Técnicas para o Estudo do Sistema Nervoso ( mS ‘ss SKY Organizador: Gilberto F. Xavier Apoio: = Editora Pléiade SBNeCFicha de Catalogagao T2553. Técnicas para o estudo do sistema nervoso / organizador: Gilberto F. Xavier, - Sao Paulo : Pigiade, 1999. 238 p. 1, Sistema nervoso 2. Neurofisiologia I. Xavier, Gilberto Fernando CDU 611.8 (Bibliotecaria Responsdvel: Elenice Yamaguishi Madeira - CRB 8/5033)APRESENTAGAO O presente trabalho tem por objetivo oferecer @ comunidade cientifica brasileira da area de Neurociéncias e Comportamento uma breve descrigéo dos aspectos tedricos e praticos de algumas técnicas basicas, cujo uso na investigagao do sistema nervoso vem se tornando cada vez mais frequente. A preocupagéo maior do trabalho nao foi revisar extensamente a matéria. Pesquisadores que atuam na area de Neurociéncias e Comportamento foram convidados para escrever sobre técnicas de uso corrente em suas pesquisas, com énfase na descrigéo dos “segredos que fazem a diferenca”, i.e., dos detalhes nos procedimentos e manipulagées, identificados através do uso frequente da técnica, e que nem sempre sao descritos nos manuais técnicos. Caso esta experiéncia seja bem sucedida, este livro podera ser o primeiro de uma série. A idéia é que diversos pesquisadores de diferentes regides do pais partilhem sua experiéncia acumulada com o restante da comunidade cientifica. Comentarios e sugestées seréo muito benvindos. O intuito dessa empreitada nao poderia ser outro que o de incentivar a investigagao e o ensino em areas que tenham como denominador comum o estudo do sistema nervoso e do comportamento. Setembro de 1999 Gilberto F. XavierProdugao de Lesées Seletivas pela Aplicagao Multipla e Topica de Neurotoxinas Alexandre de Campos e Lotte Marianne Pires Renault Departamento de Fisiologia, Instituto de Biociéncias, Universidade de S&o Paulo Rua do Matao, trav.14, 321, 05508-900, Sao Paulo, SP E-Mail: alexcamp@usp.br ou lolren@yahoo.com Uma das abordagens mais utilizadas na neurociéncia, sem divida, é 0 método da ablacao, isto 6, a remocao (lesao, aspiragdo etc.) de diferentes regiées do sistema nervoso. Embora se deva ter extrema cauiela com inferéncias baseadas nas relagdes observadas entre manipulagdes experimeniais no sistema nervoso e alteragdes comportamentos subsequentes (ver por exemplo Webster, 1973), os dacdos obtidos através do método de les&o podem, em conjunio com outros resultados, ser de grande valia no processo de avaliagéo de correlatos andtomo-funcionais, pois permitem distinguir as fungdes que podem daquelas que nao podem ser desempenhadas na auséncia de determinada estrutura. Admite-se que o sistema nervoso seja estruturado de maneira modular. O conceito de mod dade foi inalmente proposio por Fodor (1983) e, em linhas erais, afirma que o sistema nervoso é composio por uma série de processadores de __ informacao, denominados médulos, que funcionam de maneira independente uns dos outros; porém, embora tais nédulos funcionem independeniements, ha integragao da atividade dos diversos modulos. Aléri de mais, esses s apreseniam especificidade de dominio, ou seja, 105médulos especificos processam informagdes de categorias especificas. Baseado nessas concepgdes estruturais, torna-se claro como o estudo dos prejuizos decorrentes de lesées em regides restritas do sistema nervoso pode contribuir para a compreensao de seus aspectos funcionais. Estando uma dada estrutura relacionada com o desempenho de um processamento de carater especifico (algoritmo), entéo a leséo dessa estrutura deve levar a um prejuizo comportamental em tarefas que requerem tal processamento. TECNICAS CONVENCIONAIS DE LESAO A precisao das intervengées nas estruturas do sistema nervoso varia em fungaéo de uma série de aspectos que caracterizam as técnicas empregadas. Assim, por exemplo, técnicas baseadas em eletrdlise, aspirac&o ou termocoagulagéo, além de se mostrarem imprecisas quanto a capacidade de circunscrigao da area alvo, produzem invariavelmente danos em fibras de passagem. Em conjunto, tais aspectos comprometem substancialmente a interpretagao dos dados experimentais provenientes da aplicagao dessas técnicas, pois, nesses casos, 0 prejuizo comportamental observado pode ser devido a les6es outras que nao a da area alvo (Jarrard, 1983). A técnica neurociruirgica descrita neste capitulo supera grande parte das limitagdes apresentadas por essas técnicas convencionais pois baseia-se na utilizagao de procedimentos estereotaxicos em conjunto com a aplicacéo multipla e tépica de neurotoxinas. O resultado 6 a possibilidade de se produzir lesdes restritas adeterminados tipos de células. 