cylindrica (L) Roem. Plant Cell Report 15:910-913. Fahey, J.W. and Tallalay, P. 1995. The Role of Crucifers in Cancer Chemoprotection. David and Hector (ed.). Phytochemicall and Health Proceedings Tenth Annual Penn. State Symposium 1 Plant Physiology. Freshney, R.1. 1994. Culture of Animal Cell: A Manual of Basic Technique (3°) New York: Jonh Willey and Sons Co. Gunawan, L.W. 1998. Screening for Stable Expression of Antiviral and Anticarcinogen Protein from /n Vitro Transforted Culture of Tropical Plants for Biomedical Uses. Proposal : Graduate Team Research Grant Batch IV. Graham, S. 1986. Epideomologic studies of diet and cancer. Proceedings of The Society for Experimental Biology and medicine (183) : 281-286.Uji Aktivites Protein Buah Paria (Momordica charantia) (A. Kumiawati et al.) He, K., Zeng, L., Shi, G., Geng-Xiah, John, F.K., and Jerry, L.M. 1997. Bioactive ‘compound from Taiwania cryptomenoides. J. Nat. Pro. 60:38-40. Kondo, T., Makoto, H., Hajime, M. and Yukio, O. 1995. Citotoxic activity of briomolic acid isolated from transformed hairy roosts of Trichosantes var. Joponica Biol. Pham. Bull. 18(5): 726-729. Lin Huang, P., Yongtao, S., Hao-Chi, Hsiang-Fu, Lee, P., and Lee-Huang, S. 1999. Proteolytic Fragments of Anti-HIV and Anti-Tumor, Protein MAP 30 and GAP 31 are Biologically Active. Biochemical and Biophysical Research Communications 262(3). Abstract. Minami, Y., Yuko, M. and Gunki, F. 1992. Isolotion of two momordine, rhibosom- inactivating protein from the seed of bitter guard (M. charanti). Biosci. Biotechnol.Biochem. 56(9) 1470-1471 Oberlis, N.H., Lingling, L.R., Dohn, M.M., and Jerry, L.M. 1998. Cytotoxic and insecticidal constituents of unripe fruits of Persea americana. J. Nat. Prod. 61:781-785. Ochse.J.J., and Bakhuizen van Den Brink, R.C. 1932. Vegetable of The Dutch East indies. Dapartemen of Agricultural, Industry of the The Netherland East Indies. Archipel Drukkeri Buitenzorg-Java. Tjahjono. 1999. Deteksi dini kanker: peran pemeriksaan sitologik dan antisipasi era genom. Majalah Kedokteran indonesia 49(7):278-291 Tumilisar, C. 2001. Protein bioaktif asal kultur akar transgenik blustru (Luffa cylindrica (L.) Roem.) dan aktivitasnya dalam menghambat proliferasi sel tumor secara in vitro [makalah seminar]. Bogor: Institut Pertanian Bogor, Program Pascasarjana. 124