106ATLAS ESTEREOTAXICO No rato, os pontos de referéncia externos usados para se definir a localizagéo de nucleos e regides cerebrais tomam por base certas caracteristicas cranianas dos animais, como por exemplo os pontos de intersecgao entre os ossos. Trés sao os pontos de referéncia usados: bregma, lambda e linha interaural. Porém, sero descritos apenas os dois primeiros, pois estes representam mais de 80% dos pontos de referéncia usados (Paxinos e Watson, 1986). O bregma & definido como o ponto de intersecgéo entre as suturas coronal e sagital (Figura 1). Eventualmente as suturas nao se apresentam perfeitamente simétricas e o bregma fica deslocado; nestes casos 6 recomendado que se corrija a localizagao do bregma colocando-o no ponto de intersecgdo entre o prolongamento da sutura sagital e a linha ajustada da sutura coronal. O outro ponto de referéncia, o lambda, localiza-se no ponto de intersecéo entre as suturas sagital e lambddica (Figura 1); todavia, em vista da grande variagaéo observada na posic¢do dessa intersegéo, alguns autores (e.g., Paxinos e Watson, 1986) sugerem que se defina a posigdo do lambda como 0 ponto de intersegao entre os prolongamentos da sutura sagital e da sutura lambdoica (Figura 1). 107Figura 1 - Desenho esquematico de um cranio de rato, mostrando as suturas e os pontos de referéncia mais usados para a realizagao de cirurgias estereotaxicas. Para a realizacao de lesdes por aplicagdo topica de neurotoxinas (técnica que sera tratada em detalhes posteriormente), deve-se inicialmente, com o auxilio de um atlas estereotaxico, determinar os niveis encefalicos nos quais essa esirutura aparece representada e em seguida definir um conjunto de coordenadas (antero-posterior, meso-lateral e dorso-ventral’) a ser usado para a realizaco da lesdo. Para a escolha desse conjunto de coordenadas (localizagaéo e quantidade dos pontos de injecao) trés fatores principais devem ser considerados: (1) 0 tamanho e forma da regiao a ser lesada, (2) a quantidade de toxina liberada em cada ponto e (3) o volume de dispersao da droga (que varia proporcionalmente a quantidade injetada). E sempre recomendavel a realizagao de alguns testes prévios (estudos piloto) para a definigao final do numero de pontos de injegéo, coordenadas e quantidade de droga injetada por ponto. E importante mencionar que 0 uso do atlas estereotaxico € recomendado para animais com peso variando entre 250 e 350 gramas. Fora destes limites, as coordenadas obtidas perdem sua precisao. 2 O marco zero para todas as coordenadas dorso-ventrais é sempre a superficie da dura-mater, pois assim evita-se a incorporagao de um componente que introduz grande 108Para facilitar a delimitagao da abertura craniana necessaria para abranger todos os pontos de injecao, pode-se confeccionar uma “mascara” que sera colocada sobre o cranio no momento da perfuragao. Tal mascara é Util na medida em que contribui para a redugao das correg6es, durante a intervengdo cirlirgica, no tamanho da perfuragao craniana necessaria a realizacao de todas as injegdes. Colocando-se um pedaco de acetato sobre papel milimetrado, marca-se uma posigao arbitraria como sendo o bregma e, a partir deste, ¢ utilizando o papel imilimetrado, demarca-se os pontos onde incidem as coordenadas de injegdo (Antero-posteriores, cruzadas com as meso-laterais); a menor area que inclui todos os pontos € corlada; essa area, em relagdo ao bregma, deve ser perfurada na caixa craniana. APARELHO ESTEREOTAXICO O aparelho estereotaxico (Figura 2) @ uma estrutura metalica composta, basicamente, por (1) fixador de cabega - conjunto formado por duas barras intra- auriculares e uma barra dos incisivos, cuja fungdo é imobilizar a cabega do animal, (2) torre estereotaxica - mecanismo cuja fungao € possibilitar 0 deslocamento preciso de artefatos (micropipetas, cAnulas, eletrodos etc) nos trés eixos ortogonais do espaco, posicionando- os nas coordenadas desejadas (a precisaéo desse mecanismo é da ordem de décimos de milimetro), e (3) suporte para microseringas - mecanismo que permite acoplar e operar microseringas de modo a produzir injegées lentas e precisas. A fixagao do animal no aparelho estereotaxico se inicia com o posicionamento das barras de orelha. Esta siapa é bastante delicada, pois o ponto correto de variabilidade na precisao das intervengées estereotaxicas que 6 @ espessura dos ossos que formam o cranio dos animais. 109